Name: Purificazione di Vacuoli patogeno da Legionella-Infetti fagociti (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-06-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 25 s
Description: Scopri il metodo di purificazione dei vacuoli contenenti Legionella da fagociti infetti tramite omogenizzazione, separazione immuno-magnetica e centrifugazione a gradiente di densità. Questa tecnica consente di isolare intatti LCV con elevata purezza per studiare i meccanismi patogenetici.

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La ricerca nel nostro laboratorio è stato sostenuto dalla Max von Pettenkofer Institute, Ludwig-Maximilians University di Monaco di Baviera, il tedesco Research Foundation (DFG, HI 1511/3-1) e il Bundesministerium für Bildung und Forschung (BMBF) iniziativa &quot;Infezione Medical Genomics&quot; ( 0315834C).

1. I preparativi per isolamento LCV <ol><li> Streak out Legionella pneumophila produce DsRed-Express 13,14 dalle scorte di glicerolo su piastre di agar CYE con 5 mcg / ml di cloramfenicolo (Cam) quattro giorni prima di isolamento LCV. Incubare i batteri a 37 ° C. </li><li> Seed out 1 x 10 7 D. discoideum produzione di GFP-calnexina o RAW264.7 macrofagi murini in 75 cm 2 coltura tissutale palloni un&#39;infezione giorno prima. Utilizzare 10 ml HL5 media con 20 ug / mL G418 per D. discoideum e incubare le amebe a 23 ° C. Per utilizzare RAW264.7 macrofagi 10 ml mezzo RPMI 1640 integrato con 10% FCS (inattivato con il calore) e 1% glutammina, e crescere le cellule a 37 ° C e 5% CO 2. Utilizzare almeno tre 75 cm 2 palloni per l&#39;infezione e il campione (minimo 6 x 10 7 cellule). </li><li> Inoculare una cultura notte con L. pneumophila dalla piastra CYE. Prendere una provetta da 15 ml con 3 mL AYE mediae 5 ug / mL Cam. Inoculare con 100 pl di una sospensione batterica per ottenere un OD 600nm di 0,1. Incubare la coltura durante la notte su una ruota rotazione testa a 37 ° C per 21-22 hr. </li></ol> 2. LCV isolamento <ol><li> Cambia il mezzo di D. discoideum cellule per rimuovere il antibiotico, che interferirebbero con la successiva infezione. </li><li> Misurare la densità ottica della cultura durante la notte. I batteri dovrebbe aver raggiunto la loro infettività picco a uno OD 600nm di ≥ 3, che corrisponde a 2 x 10 9 batteri / ml. </li><li> Infettare le cellule aggiungendo circa 500 pl di L. pneumophila coltura durante la notte per le cellule crescono in 10 ml HL5 mezzo (D. discoideum) o 10 ml RPMI 1640 (macrofagi). Questo corrisponde ad una molteplicità di infezione (MOI) di 50. Successivamente, l&#39;infezione è sincronizzato mediante centrifugazione dei batteri sulle celle a 500 g per 10 min. Centrifugazione è seguitada un&#39;incubazione del D. discoideum cellule a 25 ° C ed i macrofagi RAW264.7 a 37 ° C e 5% CO 2, rispettivamente. Il tempo di infezione di 1 ora comprende la fase di centrifugazione. </li><li> Dopo infezione rimuovere il terreno e lavare le cellule una volta per rimuovere i batteri extracellulari. Utilizzare tampone ghiacciato SORC per D. discoideum e gelide PBS per RAW264.7 macrofagi. Aggiungere 3 mL HS buffer, integrato con inibitori della proteasi (Roche) ad ogni pallone e raccogliere le cellule utilizzando un raschietto cellulare. Pool i relativi campioni in una provetta da 15 ml. </li><li> Per la omogeneizzazione delle utilizzare campioni 3 ml di plastica siringhe Luer-Lock e la sfera in acciaio inox Omogeneizzatore. Assicurarsi che si lavora su ghiaccio. Prima di iniziare, lavare l&#39;omogeneizzatore palla con acqua distillata, per evitare qualsiasi contaminazione detergente e sciacquare con tampone ghiacciata HS per sbarazzarsi di bolle d&#39;aria. Utilizzare l&#39;8 ball gioco micron. </li><li> Riempire i primi 3 ml in siringa und montarlo su maggioe omogeneizzatore. Premere il campione avanti e indietro nove volte attraverso l&#39;omogeneizzatore. Scambiarsi le siringhe in seguito per evitare la contaminazione con materiale non omogeneizzato. Raccogliere e mettere in comune