Name: Questo dicembre a JOVE (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-12-01T00:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 12 s
Description: Scopri i progressi in neuroscienza e biologia dal numero di dicembre 2011 di JoVE. Questo articolo presenta tecniche sperimentali innovative per visualizzare processi biologici complessi e promuovere la riproducibilità della ricerca.

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<h2 class="jove_title"><a href="https://www.jove.com/video/2770">Determinazione delle strutture molecolari delle glicoproteine dell'involucro dell'HIV utilizzando la tomografia crioelettronica e la media automatica del sottotomogramma</a></h2>
Joel R. Meyerson1, 2, Tommi A. Bianco1, Donald Bliss3, Amy Moran3, Alberto Bartesaghi1, Mario J. Borgnia1, M. Jason V. de la Cruz1, David Schauder1, Lisa M. Hartnell1, Rachna Nandwani1, 4, Moez Dawood5, Brianna Kim6, Jun Hong Kim7, John Sununu8, Lisa Yang9, Siddhant Bhatia10, Carolyn Subramaniam1, Darrell E. Hurt11, Laurent Gaudreault12, Sriram Subramaniam1 
 1Laboratorio di Biologia Cellulare, Centro per la Ricerca sul Cancro, National Cancer Institute, National Institutes of Health, 2The Medical Research Council Mitochondrial Biology Unit, Università di Cambridge, 3National Library of Medicine, National Institutes of Health, 4Massachusetts Institute of Technology, 5William Fremd High School, 6University of Virginia, 7Duke University, 8Yale University, 9Università di Notre Dame, 10Washington University di St. Louis, 11Ramo di Bioinformatica e Bioscienze Computazionali, Istituto Nazionale di Allergie e Malattie Infettive, National Institutes of Health, 12Thomas Jefferson High School for Science and Technology
Il protocollo descrive un approccio ad alto rendimento per determinare le strutture delle proteine di membrana utilizzando la tomografia crioelettronica e l'elaborazione di immagini 3D. Copre i dettagli della preparazione dei campioni, della raccolta dei dati, dell'elaborazione e dell'interpretazione dei dati e si conclude con la produzione di un bersaglio rappresentativo per l'approccio, la glicoproteina dell'involucro HIV-1. Queste procedure computazionali sono progettate in modo da consentire a ricercatori e studenti di lavorare a distanza e contribuire all'elaborazione dei dati e all'analisi strutturale.
<h2 class="jove_title"><a href="https://www.jove.com/video/3118">Misurazioni elettrofisiologiche e analisi della nocicezione nei neonati umani</a></h2>
L. Fabrizi1,*, A. Worley2,*, D. Patten1, S. Holdridge1, L. Cornelissen1, J. Mansuetudine3, S. Boyd2, R. Slater1, 4 
 1Neuroscienze, Fisiologia e Farmacologia, University College London, 2Dipartimento di Neurofisiologia Clinica, Great Ormond Street Hospital, 3Elizabeth Garrett Anderson Obstetric Hospital, University College Hospital, 4Nuffield Department of Anesthetics, Università di Oxford 
 * Questi autori hanno contribuito in egual misura
Il protocollo descrive un approccio ad alto rendimento per determinare le strutture delle proteine di membrana utilizzando la tomografia crioelettronica e l'elaborazione di immagini 3D. Copre i dettagli della preparazione dei campioni, della raccolta dei dati, dell'elaborazione e dell'interpretazione dei dati e si conclude con la produzione di un bersaglio rappresentativo per l'approccio, la glicoproteina dell'involucro HIV-1. Queste procedure computazionali sono progettate in modo da consentire a ricercatori e studenti di lavorare a distanza e contribuire all'elaborazione dei dati e all'analisi strutturale.
<h2 class="jove_title"><a href="https://www.jove.com/video/3189">Stampa Planare e Tridimensionale di Inchiostri Conduttivi</a></h2>
Bok Yeop Ahn1, Steven B. Walker1, Scott C. Più sottile1, Analisa Russo1, Ashley Gupta1, Steve Kranz1, Eric B. Duoss1, 2, Thomas F. Malkowski1, 3, Jennifer A. Lewis1 
 1Dipartimento di Scienza e Ingegneria dei Materiali, Università dell'Illinois a Urbana-Champaign, 2Centro per la Micro e Nanotecnologia, Lawrence Livermore National Laboratory, 3Attualmente presso il Centro Interdisciplinare per Semiconduttori a Banda Proibita Larga, Università della California Santa Barbara 
