L'analisi in vitro dei complessi CFTR PDZ-dipendenti macromolecolari di segnalazione

L'obiettivo generale di questa procedura è assemblare un complesso di segnalazione macromolecolare dipendente dal dominio PDZ del regolatore della conduttanza transmembranaria della fibrosi cistica, o CFTR, in vitro. Per fare ciò, le proteine di fusione ricombinanti marcate vengono espresse nei batteri e purificate. Successivamente, i lisati cellulari vengono ottenuti da colture che esprimono CFTR o proteine leganti CFTR.

Quindi, CFTR e le proteine di legame vengono combinati in vitro per assemblare il complesso segnale macromolecolare contenente CFTR. Viene quindi eseguita la blotting Western, che dimostra la formazione di complessi macromolecolari di CFTR e viene successivamente valutata mediante blotting Western. Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti è la possibilità di rilevare e visualizzare direttamente la formazione di un singolo complesso macromolecolare ad alto contenuto proteico contenente CFTR.

Pertanto, questo metodo può fornire informazioni sulla formazione del complesso macromolecolare contenente CT R. Può inoltre essere applicato nell'assemblaggio di complessi non proteici non coinvolti nel CFTR, come il complesso di segnalazione macromolecolare sex C due. Più recentemente, utilizzando questo stesso metodo, abbiamo dimostrato che il nostro chemorecettore CXCR due forma fisicamente un complesso proteico con l'effettore a valle.

PRC beta tre media il nervo selvatico uno nei neutrofili utilizzando la PCR. Amplificare il DNA che codifica gli ultimi 50-100 aminoacidi contenenti i motivi PDZ al termine C. Per il trasportatore CAMP, MRP quattro e il dominio PDZ uno del fattore regolatorio dell'antiporto sodio-idrogeno o N-H-E-R-F.

Successivamente, clonare i quattro prodotti PCR RP in PGE X quattro T uno per generare proteine di fusione GST e il dominio PDZ uno di N-H-E-R-F in PET 30. Per ottenere proteine di fusione hiss s, trasformare i batteri mediante shock termico. In mezzo SOC, in una ceppa di e coli carente di proteasi, coltivare la coltura tutta la notte a 37 gradi Celsius in un incubatore agitato in 50 millilitri di mezzo LB contenente antibiotici appropriati per il vettore.

Il giorno successivo diluire la coltura di uno a 10 e 500 millilitri di mezzo Luria berti, quindi incubare nuovamente la coltura sotto agitazione a 37 gradi Celsius per due ore. Indurre la trascrizione della proteina ricombinante con 0,5-1 millimolare di IPTG per quattro ore a 30 gradi Celsius.

Al termine dell'incubazione, trasferire le colture in provette da centrifuga da 250 millilitri e formare il pellet cellulare mediante centrifugazione a 8.000 ×g per 10 minuti a quattro gradi Celsius. Al termine della centrifugazione, eliminare il soprannatante e aggiungere 20 millilitri di tampone saccarosio contenente lisozima, 1 milligrammo per millilitro di Triton X-100 allo 0,2% e inibitori delle proteasi per lisare le cellule; quindi trasferire la sospensione batterica in una provetta da centrifuga pulita da 50 millilitri.

Mescolare su un agitatore rotatorio per 30 minuti a quattro gradi Celsius. Successivamente, centrifugare a 20.000 ×g per 30 minuti a quattro gradi Celsius. Dopo la centrifugazione, il soprannatante sarà limpido e un pellet insolubile di app sarà presente sul fondo del tubo.

Prelevare il soprannatante limpido in un nuovo tubo conico da 50 millilitri. Quindi aggiungere al soprannatante un millilitro della risina appropriata. Perle aerate sospese come sospensione al 50% in tampone di saccarosio contenente glutathione.

Le perle Aero devono essere utilizzate per le proteine di fusione GST e le perle Talon per le proteine di fusione His-S. Mescolare per quattro ore a quattro gradi Celsius su un agitatore rotatorio. Successivamente, centrifugare le perle a 800 ×g per due minuti.

Quindi lavarli mediante risospensione in 15 millilitri di PBS e mescolare su un agitatore rotante per due minuti. Infine, eliminare il soprannatante. Ripetere il passaggio per sei volte dopo il sesto lavaggio.

Per eluire la proteina dalle perle, aggiungere due millilitri del tampone di eluizione appropriato per ogni millilitro di perle e mescolare per 10 minuti a temperatura ambiente. Versare l'intera proteina eluita con le perle in una colonna e raccogliere il flusso in uscita come proteina eluita. Successivamente, trasferire la proteina UD in una membrana per dialisi.

Dializzare le proteine eluite contro due litri di PBS sotto agitazione a quattro gradi Celsius. Cambiare il PBS ogni quattro ore per quattro volte successive alla dialisi. Concentrare la proteina a 0,5-1 millilitri.