il campione omogeneizzato in una provetta da 15 ml e prendere un campione di 150 microlitri per l&#39;analisi microscopica. Prima di procedere con un campione diverso smontare e lavare il omogeneizzatore palla. </li><li> Bloccare l&#39;omogeneizzato con 2% FCS o CS per 30 minuti su un agitatore su ghiaccio o su un overhead filatura ruota (10-20 rpm) a 4 ° C. </li><li> Dopo aver bloccato utilizzare un purificate per affinità anticorpo primario contro il SIDC (diluizione 1:3000) o contro qualsiasi altro marcatore batterica esclusivamente legame alla membrana LCV. Vortex la soluzione di anticorpi prima di aggiungerlo alla omogeneizzato. Incubare il campione per 1 h su un agitatore su ghiaccio o su un overhead filatura ruota (10-20 rpm) a 4 ° C. </li><li> Nel frattempo, preparare il gradiente Histodenz. Utilizzare una provetta da 15 ml per pendenza e tre fiasche 75 cm 2 di un campione. Abetest, aggiungere 5,75 ml di 35% Histodenz al tubo, e la seconda, accuratamente aggiungere 5,75 ml di soluzione al 10% Histodenz sopra. Poi adagiare i tubi in orizzontale verso il basso per 1 ora. </li><li> Dopo incubazione della omogenato con il reagente di bloccaggio e l&#39;anticorpo primario, centrifugare a 600 g per 15 min a 4 ° C per il campione pellet. Eliminare il supernatante e risospendere il pellet in 1,5 mL di tampone HS. Trasferire i campioni in una nuova Provetta da 15 ml e prendere un campione di 40 microlitri per l&#39;analisi microscopica in seguito. </li><li> Incubare il pellet con l&#39;anticorpo secondario - MACS capra anti-IgG di coniglio micro perline (diluizione 1:25) - per 30 minuti su un agitatore a 4 ° C. Nel frattempo, mettere le colonne MACS sul supporto magnetico ed equilibrare con 0,5 mL di tampone HS. </li><li> Successivamente, i campioni applicare alla colonna. Raccogliere 150 pl del flusso passante per la successiva analisi microscopica. Lavare la colonna tre volte con 0,5 mL di tampone HS. </li><li> Rimuovere le colonne da tegli magnete e eluato i veicoli commerciali leggeri con 0,5 mL di tampone HS di immediata squirting. Prendete un campione di 20 microlitri per l&#39;analisi microscopica. La fase di purificazione per immuno-separazione magnetica si prevede di cedere per 1 × 10 7 infettato D. cellule discoideum circa 1 × 10 6 LCV intatte, che sono circa sette volte arricchiti nell&#39;eluato rispetto al flusso passante 13. </li><li> Mettere i tubi gradiente Histodenz indietro in una posizione verticale e accuratamente caricare l&#39;eluato sopra. Centrifugare le provette a 3350 × g per 1 ora a 4 ° C. </li><li> Dopo centrifugazione prendere 1,5 mL frazioni a partire dal fondo della provetta mediante un lungo vetro pipetta Pasteur. Complessivamente raccogliere frazioni otto, ciascuno dal fondo del tubo. Non sono stati osservati livelli visibili nella pendenza costante Histodenz. La massima resa di questi veicoli è tipicamente previsto nella frazione 4 ad un rapporto di circa 2 x 10 5 LCV intatte per 1 × 10 7 ininfetto amebe 13. Minori quantità di veicoli commerciali leggeri sono presenti anche in frazioni 3 e 5, rispettivamente. Pertanto, la resa complessiva di LCV purificate è ~ 1 × 10 6 LCV intatte per 6 × 10 7 infettato D. cellule discoideum 13. Il recupero di veicoli commerciali può essere eseguita a temperatura ambiente (RT), e le LCV appaiono stabile per molte ore. </li></ol> 3. L&#39;analisi microscopica dei campioni raccolti <ol><li> Preparare un 24 pozzetti a fondo piatto piastra di coltura dei tessuti con coprioggetto rivestiti di poli-L-lisina. </li><li> Pipettare ogni campione prelevato durante la purificazione LCV più 150 pl di ciascuna frazione gradiente di densità nella piastra da 24 pozzetti. Aggiungere 0,5 ml di tampone HS ad ogni pozzetto per diluire la concentrazione Histodenz. Successivamente, centrifugare la piastra a 600 g per 10 min a 4 ° C. Rimuovere con cautela il surnatante e fissare i campioni con 4% paraformaldeide (PFA) per 20 minuti a RT. Dopo fissazione lavare i campioni due volte. Noie SORC per