Campionamento umana peptidoma Indigenous Saliva Utilizzando un Lollipop-Like Probe ultrafiltrazione: Semplificare e migliorare la rilevazione Peptide per spettrometria di massa Clinica

Questo studio del peptidoma salivare utilizza una sonda a filtrazione ultrafine simile a un lecca-lecca, seguita da un'analisi diretta mediante spettrometria di massa nano LC LTQ. Per prima cosa, assemblare la sonda LLUF utilizzando una membrana di polietere per telefoni cellulari e un tubo di etilene-propilene. Successivamente, raccogliere campioni di saliva da volontari ed elaborarli attraverso la sonda LLUF per prelevare la saliva.

Quindi procedere direttamente alla spettrometria di massa nano L-C-L-T-Q e analizzare i dati provenienti dai campioni di saliva con e senza trattamento con sonda LLUF. In definitiva, il peptidoma salivare può essere ottenuto analizzando i dati L-C-M-S-S e confrontando i peptidi identificati tra i due campioni. Questo approccio, che utilizza una sonda a filtrazione ultrafine simile a un lecca-lecca abbinata a un'analisi diretta mediante spettrometria di massa nano LC-LTQ, offre vantaggi chiave rispetto ad altri metodi, come la digestione delle proteine salivari in peptidi.

Successivamente all'analisi con spettrometria di massa, il LUF PRO semplifica e purifica la saliva e migliora anche la rilevazione MS dei peptidi nell'intera saliva per applicazioni cliniche. Utilizzando una colla epossidica, sigillare le membrane di cellulare in polietere sui bordi delle palette triangolari in polipropilene. Quindi collegare un tubo in fluoruro di etilene propilene Teflon a un'uscita cilindrica di un triangolo.

Sterilizzare i sensori con alcol al 70% durante la notte utilizzando una paletta in polipropilene per valutare l'adeguatezza della chiusura ermetica; immergere i sensori LLUF in una soluzione di destano blu a 50 milligrammi per millilitro per due ore. Verificare l'assenza di destano blu nei campioni raccolti.

Reclutare volontari sani di età compresa tra 20 e 40 anni. Dopo un risciacquo orale con acqua, chiedere al soggetto di sputare campioni di saliva integrale in un contenitore raffreddato con ghiaccio. Raccogliere tutti i campioni in un unico pool e conservarli sul ghiaccio.

Immediatamente dopo il prelievo, procedere in una stanza a quattro gradi Celsius con 200 microlitri di saliva per il campionamento con sonde LLUF. Immergere ora la membrana di polietere della pellicola cellulare nella saliva umana in una piastra di coltura. Creare una pressione negativa aspirando con una siringa per simulare un processo di ultrafiltrazione per il campionamento dalla saliva.

Successivamente, determinare le concentrazioni proteiche. Preparare un microgrammo per microlitro dei campioni proteici di saliva per l'analisi mediante spettrometria di massa con nano cromatografia liquida. Per l'analisi dei campioni, utilizziamo una nano cromatografia liquida esigente online accoppiata a uno spettrometro di massa Finnegan LTQ. Caricare innanzitutto cinque microlitri dei campioni di saliva non digeriti sulla colonna di trappolaggio del sistema di nano cromatografia liquida mediante il campionatore automatico.

Dopo un passaggio di lavaggio, commutare la valvola ed erogare un gradiente lineare da zero al 50% di tampone B verso il trap e la colonna di separazione C 18. Utilizzando la modalità dipendente dai dati di Excalibur, raccogliere gli spettri ms ms dei quattro ioni MS più intensi al di sopra di un'intensità di uno per 10 alla quarta. Per ogni campione, eseguire due ripetizioni di tre preparazioni distinte.

Quindi importare il file di dati nel sistema Sequester Sorcerer 2 e selezionare una ricerca contro un'appropriata banca dati proteica umana NCBI utilizzando una specificità non enzimatica. Dopo la ricerca con Sequester, i risultati vengono automaticamente filtrati, convalidati e visualizzati in Peptide Prophet e Protein Prophet in base ai risultati di Sequester. Peptide Prophet stima un punteggio di probabilità P completo che indica se l'assegnazione di un peptide è corretta o errata, e identifica anche ulteriori informazioni su ciascuna sequenza peptidica.

Protein profit calcola un punteggio di probabilità compreso tra zero e uno per ogni proteina in base ai peptidi assegnati agli spettri Ms.Ms. Questa sezione determina la capacità delle sonde LLUF di rimuovere i batteri orali per la coltura di rilevamento batterico, prelevando campioni di saliva prima e dopo la raccolta con la sonda LLUF su piastre a vite per un test su batteri aerobi. Utilizzare piastre a vite LB senza antibiotici a 37 gradi Celsius per un giorno e, per i batteri anaerobi, utilizzare un sistema con confezione di gas per la coltura.

Il campione viene coltivato in brodo bru, su piastre con agitatore sotto condizioni anaerobiche a 37 gradi Celsius per un giorno. La fabbricazione di leccalecca, simili a dispositivi di ultrafiltrazione, facilita il campionamento della saliva in un ambiente orale imitato. In questo sistema, una membrana di cellulosa polietere carica negativamente con un limite di peso molecolare di 30 chilodalton è incollata a una paletta di polipropilene e posizionata davanti alla sonda LLUF per filtrare le proteine più grandi contenute nella saliva.

Per simulare l'ambiente orale umano, una spugna viene inzuppata di saliva utilizzando una siringa. La saliva viene filtrata e raccolta attraverso il tubo collegato. Il confronto dei cromatogrammi LC della saliva prima e dopo il campionamento con LLUF ha permesso l'identificazione dei peptidi salivari indigeni mediante spettrometria di massa nano LC-LTQ.

Dal momento che questi cromatogrammi differenziali sono ottenuti senza digestione chimica o enzimatica, essi semplificano la preparazione del campione a fini clinici. In questo campione. Dopo la chiarificazione mediante LLUF delle diverse composizioni proteiche, sono stati identificati 131 peptidi nella saliva non digerita.

Questi peptidi sono frammenti derivati da diverse proteine ricche di prolina. Actin, alfa amilasi, alfa uno globina, beta globina, his sustain uno, cheratina, uno mucina sette, recettore polimerico dell'immunoglobulina, serina e S 100. A 9 26 peptidi unici identificati nella saliva dopo il filtraggio con sonde LLUF sono frammenti principalmente derivati da diverse proteine ricche di prolina.

Questo peptide derivato dall'amilasi alfa è stato rilevato esclusivamente in un campione di saliva senza raccolta mediante sonde LLUF, illustrando la capacità delle sonde LLUF di rimuovere le proteine di grandi dimensioni. In modo particolarmente interessante, dopo la rimozione delle proteine più grandi, diversi peptidi di sequenza sono risultati rilevabili nella saliva campionata con sonde LLUF, in particolare sono stati identificati peptidi con estremità C ricche di prolina nei campioni dopo la filtrazione ultrafine con sonde LLUF. A questo punto si dovrebbe avere una buona comprensione di come utilizzare A-L-L-L-L-U-F PRO per la saliva semplice, in massa.

Un'analisi migliore è molto importante per raccogliere e analizzare semplici campioni di saliva in condizioni costanti. Una volta padroneggiata, ritengo che questa tecnica possa essere eseguita correttamente entro tre ore. Questo approccio, basato su una sonda per filtrazione ultrafine simile a un lecca-lecca abbinata a un'analisi diretta mediante nano LC-MS/MS, facilita le applicazioni cliniche per i biomarcatori nella diagnosi delle malattie umane.