Viene descritta la stampa planare e tridimensionale di inchiostri metallici conduttivi. Il nostro approccio offre nuove strade per la fabbricazione di dispositivi elettronici, optoelettronici e biomedici stampati in layout insoliti su microscala.
<h2 class="jove_title"><a href="https://www.jove.com/video/3297">Valutazione della migrazione delle cellule staminali tumorali utilizzando dispositivi microfluidici compartimentalizzanti e imaging di cellule vive</a></h2>
Yu Huang1, 2,*, Basheal Agrawal3,*, Paul A. Clark3, Justin C. Williams1, 2, 3, John S. Kuo3, 4 
 1Dipartimento di Ingegneria Biomedica, Università del Wisconsin-Madison, 2Programma di Scienza dei Materiali, Università del Wisconsin-Madison, 3Dipartimento di Chirurgia Neurologica, Università del Wisconsin-Madison, 4Carbone Comprehensive Cancer Center e Centro per le Cellule Staminali e la Medicina Rigenerativa, Università del Wisconsin-Madison 
 * Questi autori hanno contribuito in egual misura
Viene descritto un dispositivo microfluidico compartimentalizzante per studiare la migrazione delle cellule staminali tumorali. Questa nuova piattaforma crea un microambiente cellulare vitale e consente la visualizzazione microscopica della locomozione delle cellule vive. Le cellule tumorali altamente mobili vengono isolate per studiare i meccanismi molecolari dell'infiltrazione aggressiva, portando potenzialmente a terapie future più efficaci.
<h2 class="jove_title"><a href="https://www.jove.com/video/3311">Imaging del rilevamento dei feromoni in una preparazione di fette di tessuto acuto vomeronasale di topo</a></h2>
Julien Brechbühl1, Gaëlle Luyet1, Fabian Moine1, Ivan Rodriguez2, Marie-Christine Broillet1 
 1Dipartimento di Farmacologia e Tossicologia, Università di Losanna, 2Dipartimento di Genetica ed Evoluzione, Università di Ginevra
Nei topi, la capacità di rilevare i feromoni è principalmente mediata dall'organo vomeronasale (VNO). Qui viene descritta una preparazione acuta di fette di tessuto di VNO per l'esecuzione dell'imaging del calcio. Questo approccio fisiologico consente l'osservazione di sottopopolazioni e/o singoli neuroni in un tessuto vivente ed è conveniente per l'identificazione recettore-ligando.
<h2 class="jove_title"><a href="https://www.jove.com/video/3380">Trasduzione virale selettiva di neuroni olfattivi nati adulti per la stimolazione optogenetica cronica in vivo</a></h2>
Gabriel Lepousez, Mariana Alonso, Sebastian Wagner, Benjamin W. Gallarda, Pierre-Marie Lledo 
 Laboratorio di Percezione e Memoria, Institut Pasteur e Centre National de la Recherche Scientifique (CNRS)
I neuroni nati adulti del bulbo olfattivo possono essere controllati optogeneticamente utilizzando l'iniezione lentivirale che esprime Channelrhodopsin2 nel flusso migratorio rostrale e la fotostimolazione cronica con un LED in miniatura impiantato.
<h2 class="jove_title"><a href="https://www.jove.com/video/3404">Imaging delle risposte neuronali nelle preparazioni di fette di organo vomeronasale che esprime un sensore di calcio geneticamente codificato</a></h2>
Limei Ma1, Sachiko Haga-Yamanaka1, Qingfeng Elden Yu1, Qiang Qiu1, SangSeong Kim1, C. Ron Yu1, 2 
 1Stowers Institute for Medical Research, 2Dipartimento di Anatomia e Biologia Cellulare, Scuola di Medicina dell'Università del Kansas
L'organo vomeronasale (VNO) rileva segnali chimici intraspecie che trasmettono informazioni sociali e riproduttive. Abbiamo eseguito esperimenti di imaging del Ca2+ utilizzando topi transgenici che esprimono G-CaMP2 nel tessuto VNO. Questo approccio ci permette di analizzare i complicati modelli di risposta dei neuroni vomeronasali a un gran numero di stimoli feromonici.
<h2 class="jove_title"><a href="https://www.jove.com/video/3438">Misurazione del Ca2+ citosolico nei linfatici contrattili isolati</a></h2>
Flavia M. Souza-Smith, Kristine M. Kurtz, Jerome W. Breslin 
 Dipartimento di Fisiologia, Scuola di Medicina, Centro di Scienze della Salute della Louisiana State University
Introduciamo un approccio per valutare la concentrazione citosolica di Ca2+ nei linfatici isolati per studiare i meccanismi di sensibilizzazione del Ca2+-dipendente e del Ca2+-della contrazione della muscolatura liscia linfatica.