D. discoideum e PBS per RAW264.7 macrofagi. </li><li><ol class="lalpha"><li> Montare i campioni di GFP-calnexina esprimono D. discoideum, prese a diverse fasi durante l&#39;isolamento LCV, direttamente sul vetro diapositive utilizzando Vectashield ad es. </li><li> Incubare i campioni da RAW264.7 macrofagi, fatte a passi differenti durante l&#39;isolamento LCV, con una soluzione bloccante (1% BSA in PBS) per 10 minuti a RT. Utilizzare un anticorpo anti-SIDC primaria a macchiare i veicoli commerciali e incubare per 1 ora in una camera umida a temperatura ambiente (purificato per affinità di coniglio anti-SIDC; 1:1000 in tampone di bloccaggio). Successivamente, lavare i campioni tre volte con PBS. Incubare con un anticorpo secondario (per esempio anti-coniglio Cy5, 1:200 in soluzione bloccante) per 30 minuti in una camera umida e buio, a RT. Infine, lavare i campioni tre volte con PBS e li montano sul vetro diapositive utilizzando Vectashield ad es. </li></ol></li><li> Morfologia, l&#39;integrità e la quantità dei veicoli commerciali leggeri isolati da GFP-calnexina esprimere D. DIScoideum o da RAW264.7 macrofagi vengono analizzati mediante un microscopio a fluorescenza equipaggiato con i filtri adeguati. </li></ol> 4. Risultati rappresentativi La qualità e la resa di purificazione LCV mediante immuno-affinità separazione e centrifugazione in gradiente di densità può essere seguito mediante microscopia a fluorescenza (Fig. 1). Una panoramica dei campioni raccolti durante l&#39;isolamento LCV dal D. discoideu m o macrofagi viene mostrato (Fig. 2). L&#39;omogenato di L. pneumophila con infezione da fagociti mostra intatte veicoli commerciali leggeri, ma anche un sacco di detriti cellulari e batteri extracellulari. Dopo pellet il campione, l&#39;immagine è simile al omogenato, a volte un po &#39;più densa. Poiché LCV intatte dovrebbe aderire alla colonna, il flusso attraverso lo contiene batteri extracellulari ed i detriti cellulari. Dopo eluizione del campione dalla colonna, l&#39;eluato contiene LCV intatte in grandi quantità. Nelle nostre mani, la LCV purificati<html> sulla sembra essere più efficace per D. discoideum che per macrofagi. In D. discoideum i vacuoli patogeno appaiono più rotondo e la resa dei veicoli commerciali leggeri isolati più di 10 volte superiore rispetto ai macrofagi (Fig. 3). In macrofagi intatti LVCs colorati con anticorpi diversi appaiono anche più di forma irregolare. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/4118/4118fig1.jpg" /> Figura 1. Schema di isolamento LCV. A) Isolamento di veicoli commerciali leggeri da immuno-separazione magnetica utilizzando un anticorpo purificato per affinità contro il SIDC batterica proteine ​​effettrici, la localizzazione esclusivamente alla membrana LCV. Un secondo MACS micro perline accoppiato anticorpo e un magnete vengono utilizzati per isolare i veicoli commerciali da detriti cellulari. B) Dopo immuno-magnetiche veicoli commerciali leggeri di separazione sono ulteriormente purificati mediante centrifugazione in gradiente di densità Histodenz. Veicoli commerciali leggeri sono arricchiti in un&#39;aliquota del 4. upload/4118/4118fig2.jpg &quot;/&gt; I campioni Figura 2. Raccolte durante la purificazione LCV. Immagini da omogenato, pellet, a flusso continuo e eluato da D. discoideum o macrofagi sono raffigurate. I campioni mostrano L. pneumophila produce DsRed-Express (rosso) in D. discoideum produzione di GFP-calnexina segnale (verde, pannello superiore) o in macrofagi colorato con un anticorpo anti-SIDC (ciano, pannello inferiore). Bar, 10 pm. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/4118/4118fig3.jpg" /> Figura 3. Purificato veicoli commerciali leggeri da D. discoideum o macrofagi. I campioni mostrano un&#39;aliquota del 4, dopo centrifugazione in gradiente di densità Histodenz di L. pneumophila produce DsRed-Express (rosso) (A) D. discoideum produzione di GFP-calnexina segnale (verde) o (B) in macrofagi colorato con un anticorpo anti-SIDC (ciano). Bar, 10 pm.

