Modellazione Colite-Associated Cancro con azoxymethane (OMA) e sodio solfato destrano (DSS)

Al giorno zero, a Myer viene iniettato azossimetano o un OM; la settimana successiva viene somministrato. L'acqua da bere viene sostituita con una soluzione contenente sodio dextran solfato o DSS. Alla terza settimana, ai topi viene somministrata acqua per le due settimane successive.

Questo ciclo idrico con DSS viene ripetuto altre due volte. Dopo il secondo ciclo con DSS, i topi possono essere valutati per la presenza di tumori mediante endoscopia speculare.

Dopo la settimana 10, i topi vengono sacrificati e i colon sono prelevati. I colon vengono lavati e aperti longitudinalmente. I colon vengono valutati per dimensione del tumore e numero di tumori.

Una sezione longitudinale del colon divisa in terzi può essere inclusa e sottoposta ad analisi istologica. Mediante microscopia ottica, i tumori possono essere contati e classificati. Illustriamo un protocollo in cui viene somministrato l'agente genotossico a OM, seguito da tre cicli dell'agente pro-infiammatorio.

Il DSS genera rapidamente e in modo costante tumori del colon nei topi, con somiglianze morfologiche e molecolari con quelli osservati nel cancro associato alla colite umana. Etichettare singolarmente i topi con segni sulla coda o clip sulle orecchie al giorno zero, registrare il peso iniziale di ciascun topo in una tabella, quindi iniettare a ogni topo una soluzione di 10 milligrammi per chilogrammo di OM exercise. Fare attenzione durante la manipolazione di OM poiché è un agente genotossico. Al giorno sette, somministrare ai topi una soluzione di DSS al 2,5% come acqua da bere per la settimana successiva. Per preparare questa soluzione, aggiungere la polvere di DSS all'acqua distillata e mescolare fino a completo scioglimento.

La soluzione è pronta dopo essere stata filtrata attraverso un filtro in acetato di cellulosa da 0,2 micron. Per garantire un approvvigionamento continuo di soluzione di DSS per sette giorni, sostituire il DSS ogni due o tre giorni.

Dopo questo periodo, riportare le gabbie all'acqua per due settimane. Pesare i topi da due a tre volte a settimana e osservare la presenza di sanguinamento rettale e diarrea. I topi con tumori di grandi dimensioni possono sviluppare temporaneamente prolasso rettale, anche se ciò in genere non riduce la percentuale di sopravvivenza.

La perdita di peso rispetto al valore basale viene utilizzata come misura surrogata della gravità della colite. Una perdita di peso fino al 10%, insieme a due o tre giorni di diarrea e sanguinamento rettale, può essere prevista nella settimana successiva a un ciclo completo di endoscopia con DSS. Un secondo o terzo ciclo di DSS può essere eseguito per confermare la crescita tumorale in vivo prima dell'eutanasia.

Considerato che il modello A-O-M-D-S-S è piuttosto affidabile nella produzione di tumori, questo passaggio in genere non è necessario. Solo alcuni topi dovrebbero essere valutati mediante questo metodo, poiché potrebbe alterare i tumori nei topi. La vostra area di lavoro dovrebbe includere un becher contenente soluzione salina fosfato sterile tamponata o PBS, nonché un becher vuoto.

Per eliminare il PBS usato, aspirare da otto a dieci millilitri di PBS in una siringa e collegarla all'estremità dell'endoscopio per ogni utilizzo. Per lavare il contenuto intraluminale, anestetizzare ogni topo con sedazione inalatoria o iniettabile e fissare il topo su una tavola piana con del nastro adesivo applicato alla coda e al torace; i cuscinetti delle zampe del topo possono essere pizzicati. Per assicurare un'adeguata sedazione, utilizzare pollice e indice per pizzicare l'addome inferiore del topo ed esporre l'ano, quindi avanzare l'endoscopio murino nel retto del topo.

Utilizzare delicatamente il PBS per gonfiare e irrigare al fine di migliorare la visione intraluminale ed eliminare i contenuti fecali. Continuare ad avanzare lentamente l'endoscopio osservando il monitor. Alla presenza di tumori macroscopici al giorno 70, ogni topo trattato con A-O-M-D-S-S dovrebbe presentare numerosi tumori del colon ed essere pronto per la valutazione.

Questo stato può essere ritardato di settimane o mesi se si desiderano tumori di dimensioni maggiori. Preparare una siringa riempita di PBS collegata a un ago da gavaggio. Una siringa caricata con formalina al 10%, forbici chirurgiche di base, forbici con punte arrotondate.

Una siringa piccola caricata con soluzione di Ian Blue al 1%, pinzette fini. Inoltre, preparare un vassoio freddo, una barchetta contenente PBSA refrigerato, un rasoio nuovo per la sezionatura e un contenitore per la fissazione riempito con formalina al 10%. Eutanasia ogni topo mediante isoflurano e dislocazione cervicale o un altro metodo approvato a livello istituzionale. Possono essere effettuati il peso finale e altre misurazioni.

In questo momento, posizionare il topo con il lato ventrale esposto su un tagliere. Spruzzare l'addome con etanolo al 70% per mantenere i peli lontani dall'area di dissezione. Utilizzare una pinzetta per afferrare la linea mediana dell'addome ed effettuare un piccolo taglio attraverso la pelle per esporre il peritoneo.

Applicare una trazione delicata per separare la pelle dal peritoneo ed esporre l'intera cavità addominale. Praticare un'incisione nel peritoneo ed estendere tale incisione lungo il margine costale bilateralmente. Utilizzare forbici chiuse per spostare lateralmente l'intestino tenue e il colon.

