La creazione di ambienti definiti gassosi Per studiare gli effetti dell'ipossia sulla C. elegans

Lo scopo del seguente esperimento è quello di allestire e mantenere una camera di ipossia utilizzando un metodo a flusso continuo. Ciò si ottiene ottenendo e fabbricando i tubi, i matracci e le camere necessari per la procedura. In un secondo momento, collegare la bombola di ossigeno e selezionare la portata per creare il livello di ipossia desiderato.

Idratare il gas facendolo passare attraverso un pallone a bolle riempito di acqua deionizzata. Collegare il gas idrato alla camera di ipossia e posizionare i campioni di prova nella camera per esporli a condizioni di ipossia. Si ottengono risultati che mostrano la letalità embrionale Hi F1 dipendente in ipossia sulla base dell'osservazione della vitalità fino all'età adulta.

Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come le scatole a guanti, è che è facile ed economica da fabbricare in laboratorio e fornisce una concentrazione accurata e riproducibile di gas nella camera ambientale. Sebbene questo metodo fornisca informazioni sulla risposta ipossica nel nematode C elegance, può anche essere adattato ad altri sistemi, inclusi organismi modello più grandi e colture cellulari. Inoltre, può essere utilizzato per studiare altri gas, tra cui l'anidride carbonica e l'idrogeno solforato.

Questo protocollo dimostra come costruire una camera per l'ipossia. Il gas viene immagazzinato in serbatoi di gas compresso con concentrazioni di ossigeno definite ed è collegato un regolatore a due stadi. Il gas entra nella parte inferiore del tubo di flusso, uscendo dalla parte superiore alla portata corretta.

Il gas fluisce quindi nel pallone a bolle che idrata il gas. L'idrogas passa quindi nella camera di ipossia alla valvola di afflusso, esponendo i campioni all'ipossia. Il gas infine sfocia nella stanza attraverso un foro di scarico praticato nella camera.

Una capsula di cristallizzazione in Pyrex o in una scatola a freccia può essere utilizzata come corpo della camera ambientale. Il volume del contenitore deve essere ridotto al minimo e il materiale deve essere impermeabile ai gas. Praticare un foro su un lato del contenitore con una punta in carbonio o diamante, forare e montare con un raccordo portagomma in plastica.

Mescolare la resina epossidica prima dell'applicazione sulla scatola e sul raccordo. Ripetere quindi la stessa procedura sul lato opposto del contenitore con il secondo foro sfalsato dal primo. Per aumentare la miscelazione turbolenta, utilizzare un tubo di FEP o nylon con diametro esterno di un ottavo di pollice per collegare i serbatoi di gas compresso a un dispositivo di controllo del flusso, come un regolatore di flusso di massa o un misuratore a rotore.

I serbatoi di gas devono avere concentrazioni di ossigeno definite bilanciate con azoto che siano standard certificati per il contenuto di ossigeno o per condizioni anossiche. L'azoto puro utilizza un regolatore a due stadi con il secondo stadio impostato alla pressione desiderata. Vedere le istruzioni nel protocollo scritto per la selezione di una portata appropriata.

Quindi collegare il tubo dal regolatore a due stadi al tubo di flusso che controlla la portata del gas che entra nella camera. Le uscite del tubo di flusso sono collegate a una bombola di lavaggio del gas con bombola fritta contenente acqua distillata. Quindi collegare il tubo sull'altro lato della bottiglia di lavaggio a uno dei raccordi sulla camera ambientale.

Questo idraterà il gas che entra nella camera ambientale. Utilizzare grasso sottovuoto per sigillare la camera. Quindi posizionare i pesi sul coperchio della camera per garantire una chiusura ermetica.

Testare la tenuta tenendo una piccola quantità d'acqua nel palmo di una mano guantata sul raccordo di scarico del gas sulla camera e controllando la presenza di bolle. In primo luogo, generare popolazioni sincronizzate di Elgan marino. Mettere da uno a 100 GR di adulti in una goccia di soluzione alcalina di candeggina sulla superficie di una piastra di crescita di nematodi senza semi.

Lasciare assorbire la soluzione di candeggina nella piastra dopo un periodo di incubazione di almeno otto ore. Trasferire le larve sincronizzate di L uno su una piastra seminata con batteri vivi OP 50. In alternativa, lasciare che gli adulti GRA depongano le uova sul piatto per due o tre ore per generare un gruppo di vermi che si svilupperanno in modo sincrono o raccogliere L quattro larve da una popolazione mista per raccogliere giovani embrioni.