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<li>Urwyler, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteome+analysis+of+Legionella+vacuoles+purified+by+magnetic+immunoseparation+reveals+secretory+and+endosomal+GTPases%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">Proteome analysis of Legionella vacuoles purified by magnetic immunoseparation reveals secretory and endosomal GTPases.</a> Traffic. 10, 76-87 (2009).</li>
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</ol>

Non ci sono conflitti di interesse dichiarati.

In contrasto con i metodi pubblicati in precedenza, questo protocollo si basa su due fasi, prima la separazione dei veicoli commerciali leggeri da parte di un approccio immuno-magnetico, e la seconda, la purificazione dei veicoli commerciali leggeri di centrifugazione in gradiente di densità. L&#39;isolamento LCV può essere facilmente seguita da microscopia a fluorescenza, quando sia i batteri fluorescente GFP e cellule produttrici di anticorpi o di colorazione viene utilizzato. Il protocollo qui descritto è un semplice...

purificazione di vacuoli patogeno da<em&gt; legionella</em&gt;-infetti fagociti

Purification of Pathogen Vacuoles from Legionella-infected Phagocytes

L&#39;agente patogeno opportunistico Legionella pneumophila è un ameba-batterio resistente, che replica anche nei macrofagi alveolari causando la grave polmonite &quot;&#39;malattia del legionario&quot; 1. In fagociti protozoi e mammiferi, L. pneumophila si avvale di un meccanismo conservato in modo da formare uno specifico, la replica-permissive vano, la &quot;Legionella contenente vacuolo&quot; (LCV). Richiede la formazione di LCV batterica Icm / Dot sistema di secrezione di tipo IV (T4SS), che trasloca ben 275 &quot;effettrici&quot; proteine ​​in cellule ospiti. Gli effettori manipolare proteine ​​di accoglimento, nonché lipidi e comunicare con secretoria, organelli endosomiali e mitocondriale 2-4. La formazione di veicoli commerciali leggeri rappresenta un processo complesso, robusto e ridondante, che è difficile da afferrare in maniera riduzionista. Un approccio integrato è necessario per comprendere esaurientemente la formazione di LCV, compresa un&#39;analisi globale del percorsoplasminogeno interazioni ospite-fattori e le loro dinamiche temporali e spaziali. Come primo passo verso questo obiettivo, veicoli commerciali leggeri intatte vengono purificati e analizzati dalla proteomica e lipidomica. La composizione e la formazione di patogeno contenenti vacuoli è stata studiata mediante analisi proteomica mediante cromatografia liquida o 2-D elettroforesi su gel accoppiato a spettrometria di massa. Vacuoli isolati sia dal suolo un&#39;ameba sociale Dictyostelium discoideum o fagociti di mammifero ospitato Leishmania 5, 6 Listeria, Mycobacterium 7, Rhodococcus 8, 9 o Salmonella Legionella spp. Dieci. Tuttavia, i protocolli di purificazione impiegati in questi studi sono tempo e noiosa, in quanto richiedono ad esempio microscopia elettronica per analizzare morfologia LCV, l&#39;integrità e purezza. Inoltre, questi protocolli non sfruttare le caratteristiche specifiche del vacuolo patogeno per l&#39;enrichment. Il metodo qui presentato supera queste limitazioni impiegando D. discoideum produrre un marcatore fluorescente LCV e prendendo di mira il SIDC batterica proteine ​​effettrici, che selettivamente ancoraggio alla membrana LCV legandosi alla fosfatidilinositolo 4-fosfato (PtdIns (4) P) 3,11. LCV sono arricchite in una prima fase di immuno-separazione magnetica utilizzando un purificati per affinità anticorpo primario contro SIDC e un anticorpo secondario accoppiato a biglie magnetiche, seguita in una seconda fase dalla classica centrifugazione in gradiente di densità Histodenz 12,13 (Fig. 1) . Uno studio del proteoma di veicoli commerciali leggeri isolati dal D. discoideum rivelato più di 560 proteine ​​della cellula ospite, comprese le proteine ​​associate con vescicole fagocitica, mitocondri, ER e Golgi, nonché GTPasi diversi, che non sono stati implicati nella formazione LCV prima 13. LCV arricchito e purificato con ilprotocollo descritto qui può essere ulteriormente analizzati al microscopio (immunofluorescenza, microscopia elettronica), metodi biochimici (Western Blot) e gli approcci di proteomica o lipidomic.