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

questo dicembre a jove

December 2011: This Month in JoVE

Il Journal of Visualized Experiments (JoVE) chiude il 2011 con un numero di dicembre che inizia onorando la Giornata Mondiale contro l'AIDS con un articolo che si occupa di visualizzare la struttura delle glicoproteine dell'involucro dell'HIV, che sono un componente critico del percorso di infezione virale.
Un metodo chiave per determinare la struttura dell'involucro del virione è la tomografia crioelettronica. Prima di utilizzare questa tecnica, il virus solubile deve essere vitrificato su una griglia d'oro, un processo che prevede l'aggiunta di oro a una sospensione virale, il trasferimento di tale sospensione alla griglia e l'immersione della griglia in etano liquido. Le particelle virali, presenti in un sottile film di liquido in cima alla griglia, vengono congelate a una velocità superiore a 100.000 K al secondo. Dopo la vetrificazione, i campioni raccolti vengono caricati nel microscopio elettronico e le regioni definite con precisione sulla griglia vengono colpite con un fascio di elettroni focalizzato, mentre la griglia viene inclinata. La serie di tilt che risulta da queste sessioni di imaging è composta da centinaia di singole immagini, che devono essere allineate e mediate per risolvere le singole proteine dell'involucro. Questo processo computazionale richiede spesso cluster di computer, in grado di eseguire l'elaborazione parallela ad accesso remoto, come Biowulf del NIH.
Una volta completati, i modelli 3D possono non solo fornire informazioni sulla struttura delle glicoproteine dell'involucro stesse, ma possono anche rivelare il modo in cui interagiscono con altre proteine, come l'anticorpo neutralizzante B12, che è un'informazione che può influenzare notevolmente la progettazione del vaccino.
Questo articolo, dal laboratorio del Dr. Sriram Subramaniam, coinvolge i contributi di venti autori, tra cui non solo studenti laureati e post-dottorato, ma anche studenti delle scuole medie e superiori, dimostrando che non si è mai troppo giovani per avere un impatto nella lotta contro una malattia che ha infettato oltre 60 milioni di persone, in tutto il mondo.
In Medicina Clinica e Traslazionale, JoVE presenta un articolo dell'University College di Londra e dell'Università di Oxford che indaga i correlati fisiologici della nocicezione, o sensazione di dolore, nei neonati. In genere, i neonati rispondono a stimoli nocivi piangendo e cambiando le loro espressioni facciali, reazioni considerate autonome e dipendenti dalle regioni sottocorticali del cervello.
Per comprendere il coinvolgimento della corteccia cerebrale e del midollo spinale nella nocicezione infantile, i nostri autori preparano prima i neonati per le registrazioni EEG ed EMG. Hanno anche impostato il monitoraggio fisiologico e la registrazione video, in modo che le espressioni facciali del bambino possano essere collegate ai dati fisiologici. Dopo la valutazione delle risposte del bambino a stimoli tattili neutri, il bambino viene sottoposto a pungidito sul tallone, una procedura clinica utilizzata per ottenere campioni di sangue dai neonati. Dopo l'elaborazione dei dati, i potenziali elettrici possono essere confrontati tra stimoli nocivi e non nocivi in questi neonati, il che si spera porti a conclusioni significative, riguardo a come le informazioni nocicettive vengono interpretate dai neonati.