Nella fase da due a quattro cellule, utilizzare una lama di rasoio per tritare gli adulti GR in un piccolo volume d'acqua e quindi trasferire gli embrioni mediante pipetta orale prima di trasferire i vermi sulla piastra per l'esposizione a condizioni di ipossia. Mettere un anello di 10 milligrammi per millilitro di acido palmitico in etanolo attorno al bordo delle piastre. Per evitare che i vermi fuoriescano dalla superficie della piastra di agar.

L'acido palmitico uscirà dalla soluzione. Quando l'etanolo evapora formando una barriera fisica per garantire l'uniformità, assicurarsi di sostituire l'acqua nella bottiglia di lavaggio del gas prima dell'esposizione nella camera ambientale. Dopo aver trasferito i vermi sulle piastre, sigillare le piastre nella camera ambientale, avviare il flusso di gas e mantenere l'esposizione per il tempo desiderato per il saggio.

Per la vitalità degli embrioni fino all'età adulta, lasciare che i vermi si sviluppino 48 ore dopo il ritorno all'aria ambiente, a quel punto dovrebbero essere. Le larve del quarto stadio o gli adulti di un giorno ottengono un punteggio per la vitalità fino all'età adulta. Per visualizzare l'esposizione ipossica dei vermi, trasferire i vermi su una goccia di M nove su un vetrino coprioggetti quadrato di 22 millimetri e capovolgerli su un tampone di 2% aros in M nove, se necessario.

25 millimolari di amol o 10 millimolari di azoturo di sodio possono essere usati come anestetico. In alternativa, dopo l'esposizione all'ipossia, la camera ambientale trasparente può essere posizionata direttamente sul tavolino di un endoscopio da dissezione. Vengono mostrate due visualizzazioni, una che include l'intera configurazione del flusso di gas.

L'altro con solo la camera sul tavolino del microscopio. Coltiva Bristol N due vermi su quattro placche di crescita alte 10 centimetri fino a quando la maggior parte dei vermi sono adulti GR. Lavare i vermi in una provetta conica da 15 millilitri con una soluzione di candeggina alcalina da uno a cinque e incubare a rotazione fino a quando i vermi iniziano a dissolversi.

Non più di cinque minuti. Lavare i vermi tre volte con M nove che girano verso il basso a 1, 500 volte G tra ogni lavaggio senza rompere la piastra. Gli embrioni sbiancati vengono sbiancati su 8 piastre NGM da 150 millimetri e lasciano che gli embrioni si sviluppino in larve L per circa 48 ore.

A 22 gradi Celsius, spostare le piastre nella camera ambientale ed esporle a condizioni ipossiche e anossiche per quattro ore o per la durata specificata dal disegno sperimentale. Per raccogliere rapidamente i campioni, rimuovere il coperchio della camera ipossica. Prelevare una piastra campione e richiudere il tempo della camera e registrare i passaggi.

Dopo aver rimosso i vermi dall'ipossia, l'intero processo dovrebbe richiedere meno di due minuti. Utilizzare acqua distillata per lavare i vermi su un filtro di nylon e poi versarli in un tubo conico da 15 millilitri etichettato contenente 100 microlitri di centrifuga SDS all'1%. I worm nella SDS in una centrifuga da tavolo sono 1.500 volte G per 15-20 secondi.

Con la pausa, utilizzare un aspirapolvere per rimuovere la maggior parte del supinato dal tubo, lasciando intatto il pellet di vite senza fine. Utilizzando una pipetta, trasferire il pellet di vite senza fine con un volume predeterminato di liquido in una provetta di microrifiuti da 1,5 etichettata. Se il campione deve essere utilizzato per la pagina SDS, questa provetta può contenere un volume uguale di due volte il colorante con caricamento di proteine, sigillare la provetta e immergerla in azoto liquido.

Ripetere l'operazione fino a quando tutti i campioni sono stati isolati. Seguire queste procedure per i campioni di controllo dell'aria domestica per ottenere la consistenza, i campioni possono essere conservati a meno 20 gradi Celsius. Questa cifra mostra la vitalità degli embrioni esposti a 1000 parti per milione di ossigeno, 5.000 parti per milione di ossigeno e la normossia a circa 210.000 parti per milione di ossigeno.

Gli embrioni sono esposti a ciascuna condizione per 24 ore in camere di ossigeno a flusso continuo. I vermi sono stati spostati in condizioni normossiche lasciate sviluppare fino all'età adulta per 48 ore, e poi valutati per la vitalità fino all'età adulta. Seguendo questa procedura, i campioni possono essere raccolti per la successiva analisi mediante Western blot QPCR o saggi fisiologici come la durata della vita o la produzione di progenie.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona idea di come allestire una camera di ipossia a flusso continuo nel tuo laboratorio.