C. elegans Monitoraggio e valutazione del comportamento

Fenotipizzazione. La locomozione di sea elegance è uno strumento importante nella scoperta di geni e neuroni coinvolti nel comportamento di sea elegance. Sea elegance esegue comportamenti locomotori stereotipati, come movimenti in avanti e all'indietro e vari tipi di svolte, modificando la propria forma. Per quantificare questi movimenti su lunghe distanze e con elevata risoluzione spaziale e temporale, abbiamo realizzato un sistema di tracciamento del verme per catturare il movimento di sea elegance mentre si sposta sulla superficie di una piastra in agar.

Abbiamo inoltre sviluppato un software per isolare e analizzare quantitativamente questi movimenti mediante programmi personalizzati scritti in LabVIEW e MATLAB. Una sfida comune a tutti i sistemi di tracciamento video è che generano una quantità enorme di dati altamente multidimensionali. Il nostro programma di elaborazione delle immagini e analisi dei dati affronta questa sfida riducendo le forme del verme a un insieme di componenti indipendenti, ricostruendo in modo esaustivo il comportamento del verme come funzione soltanto di tre o quattro dimensioni.

Una piastra di agar viene illuminata da una sorgente luminosa a fibra e ripresa con una fotocamera. Questo sistema è montato su un piano di traslazione XY. Il piano viene spostato mediante motori passo-passo standard, collegati a un controllore per motori passo-passo.

Il controller e la telecamera sono collegati al computer e controllati da programmi personalizzati scritti in LabVIEW. La telecamera acquisisce l'immagine della superficie di una piastra di agar e identifica oggetti scuri su uno sfondo chiaro. Un segno di calibrazione per il processo di calibrazione automatica viene effettuato pungendo la superficie dell'agar.

Con un'apposita punta per prelievi, si regola la qualità dell'immagine in modo che il programma informatico possa quantificare gli oggetti in tempo reale. Il guadagno, la luminosità e la velocità dell'otturatore della telecamera possono essere regolati per ottenere un oggetto scuro su uno sfondo chiaro. È possibile verificare l'immagine binaria filtrata, utilizzata dal programma di tracciamento.

Il software dispone di una funzione di auto-calibrazione che calcola la matrice di calibrazione spostando un oggetto di prova su una distanza fissa. Le distanze in pixel vengono calibrate rispetto ai passi compiuti dal motore passo-passo mediante la matrice di calibrazione.

Dopo la calibrazione, il sistema è pronto all'uso e non necessita di essere ricaribrato a meno che non venga modificata l'ingrandimento o riposizionata la telecamera. Un anello di rame verrà utilizzato per delimitare i vermi e impedire che migrino verso il bordo della piastra. Riscaldare prima l'anello posizionandolo su un blocco riscaldante o equivalente.

L'anello deve essere riscaldato per circa un minuto. Posizionare l'anello su una nuova piastra di agar e premere leggermente per fissarlo nella superficie dell'agar. Inoltre, verrà utilizzata una piastra di agar contenente tampone NGM per lavare via i residui di cibo dai vermi allo stadio L4 e adulti giovani.

Dopo aver trasferito i vermi nel tampone NGM, lasciarli nuotare per alcuni minuti. Posizionare con attenzione uno dei vermi lavati sulla piastra di tracciamento vicino al centro dell'anello. Questa piastra verrà successivamente utilizzata per il tracciamento del verme.

Posizionare la piastra preparata sullo stage del worm tracker. Eseguire il programma LabVIEW e selezionare le opzioni desiderate, come la posizione delle immagini, i tipi di immagini, le misurazioni e le impostazioni della telecamera. Utilizzando il joystick, spostare il microscopio finché un'immagine del verme appare nel campo visivo sullo schermo del computer.

Premere quindi traccia per attivare il programma di tracciamento. Qui mostriamo un verme tracciato in tempo reale. Il programma informatico misura i movimenti di immagini filtrate in bianco e nero come mostrato e può effettuare misurazioni su questa immagine in tempo reale.

Dopo il tracciamento, è possibile ricostruire una traiettoria globale a partire dai movimenti del motore passo-passo, mentre i cambiamenti locali della forma del verme possono essere osservati in dettaglio. I vermi si muovono producendo movimenti ondulatori. Catturiamo questi movimenti mediante la creazione di uno scheletro del verme sotto forma di una singola curva centrale, descrivendo poi tale curva come un insieme di angoli.

Decomponiamo quindi gli scheletri nelle loro forme fondamentali, altrimenti note come autovettori. Con queste autofunzioni, possiamo ricostruire le forme del verme e quantificare i suoi movimenti. Utilizzando le prime due modalità, possiamo catturare specificamente la posizione di fase del ciclo ondulatorio del verme, come mostrato nel secondo pannello.

Il primo pannello mostra la distribuzione congiunta delle modalità uno e due, evidenziando un ciclo limite circolare. Il movimento di fase in una direzione corrisponde a un movimento in avanti, mentre il movimento di fase nell'altra direzione corrisponde a un movimento all'indietro. Pertanto, la velocità di fase corrisponde alla velocità del verme.

Nello spazio reale, la forte correlazione tra la fase e la velocità nel mondo reale è visibile nell'ultimo pannello. Utilizzando la velocità di fase derivata dalla modalità propria, possiamo rivelare alcuni dettagli sottili del comportamento di eleganza marina che verrebbero trascurati ad occhio nudo. Ad esempio, la distribuzione congiunta della velocità di fase e della fase indica chiaramente che i vermi abbandonano e assumono lo stato di avanzamento preferenzialmente a fasi specifiche del movimento.

Qui abbiamo dimostrato un sistema di tracciamento di facile utilizzo che registra immagini dettagliate del comportamento dei silicons mentre si muovono sulla superficie e sulle piastre ACA. La quantità di informazioni contenute in queste immagini è vasta e altamente multidimensionale, pertanto abbiamo anche sviluppato un metodo per ridurre la dimensionalità dei dati in quattro misure fondamentali. Queste misure sono di facile interpretazione rispetto al comportamento del verme.

Questo lavoro è stato sviluppato per misurare il comportamento dei vermi in condizioni di modificazioni minime, e il sistema può essere utilizzato anche per misurare l'attività neuronale mediante regioni marcate geneticamente e rivestite. L'intero sistema è flessibile nella progettazione e può essere impiegato con altri sistemi di strisciamento come Doof law, LOEs.