C. elegans Monitoraggio e valutazione del comportamento

La locomozione dell'eleganza del mare è uno strumento importante nella scoperta di geni e neuroni coinvolti nel comportamento dell'eleganza del mare. L'eleganza del mare subisce comportamenti locomotori stereotipati come movimenti in avanti e indietro e vari tipi di virate cambiando la loro forma. Per quantificare questi movimenti su lunghe distanze e ad alta risoluzione spaziale e temporale, abbiamo costruito un worm tracker per catturare il movimento dell'eleganza del mare mentre striscia sulla superficie di una piastra di agar.

Abbiamo anche sviluppato un software per isolare e analizzare quantitativamente questi movimenti utilizzando programmi personalizzati scritti in lab view e matlab. Una sfida di tutti i sistemi di tracciamento video è che generano un'enorme quantità di dati altamente dimensionali. Il nostro programma di elaborazione delle immagini e di analisi dei dati è dovuto a questa sfida: riducendo le forme dei vermi in un insieme di componenti indipendenti, abbiamo ricostruito in modo completo il comportamento dei vermi in funzione di sole tre o quattro dimensioni.

Una piastra di agar viene illuminata da una sorgente di luce in fibra e ripresa con una telecamera. Questo sistema è montato su uno stadio di traslazione XY. Lo stadio è mosso da motori passo-passo standard, che sono collegati a un controller per motori passo-passo.

Il controller e la telecamera sono collegati al computer e controllati da programmi personalizzati scritti in vista di laboratorio. La fotocamera riprende la superficie di una lastra di agar e identifica gli oggetti scuri su uno sfondo chiaro. Un segno di calibrazione per il processo di calibrazione automatica viene eseguito colpendo la superficie dell'agar.

Con un worm pick, la qualità dell'immagine viene regolata in modo che il programma del computer possa quantificare gli oggetti in tempo reale. Il guadagno, la luminosità e la velocità dell'otturatore della fotocamera possono essere regolati per fornire un oggetto scuro su uno sfondo bianco. L'immagine binaria filtrata, utilizzata dal programma di tracciamento, può essere controllata.

Il software dispone di una funzione di calibrazione automatica che calcola la matrice di calibrazione spostando un oggetto di prova. Una distanza fissa. Le distanze in pixel sono calibrate in base ai passi effettuati dal motore passo-passo dalla matrice di calibrazione.

Dopo la calibrazione, il sistema è pronto per l'uso e non ha bisogno di essere ricalibrato a meno che l'ingrandimento non venga modificato o se la fotocamera venga riposizionata. Un anello di rame verrà utilizzato per recintare i vermi e impedire loro di migrare verso il bordo della piastra. Riscalda prima l'anello posizionandolo su un blocco termico o equivalente.

L'anello deve essere riscaldato per circa un minuto. Posizionare l'anello su una piastra di agar fresca e premere leggermente verso il basso per incorporarlo nella superficie dell'agar. E una piastra di agar riempita con tampone NGM verrà utilizzata per lavare i vermi L 4 e i giovani adulti dai residui di cibo.

Dopo aver raccolto i vermi nel tampone NGM, lasciali nuotare per alcuni minuti. Posizionare con cautela uno dei vermi lavati sulla piastra di tracciamento vicino al centro dell'anello. Questa piastra verrà successivamente utilizzata per il tracker a vite senza fine.

Posizionare la piastra preparata sul tavolino del worm tracker. Eseguire il programma Lab View e selezionare le opzioni necessarie, ad esempio la posizione delle immagini, i tipi di immagini, le misurazioni e le impostazioni della fotocamera. Utilizzando il joystick, spostare il microscopio fino a quando un'immagine del verme non si trova nel campo visivo sullo schermo del computer.

Quindi premere traccia per attivare il programma di tracciamento. Qui mostriamo un worm tracciato in tempo reale. Il programma per computer misura i movimenti delle immagini binarie filtrate come mostrato e può effettuare misurazioni di questa immagine in tempo reale.

Dopo l'inseguimento, è possibile effettuare una ricostruzione della traiettoria globale dai movimenti del motore passo-passo, mentre i cambiamenti di forma locali del verme possono essere visti in dettaglio. I vermi strisciano facendo movimenti ondulatori. Catturiamo questi movimenti scheletrizzando il verme in un'unica curva centrale e quindi descrivendo questa curva come un insieme di angoli.

Quindi scomponiamo gli scheletri nelle loro forme fondamentali, altrimenti note come autovettori. Con questi modi autogeni, possiamo ricostruire le forme del verme e quantificare i movimenti del verme. Utilizzando le prime due modalità, possiamo catturare in modo specifico la posizione di fase del ciclo ondulatorio del verme, come si vede nel secondo pannello.

Il primo pannello mostra la distribuzione congiunta dei modi uno e due, evidenziando un ciclo limite circolare. Il movimento di fase in una direzione corrisponde al movimento in avanti e il movimento di fase nell'altra direzione corrisponde al movimento all'indietro. Pertanto, la velocità di fase corrisponde alla velocità del verme.

Nello spazio reale, la forte correlazione tra la fase e la velocità del mondo reale può essere vista nell'ultimo pannello. Utilizzando la velocità di fase derivata dalla modalità Eigen, possiamo scoprire alcuni dettagli sottili del comportamento dell'eleganza del mare che sfuggirebbero a occhio nudo. Ad esempio, la distribuzione congiunta della velocità di fase e della fase indica chiaramente che i vermi escono ed entrano nello stato in avanti preferenzialmente in specifiche fasi di movimento.

Qui abbiamo dimostrato un sistema di tracciamento facile da usare che registra immagini dettagliate del comportamento del silicio come un strisciare sulla superficie e sulle piastre ACA. La quantità di informazioni contenute in queste immagini è vasta e altamente dimensionale, e quindi abbiamo anche creato un metodo per ridurre la dimensionalità dei dati nelle quattro misure fondamentali. Queste misure sono facili da interpretare per quanto riguarda il comportamento del verme.

Questo lavoro è stato generato per misurare i vermi comportamentali a modifiche inferiori e il sistema può anche essere utilizzato per misurare l'attività neuronale utilizzando geneticamente la generazione e le regioni rivestite. Il sistema nel suo complesso ha un design flessibile e può essere utilizzato con altri sistemi di scansione come Doof law, LOE.