Questo articolo descrive un metodo per l&#39;isolamento e la purificazione di intatto<em&gt; Legionella</em&gt; Contenenti vacuoli (LCV) da amebe e macrofagi. Le due fasi protocollo comprende arricchimento LCV mediante immuno-separazione magnetica utilizzando un anticorpo contro un marcatore batterica LCV e ulteriore purificazione mediante centrifugazione a gradiente di densità.

Purificazione di Vacuoli patogeno da<em&gt; Legionella</em&gt;-Infetti fagociti

Il patogeno opportunista Legionella pneumophila è un batterio resistente alle amebe, che si replica inoltre nei macrofagi alveolari, causando così la grave...

L'obiettivo generale del seguente esperimento è isolare VAE o LCD contenenti legionella integri da fagociti infetti. Questo risultato si ottiene innanzitutto omogeneizzando i fagociti infetti con un omogeneizzatore a sfera di acciaio inossidabile. Nella seconda fase, l'omogenato viene incubato con un anticorpo primario specifico per una proteina effettrice batterica localizzata sulla membrana del VCL, seguito da un'incubazione con un anticorpo secondario accoppiato a microsferette magnetiche.Successivamente, gli lc decorati con anticorpo vengono trattenuti da un campo magnetico e quindi lavati ed eluiti. Infine, gli LCD arricchiti magneticamente possono essere ulteriormente purificati mediante centrifugazione su gradiente di densità.Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti è che le caratteristiche molecolari specifiche dei compartimenti dei parassiti infetti possono essere sfruttate per purificare batteri patogeni intatti. Quattro giorni prima dell'isolamento di LCV, effettuare un’impronta su piastre di agar estratto di lievito con carbone attivo contenenti legionella pneumophila produttrice di DS red proveniente da scaglie glicerolo, aggiungendo cinqu

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Immunology and Infection

Immunologia e Infezioni

Fonte: Jung, A. L. et. al., Vescicole della membrana esterna di Legionella pneumophila: isolamento e analisi del loro potenziale pro-infiammatorio sui macrofagi. J. Vis. Exp. (2017)Questo video mostra il pre-trattamento dei macrofagi con vescicole di membrana esterna (OMV) di Legionella pneumophila per esaminare il loro effetto sulla replicazione batterica. Alterando la segnalazione immunitaria dell'ospite, gli OMV rendono i macrofagi più permissivi all'infezione. Un numero più elevato di...

