Modellazione Colite-Associated Cancro con azoxymethane (OMA) e sodio solfato destrano (DSS)

Il giorno zero, Myer ha iniettato azossimetano o un OM la settimana successiva. La loro acqua potabile viene sostituita con una soluzione contenente destrano solfato di sodio o DSS. Alla terza settimana, ai topi viene somministrata acqua per le due settimane successive.

Questo ciclo dell'acqua DSS viene ripetuto altre due volte. Dopo il secondo ciclo DSS. I topi possono essere valutati per i tumori mediante endoscopia speculare.

Dopo la decima settimana, i topi vengono sacrificati e i colon vengono prelevati. I due punti vengono lavati e aperti longitudinalmente. I colon vengono valutati per le dimensioni e il numero del tumore.

Una sezione longitudinale del colon in terzi può essere incorporata e inviata per l'analisi istologica. Utilizzando la microscopia ottica, i tumori possono essere contati e classificati. Dimostriamo un protocollo in cui la somministrazione dell'agente genotossico è un OM, seguita da tre cicli dell'agente pro-infiammatorio.

Il DSS genera rapidamente e costantemente tumori del colon nei topi con somiglianze morfologiche e molecolari con quelli osservati nei tumori associati alla colite umana etichettati individualmente con segni di coda o clip per le orecchie il giorno zero, registrano il peso basale di ciascun topo su una tabella, quindi iniettano ogni topo con una soluzione di 10 milligrammi per chilogrammo di un esercizio OM. Attenzione quando si maneggia un OM in quanto è un agente genotossico il settimo giorno, l'avaro ha fornito una soluzione di DSS al 2,5% come acqua potabile per la settimana successiva. Per preparare questa soluzione, aggiungere la polvere di DSS all'acqua distillata e mescolare fino a quando non si sarà sciolta.

La soluzione è pronta dopo essere passata attraverso un filtro in acetato di cellulosa da 0,2 micron. Fornire una fornitura continua di soluzione DSS per sette giorni. Sostituire DSS ogni due o tre giorni.

Trascorso questo periodo, rimettere le gabbie in acqua per due settimane. Pesare i topi due o tre volte alla settimana e osservare il sanguinamento rettale e la diarrea. I topi con tumori di grandi dimensioni possono sviluppare temporaneamente il prolasso rettale, anche se questo generalmente non riduce la percentuale di sopravvivenza.

La perdita di peso rispetto al basale viene utilizzata come misura surrogata della gravità della colite. Ci si può aspettare una perdita di peso fino al 10% insieme a due o tre giorni di diarrea e sanguinamento rettale nella settimana successiva a un ciclo completo di endoscopia DSS. Seguente. Il secondo o terzo ciclo di DSS può essere eseguito per confermare la crescita del tumore in vivo prima del sacrificio.

Poiché il modello A-O-M-D-S-S è abbastanza affidabile nella produzione di tumori, questo passaggio non è generalmente necessario. Solo pochi topi dovrebbero essere valutati utilizzando questo metodo in quanto ha il potenziale per interrompere i tumori dei topi. L'area di lavoro dovrebbe includere un becher di fosfato sterile, soluzione salina tamponata o PBS e un becher vuoto.

Per scartare il PBS usato, aspirare da 8 a 10 millilitri di PBS in una siringa e collegarlo all'endoscopio per ogni utilizzo. Nel lavaggio del contenuto intraluminale, anestetizzare ogni topo con sedazione inalatoria o iniettabile e fissare il mouse a una tavola piatta con nastro adesivo sulla coda e sul torace, i piedini del mouse possono essere pizzicati. Per garantire un'adeguata sedazione, utilizzare il pollice e l'indice per pizzicare il basso addome del topo per esporre l'ano, far avanzare l'endoscopio muren nel retto del topo.

Usare delicatamente il PBS per gonfiare e irrigare per migliorare la visione intraluminale e rimuovere il contenuto fecale. Continuare ad avanzare lentamente l'endoscopio osservando il monitor. Per la presenza di tumori macroscopici al giorno 70, ogni topo trattato con A-O-M-D-S-S deve ospitare più tumori del colon ed essere pronto per la valutazione.

Questo stato può essere ritardato da settimane a mesi se si desiderano tumori più grandi. Preparare una siringa riempita di PBS attaccata a un ago da sonda gastrica. Una siringa caricata con il 10% di formalina, forbici chirurgiche di base, forbici con punte arrotondate.

Una piccola siringa caricata con soluzione di blu di Ian all'1% e pinze sottili. Inoltre, stendere un vassoio freddo, una barca da asporto contenente un nuovo rasoio PBSA refrigerato per il sezionamento e una bacinella di fissazione riempita con il 10% di formalina, eutanasia di ogni topo mediante isof, fluoro e lussazione cervicale o altro metodo approvato istituzionalmente. Il peso finale e altre misurazioni possono essere effettuati.

A questo punto, appoggia il mouse con il lato ventrale esposto su un tagliere. Spruzzare l'addome con etanolo al 70% per mantenere i peli liberi dall'area di dissezione. Usa una pinza per afferrare la linea mediana dell'addome e fai una piccola incisione attraverso la pelle per esporre il peritoneo.

Utilizzare una trazione delicata per separare la pelle dal peritoneo ed esporre l'intera cavità addominale. Praticare un'incisione nel peritoneo ed estendere questa incisione lungo il margine costale bilateralmente. Usa le forbici chiuse per spazzare di lato l'intestino tenue e il colon

Questo esporrà i linfonodi mesenterici, che possono essere raccolti facoltativamente. Per la valutazione, spazzare il tratto urinario genitale inferiormente per esporre il colon e il retto discendenti, asportare la vescica e gli organi riproduttivi se necessario per esporre ulteriormente il bacino. Facendo attenzione a non distruggere i tessuti adiacenti.