La sezione di Bioingegneria di JoVE si concentra maggiormente sulla clinica a dicembre con un articolo dell'Università del Wisconsin, Madison, che riguarda la fabbricazione di un dispositivo microfluidico compartimentalizzato per lo studio della migrazione delle cellule staminali tumorali. Dopo la progettazione del dispositivo, gli stampi master vengono creati mediante fotolitografia per l'applicazione di polidimetilsilossano (PDMS), un composto organosilicio trasparente e biologicamente inerte, che lo rende adatto per applicazioni microfluidiche con cellule vive. In particolare, i nostri autori caricano cellule staminali tumorali derivate da glioblastoma multiforme, un cancro cerebrale altamente maligno, nei dispositivi compartimentalizzati e poi le inseriscono in un sistema di imaging specializzato che acquisisce dati in pochi giorni. 
Il video time lapse di questi autori mostra che le cellule staminali tumorali sono in grado di regolare la loro morfologia nei canali microfluidici con dimensioni limitate proprio come farebbero nello spazio interstiziale, e l'isolamento fluidico reso possibile da camere come queste facilita lo screening farmacologico per potenziali terapie che possono influenzare la migrazione delle cellule staminali tumorali.
Verso la fine del mese, JoVE si reca in Francia, dove i ricercatori dell'Istituto Pasteur e del Centre National de la Recherche Scientifique, illustrano un metodo per indurre l'espressione del canale-rodopsina, un canale ionico attivato dalla luce, nel bulbo olfattivo dei topi, così come la successiva stimolazione neuronale utilizzando un diodo a emissione di luce (LED) in miniatura.
I nostri autori forniscono istruzioni dettagliate passo dopo passo per preparare gli aghi per iniezione e per l'iniezione precisa del virus nel flusso migratorio rostrale, un sito di migrazione per i neuroblasti nati adulti. Inoltre, mostrano come i dispositivi di stimolazione LED in miniatura vengono fabbricati, calibrati e impiantati in cima a una finestra cranica preparata sopra la lampadina. In particolare, i nostri autori sono interessati al modo in cui i neuroni nati adulti si integrano nei circuiti neuronali olfattivi esistenti, e mostrano che la stimolazione LED in animali svegli, può portare all'attivazione di neuroblasti trasdotti viralmente nel bulbo olfattivo, che sono migrati dal flusso migratorio rostrale.
Questi video-articoli comprendono i punti salienti di JoVE per il mese di dicembre. Altri articoli degni di nota illustrano i metodi per modellare gli inchiostri conduttivi in microelettrodi, misurare il calcio citosolico nei linfatici contrattili e visualizzare le risposte neuronali ai feromoni nell'organo vomeronasale.