Saggio della replicazione di Legionella pneumophila nei macrofagi pretrattati con vescicole della membrana esterna

Fonte: Jung, A. L., et al. Vescicole della membrana esterna di Legionella pneumophila: isolamento e analisi del loro potenziale pro-infiammatorio sui macrofagi. J. Vis. Esp. (2017)Questo video dimostra l'isolamento delle vescicole della membrana esterna (OMV) da Legionella pneumophila tramite centrifugazione sequenziale, filtrazione sterile e ultracentrifugazione. Gli OMV purificati, arricchiti con proteine di membrana e lipopolisaccaridi, sono adatti per studi di interazione ospite-patogeno.

Isolamento basato su ultracentrifugazione delle vescicole della membrana esterna di Legionella pneumophila

Fonte: Sigal, N., et al. Purificazione dell'RNA da Listeria monocytogenes coltivata intracellularmente nelle cellule macrofage.  J. Vis. Esp. (2016).Questo video dimostra l'isolamento di batteri patogeni interiorizzati da macrofagi derivati dal midollo osseo (BMDM) infetti. I batteri vengono lasciati attaccare alle cellule ospiti, mentre i batteri non attaccati vengono lavati via. Dopo l'internalizzazione, viene aggiunto un antibiotico per eliminare i batteri non interiorizzati. Le cellule...

Isolamento di batteri patogeni intracellulari da cellule ospiti infette

Source: Pett, N., et al. T4 Bacteriophage and E. coli Interaction in the Murine Intestine: A Prototypical Model for Studying Host-Bacteriophage Dynamics In Vivo. J. Vis. Exp. (2024)This video demonstrates the purification of bacteriophages from bacterial cell lysates using sequential centrifugation, membrane filtration, chloroform extraction, centrifugal filtration, and buffer exchange to obtain a purified phage preparation.

Purification of Bacteriophages from Bacterial Lysate

Questa tecnica fornisce un metodo per raccogliere, normalizzare e quantificare la crescita intracellulare di batteri patogeni che sono pre-coltivate in cellule naturali ospiti protozoi prima di infezioni di cellule di mammifero. Questo metodo può essere modificato per accogliere una grande varietà di cellule ospiti per la fase di adescamento e tipi di cellule bersaglio.

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Uso di<em&gt; Galleria mellonella</em&gt; Come organismo modello per studiare<em&gt; Legionella pneumophila</em&gt; Infezione

Descriviamo la quantificazione di Salmonella typhimurium citosolica e vacuolare nei macrofagi derivati dal midollo osseo utilizzando la permeabilizzazione differenziale della digitonina.

Quantificazione dei citosolico vs. vacuolare<em&gt; Salmonella</em&gt; In primarie macrofagi di Permeabilization differenziale

Qui, descriviamo la purificazione di Legionella pneumophila (L. pneumophila) vescicole membrana esterna (OMVS) da colture liquide. Tali vescicole purificate sono poi utilizzati per il trattamento dei macrofagi per analizzare il loro potenziale pro-infiammatoria.

Legionella pneumophila membrana esterna Vescicole: Isolamento e analisi del loro potenziale pro-infiammatori sui macrofagi

Descriviamo qui un metodo semplice e rapido per l'isolamento di Salmonella typhimurium-contenente fagosomi dai macrofagi rivestendo i batteri con biotina e streptavidina.

Isolamento di Salmonella typhimurium-contenente fagosomi dai macrofagi

L'imaging delle cellule batteriche è un approccio biologico dei sistemi emergenti incentrato sulla definizione di processi statici e dinamici che dettano la funzione di grandi macchine macromolecolari. Qui, l'integrazione dell'imaging quantitativo delle cellule vive e della tomografia crioelettronica viene utilizzata per studiare l'architettura e le funzioni del sistema di secrezione Legionella pneumophila tipo IV.

Applicazione di Live Cell Imaging e tomografia Cryo-Electron a risolvere le caratteristiche spatiotemporali del sistema di secrezione Legionella pneumophila Dot/Icm

Scopri il metodo di purificazione dei vacuoli contenenti Legionella da fagociti infetti tramite omogenizzazione, separazione immuno-magnetica e centrifugazione a gradiente di densità. Questa tecnica consente di isolare intatti LCV con elevata purezza per studiare i meccanismi patogenetici.

Purificazione di Vacuoli patogeno da

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