Tagliare i rami pubici inferiori e superiori per esporre la giunzione rettale anale. Taglia la pelle intorno alla giunzione rettale anale per liberare il colon fornendo una leggera trazione verso l'alto. Con il forcipe mesenterico, gli attacchi del colon possono essere asportati o stuzzicati.

È importante trattenere parte della pelle alla giunzione anale rettale poiché quest'area è spesso colpita da displasia. Sezionare l'intestino crasso dall'intestino tenue appena prossimalmente al cieco. Separare il secum dal colon adiacente utilizzando un ago da sonda gastrica calibro 18 collegato a una siringa da cinque millilitri.

Sciacquare il colon con PBS ghiacciato in modo che il fluido fuoriesca nella direzione fisiologica utilizzando forbici con bordi arrotondati. Apri il colon lungo il suo mesentere. Dipingi il colon aperto sulla teglia fredda.

Assicurarsi che il vassoio si sia scongelato a sufficienza da non congelare il fazzoletto. Applicare alcune gocce di 1% di Ian Blue con un dito per visualizzare meglio i tumori. Valuta il numero e le dimensioni del tumore con un righello o scatta fotografie per l'analisi digitale.

Piccole sezioni di tumore nel tessuto normale adiacente possono essere asportate a questo punto per future analisi con proteine dell'RNA o metodi immunoistochimici, lasciando una parte del colon per la valutazione istologica. Applicare il 10% formale nel colon rimanente sul vassoio freddo tramite siringa o dito, lasciando che il tessuto si fissi per almeno 30 secondi. In questo modo, facilita il trasferimento alla vasca di fissaggio.

Assicurarsi che la formina residua sia stata rimossa prima di dipingere un nuovo colon aperto sullo stesso vassoio. Trasferisci il colon in una bacinella riempita con il 10% di formina e appuntata ai bordi. Dopo tre ore di fissaggio, scartare, formare e sostituire con etanolo al 70%.

I colon possono essere conservati in etanolo al 70% a tempo indeterminato. Usa il fuoco basso per fare una soluzione di agar al 2% e metti da parte un vetrino pulito su una lastra di vetro. Tagliare il colon fisso in terzi e rimettere i pezzi inutilizzati nella bacinella dell'etanolo.

Taglia le sezioni a una dimensione uniforme usando due rasoi. Incorporare le sezioni del colon e gli strati in agar sul vetrino pulito. Ripeti questo processo per il prossimo colon.

Segmentare il taglio, l'agar in eccesso e posizionare il colon incorporato in una cassetta per la lavorazione e la colorazione con ematina ed eoina. La prima figura delinea il protocollo per l'induzione del cancro associata alla colite. La seconda figura mostra il peso del topo rispetto al basale durante la somministrazione di OM e DSS.

Si noti che nella settimana successiva a ciascun ciclo DSS, i topi perdono dal 5 al 10% del loro peso corporeo. La perdita di peso in questo esperimento è un marcatore surrogato per la gravità della colite. La figura tre mostra una visione dei tumori nel colon distale tramite endoscopia muren al giorno 50 del trattamento A-O-M-D-S-S.

Si noti che le masse polipoidi multiple ostruiscono il lume del colon distale nei pannelli B e C rispetto al colon normale. Nel pannello una figura quattro mostra un colon di topo aperto longitudinalmente che illustra l'aspetto macroscopico dei tumori. Si noti il più elevato carico tumorale nel colon distale e la caratteristica struttura del colon prossimale con poca crescita tumorale.

La figura cinque mostra i tumori evidenziati dall'applicazione di lc e colorazione blu. Si noti come il colorante enfatizzi la normale consistenza del colon e i bordi di ogni singolo tumore. Tale colorazione può essere utile nella misurazione precisa delle aree tumorali mediante righello o misurazione digitale.

La figura sei mostra la distribuzione rappresentativa del numero medio di tumori per topo trattato con OM e DSS. Si noti che la maggior parte dei tumori si trova nel colon distale e ha una dimensione inferiore a due millimetri. La figura sette mostra le sezioni longitudinali del colon incorporate nella paraffina in una cassetta e il vetrino di colorazione h ed E.

Si noti che la colorazione S e blu residua non interferisce con la colorazione h ed e. Un tumore di grandi dimensioni è cerchiato sull'immagine del vetrino. La designazione distale, media e prossimale deriva dalla sezione dell'intero colon in terzi tra il cieco e l'ano.

La figura otto mostra l'istologia rappresentativa di un tumore risultante dalla somministrazione di OM e DSS nel colon distale. Le micrografie fotografiche mostrate sono colorate con H e E-B-R-D-u e beta-catenina e mostrano alterazioni displastiche simili agli adenocarcinomi umani del colon. In questo video, abbiamo dimostrato un protocollo per la tumorgenesi del colon causata dall'infiammazione nei topi, utilizzando una singola iniezione di un OM seguita da tre cicli di sette giorni di DSS.

Per un periodo di 10 settimane, questo modello induce tumori con cambiamenti istologici e molecolari molto simili a quelli che si verificano nel cancro associato alla colite umana e fornisce un modello di grande valore per lo studio dell'oncogenesi e della prevenzione della chemio in questa malattia.