Questo dicembre a JOVE

The Journal of Visualized Experiments (JoVE) chiude il 2011 con il numero di dicembre, che si apre commemorando la Giornata Mondiale contro l'AIDS con un articolo dedicato alla visualizzazione della struttura delle glicoproteine dell'envelope dell'HIV, componenti critiche della via di infezione virale. Uno dei metodi principali per determinare la struttura dell'envelope del virione è la tomografia crioelettronica. Prima di utilizzare questa tecnica, il virus solubile deve essere vetrificato su una griglia d'oro, un processo che prevede l'aggiunta di oro a una sospensione virale, il trasferimento di tale sospensione sulla griglia e l'immersione rapida della griglia in etano liquido. Le particelle virali, presenti in un sottile film di liquido sopra la griglia, vengono congelate a una velocità superiore a 100.000 K al secondo. Dopo la vetrificazione, i campioni raccolti vengono caricati nel microscopio elettronico e regioni definite con precisione sulla griglia vengono colpite da un fascio di elettroni focalizzato, mentre la griglia viene inclinata. La serie di inclinazioni che risulta da queste sessioni di imaging è composta da centinaia di singole immagini, che devono essere allineate e mediate per risolvere le singole proteine dell'envelope. Questo processo computazionalmente intenso richiede spesso cluster di computer capaci di elaborazione parallela ad accesso remoto, come il Biowulf dell'NIH. Una volta completati, i modelli 3D possono non solo fornire informazioni sulla struttura delle glicoproteine dell'envelope stesse, ma possono anche rivelare il modo in cui esse interagiscono con altre proteine, come l'anticorpo neutralizzante B12, informazioni che possono influenzare notevolmente la progettazione dei vaccini. Questo articolo, proveniente dal laboratorio del Dr. Sriram Subramaniam, coinvolge i contributi di venti autori, tra cui non solo studenti laureati e post-doc, ma anche studenti delle scuole medie e superiori, dimostrando che non si è mai troppo giovani per dare un contributo nella lotta contro una malattia che ha infettato oltre 60 milioni di persone in tutto il mondo. Nella sezione di Medicina Clinica e Traslazionale, JoVE presenta un articolo dell'University College London e dell'University of Oxford che indaga i correlati fisiologici della nocicezione, ovvero la sensazione di dolore, nei neonati. Tipicamente, i neonati rispondono agli stimoli nocivi piangendo e cambiando le espressioni facciali, reazioni considerate autonome e dipendenti dalle regioni sottocorticali del cervello. Per comprendere il coinvolgimento della corteccia cerebrale e del midollo spinale nella nocicezione infantile, gli autori preparano innanzitutto i neonati per le registrazioni EEG ed EMG. Implementano inoltre un monitoraggio fisiologico e una registrazione video, in modo che le espressioni facciali del neonato possano essere collegate ai dati fisiologici. Dopo la valutazione delle risposte del neonato a stimoli tattili neutri, il bambino viene sottoposto a una puntura del tallone, una procedura clinica utilizzata per ottenere campioni di sangue dai neonati. Dopo l'elaborazione dei dati, è possibile confrontare i potenziali elettrici tra stimoli nocivi e non nocivi in questi neonati, il che porterà auspicabilmente a conclusioni significative su come le informazioni nocicettive vengano interpretate dai neonati. La sezione di Bioingegneria di JoVE assume un approccio più clinico a dicembre con un articolo della University of Wisconsin, Madison, che riguarda la fabbricazione di un dispositivo microfluidico compartimentato per lo studio della migrazione delle cellule staminali tumorali. Dopo la progettazione del dispositivo, vengono creati stampi master tramite fotolitografia per l'applicazione del polidimetilsilossano (PDMS) — un composto organosiliconico trasparente e biologicamente inerte, che lo rende adatto ad applicazioni microfluidiche con cellule vive. Nello specifico, gli autori caricano cellule staminali tumorali derivate da glioblastoma multiforme, un tumore cerebrale altamente maligno, nei dispositivi compartimentati e li inseriscono quindi in un sistema di imaging specializzato che acquisisce dati nell'arco di alcuni giorni.

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Scopri i progressi in neuroscienza e biologia dal numero di dicembre 2011 di JoVE. Questo articolo presenta tecniche sperimentali innovative per visualizzare processi biologici complessi e promuovere la riproducibilità della ricerca.

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Aaron Kolski-Andreaco

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