Utilizzando un filtro con cutoff di 10.000 megawatt. Aliquotare il campione in 200 microlitri ciascuno. Conservarne uno per l'analisi e gli altri a meno 80 gradi Celsius per la conservazione.

Determinare la concentrazione proteica mediante il metodo di Bradford. Valutare la qualità della proteina tramite elettroforesi SDS-PAGE utilizzando standard di BSAS. Se l'integrità della proteina non è soddisfacente, possono essere utilizzate procedure di purificazione secondarie come la filtrazione su gel o lo scambio ionico.

Le cellule HEK 293 che esprimono il CFTR wild type con marcatore flag devono essere coltivate come descritto nel documento allegato. Rimuovere il mezzo dalle cellule e lavare con PBS. Per lisare le cellule, aggiungere 500 microlitri di buffer di lisi per ogni piastra di coltura da 60 millimetri e agitare i lisati cellulari per 20 minuti a quattro gradi Celsius.

Trasferire i lisati in nuovi tubi da microcentrifuga. Successivamente, per rimuovere le proteine insolubili, centrifugare a 16.000 ×g per 15 minuti a quattro gradi Celsius e raccogliere i soprannatanti. Determinare la concentrazione proteica mediante saggio di Bradford per assemblare in vitro i complessi macromolecolari contenenti CFTR.

Cominciare mescolando 20 microgrammi di proteina fusionale purificata G-S-T-M-R-P quattro contenente gli ultimi 50 aminoacidi della coda C-terminale e quantità crescenti comprese tra zero e 40 microgrammi di proteina fusionale purificata hiss S PD zk uno in 200 microlitri di buffer di lisi all'interno di un tubo microcentrifuga da 1,5 millilitri. Mescolare le due proteine su un agitatore rotatorio a 22 gradi Celsius per uno-due ore. Successivamente, aggiungere 20 microlitri di un sospensione al 50% di perle di glutathione alla miscela proteica e continuare a mescolare per un'ulteriore ora.

Questo passaggio è noto anche come legame a coppie, nel quale G-S-T-M-R-P quattro CT 50 si lega a SPD zk uno. Nel frattempo, preparare i lisati cellulari di HEK 293 che esprimono in modo sovraespresso il CFTR di tipo selvatico marcato con flag, come descritto nella sezione precedente del video, dopo il passaggio di legame a coppie. Lavare il complesso due volte con tampone di lisi, centrifugando a 800 ×g per un minuto per ogni lavaggio ed aspirando con attenzione il soprannatante dopo ciascun lavaggio.

Attenzione a non aspirare le perle dal fondo. Aggiungere i lisati cellulari HT K 2 93 alle perle e mescolare delicatamente su un agitatore rotatorio a quattro gradi Celsius per tre ore o durante la notte dopo l'incubazione. Lavare le perle tre volte con tampone di lisi, centrifugando dopo ogni lavaggio come in precedenza, dopo l'ultimo lavaggio.

Per eluire le proteine, aggiungere 30 microlitri di buffer campione 5x e incubare nel bagnomaria a 37 gradi Celsius per 10-15 minuti. Successivamente, centrifugare a 5.000 ×g per un minuto per precipitare le perle. Poi, caricare tutto l'eluito su un gel SDS-PAGE 4-15% ed eseguire la corsa a 200 volt fino al termine del gel. Successivamente, trasferire le bande proteiche sulla membrana PVDF per 1,5 ore a 60 volt utilizzando un apparato di trasferimento BioRad.

Al termine del trasferimento, bloccare la membrana in TBS tween contenente latte scremato al 5% per un'ora. Procedere con la tecnica del western blot come descritto nel documento allegato per visualizzare le proteine che interagiscono con CFTR. Il complesso macromolecolare di segnalazione contenente A-C-F-T-R è stato assemblato in vitro come descritto in questo video, come mostrato in questa rappresentazione schematica.

Un complesso macromolecolare formato tra i 50 aminoacidi terminali C-terminale di Mr.RRP quattro PDZK1 e CFTR completo per determinare la dipendenza dalla dose della formazione del complesso macromolecolare. Sono state incluse quantità crescenti della proteina intermedia PDZK1, come mostrato qui. Il complesso è aumentato in modo dipendente dalla dose, suggerendo che la proteina intermedia PDZK1 media l'interazione tra CFTR e Mr.Rrp4.

Quando si esegue questa procedura, è importante ricordare di non far bollire i campioni del complesso micro-molecolare FTR contenitore preparati per il western blotting, poiché l'aggregazione di FTR è un problema comune. Invece, i campioni devono essere riscaldati a 37 °C per 10-15 minuti prima di essere caricati sul gel, seguendo questa procedura. Altri metodi, come la co-immunoprecipitazione, possono essere eseguiti per valutare i complessi endogeni di CFTR in cellule come quelle delle vie aeree, le cellule epiteliali e le cellule epiteliali intestinali.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come assemblare in vitro un complesso di segnalazione macromolecolare CFDR dipendente da PTC.