Questo esporrà i linfonodi mesenterici, che possono essere prelevati in via opzionale. A scopo di valutazione, spostare inferiormente il tratto genito-urinario per esporre il colon discendente e il retto, asportare la vescica e gli organi riproduttivi secondo necessità per ulteriore esposizione della pelvi, avendo cura di non alterare i tessuti adiacenti.

Tagliare i rami pubici inferiore e superiore per esporre la giunzione ano-rettale. Tagliare la cute intorno alla giunzione ano-rettale per liberare il colon esercitando una lieve trazione verso l'alto. Con pinze mesenteriche, gli attacchi del colon possono essere escissi o delicatamente staccati.

È importante conservare una parte della cute al giunzione ano-rettale poiché questa zona è spesso interessata da displasia. Sezionare l'intestino crasso dall'intestino tenue appena prossimale al cieco. Separare il cieco dal colon adiacente utilizzando un ago da gavaggio 18 gauge collegato a una siringa da cinque millilitri.

Sciacquare il colon con PBS ghiacciato in modo che il liquido fuoriesca nella direzione fisiologica, utilizzando forbici con bordi arrotondati. Aprire il colon lungo il mesentere. Appoggiare il colon aperto sul vassoio freddo.

Assicurarsi che il vassoio sia scongelato a sufficienza da non congelare il tessuto. Applicare alcune gocce di Blu di Ian al 1% con un dito per visualizzare meglio i tumori. Valutare il numero e le dimensioni dei tumori con un righello oppure scattare fotografie per l'analisi digitale.

Sezioni piccole di tumore in tessuto normale adiacente possono essere escisse in questo momento per analisi successive mediante metodi di RNA, proteine o immunochimica, lasciando una parte del colon per la valutazione istologica. Applicare il 10% di formalina nel colon rimanente sul vassoio freddo mediante siringa o dito, permettendo al tessuto di fissarsi per almeno 30 secondi. In questo modo, si facilita il trasferimento al bacino di fissazione.

Assicurarsi che il formolo residuo venga rimosso prima di applicare un nuovo colon aperto sullo stesso vassoio. Trasferire il colon in una bacinella riempita con formolo al 10% e fissarlo ai bordi. Dopo tre ore di fissazione, scartare il formolo e sostituirlo con etanolo al 70%.

I colon possono essere conservati in etanolo al 70% indefinitamente. Utilizzare una temperatura bassa per preparare una soluzione di agar al 2% e mettere da parte un vetrino pulito su una piastra di vetro. Tagliare il colon fissato in tre parti e riporre le porzioni non utilizzate nel contenitore di etanolo.

Ridurre le sezioni a una dimensione uniforme utilizzando due lamette. Inserire le sezioni e i strati del colon in agar su un vetrino pulito. Ripetere questo processo per il colon successivo.

Sezionare in senso longitudinale, rimuovere l'agar in eccesso e posizionare il colon inclusi in una cassetta per la procedura di processazione e colorazione con ematina ed eosina. La figura uno illustra il protocollo per l'induzione del cancro associato alla colite. La figura due mostra il peso del topo rispetto al valore basale durante l'amministrazione di OM e DSS.

Si noti che nella settimana successiva a ciascun ciclo di DSS, i topi perdono dal 5 al 10% del loro peso corporeo. La perdita di peso in questo esperimento rappresenta un marcatore surrogato della gravità della colite. La figura tre mostra una vista dei tumori nel colon distale mediante endoscopia murina al giorno 50 del trattamento A-O-M-D-S-S.

Si noti la presenza di masse polipoidi multiple che ostruiscono la luz del colon distale nei pannelli B e C, in confronto al colon normale. Nel pannello A, la figura quattro mostra un colon di topo aperto longitudinalmente, che illustra l'aspetto macroscopico dei tumori. Si osservi il carico tumorale maggiore nel colon distale e la caratteristica texture atetica del colon prossimale, con scarsa crescita tumorale.

La figura cinque mostra tumori evidenziati mediante l'applicazione del colorante lc e blu. Osservare come il colorante metta in risalto la trama normale del colon, nonché i margini di ciascun tumore singolo. Questa colorazione può essere utile per la misurazione precisa delle aree tumorali mediante righello o misurazione digitale.

La figura sei mostra la distribuzione rappresentativa del numero medio di tumori per topo trattato con OM e DSS. Si noti che la maggior parte dei tumori si trova nel colon distale e ha dimensioni inferiori a due millimetri. La figura sette mostra sezioni longitudinali di colon incluse in paraffina all'interno di una cassetta e un vetrino colorato con ematossilina ed eosina.

Si noti che il residuo di S e la colorazione blu non interferiscono con la colorazione ematossilina ed eosina. Un tumore di grandi dimensioni è cerchiato nell'immagine del vetrino. Le denominazioni distale, media e prossimale derivano dalla suddivisione dell'intero colon in tre parti uguali tra cieco e ano.

La figura otto mostra l'istologia rappresentativa di un tumore risultante dall'amministrazione di OM e DSS nel colon distale. Le microfotografie mostrate sono colorate con ematossilina-eosina, B-R-D-U ed anti-beta-catenina e dimostrano alterazioni displastiche simili ad adenocarcinomi umani del colon. In questo video, abbiamo dimostrato un protocollo per l'insorgenza di tumori colici indotti da infiammazione nei topi, che prevede un'iniezione singola di OM seguita da tre cicli di sette giorni di DSS.

In un periodo di 10 settimane, questo modello induce tumori con alterazioni istologiche e molecolari molto simili a quelle che si verificano nel cancro associato alla colite umana, fornendo un modello estremamente prezioso per lo studio dell'oncogenesi e della chemioprevenzione in questa malattia.