Name: DNA Vector-based RNA Interference per studiare la funzione del gene in Cancro (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-06-04T13:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 10 s
Description: Impara a utilizzare l'RNA interference basata su vettore DNA per studiare la funzione genica nel cancro. Questo metodo permette il silenziamento genico a lungo termine e inducibile in vivo mediante costrutti shRNA e lentivirus.

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Questo lavoro è stato sostenuto in parte da Grants Scholar di ricerca (RSG-116403-09-082-01-MGO) dalla American Cancer Society e fondi intramurali della Wake Forest University Health Sciences a GS. DBS è stato sostenuto da NCI formazione concessione 5T32CA079448.

1. Generazione di costrutti shRNA <ol><li> Identificare un siRNA sequenza-target (20-23 nucleotidi) sulla base di criteri precedentemente pubblicati 6 o utilizzare un web server basato su algoritmo, ad esempio &quot;Finder siRNA Target&quot; da Ambion e GenScript. </li><li> Sintetizzare oligonucleotidi basato sul disegno della Figura 1 e sequenze esempio in Tabella 1. Effettuare amplificazione PCR utilizzando oligonucleotidi P1 e P2 (30 cicli di denaturazione a 94 ° C per 30 sec, ricottura a 60 ° C per 30 sec, e allungamento a 72 ° C per 30 sec) e un plasmide trasportante il U6 o H1 promotore come modello. Purificare il prodotto di PCR utilizzando una colonna di purificazione PCR. Digerire con BamHI e HindIII e purificare il DNA digerito con una colonna di purificazione PCR. Ricuocere il oligonucleotidi P3 e P4 (2,5 pmol / pl di ciascun in 100 pl di 50 mM Tris • HCl, pH 8,0) mediante bollitura per 5 minuti e lentamente raffreddare a temperatura ambiente. Digerire un lentivirale vector, come quello descritto nella figura 2A, con BamHI e EcoRI, ed eseguire gel-purificazione. </li><li> Effettuare un 3-ligazione con il frammento BamHI / EcoRI digerito-vettore, un BamHI / HindIII-digerito frammento PCR e una coppia di oligonucleotidi ricotto (formando HindIII e siti EcoRI alle due estremità) ad un rapporto molare 1:10:10 (Figura 1). </li><li> Trasforma altamente efficiente competente E. coli DH5a utilizzando il prodotto ligato. Schermare le colonie utilizzando gli oligonucleotidi P5 (nel vettore) e P6 (nel promotore H1 o U6). 7 </li><li> Preparare DNA plasmidico dalle colonie positive con un kit commerciale e confermare la presenza dell&#39;inserto da BamHI / EcoRI digestione e DNA elettroforesi su agarosio. Sequenza la regione contenente il promotore e shRNA utilizzando oligonucleotide P5. </li><li> Utilizzare plasmide DNA Midi o Maxi-kit di preparazione (privo di endotossine è preferito) per preparare il DNA lentivirus portando l&#39;espressione shRNAcassetta. Determinare la concentrazione di DNA misurando l&#39;assorbimento a 260 nm. Controllare la purezza del DNA utilizzando il rapporto di 260 nm/280 nm e assicurarsi che rientra nella gamma compresa tra 1,8 e 2.0. Controllare l&#39;integrità lentivirus plasmide mediante elettroforesi su gel di agarosio. DNA per la trasfezione dovrebbe essere super-spirale. </li></ol> 2. Lentivirus Transfection Precauzioni: vettori lentivirali sono derivati ​​dal virus dell&#39;immunodeficienza umana-1 (HIV-1) e la replicazione del genoma incompetente. Essi sono stati ampiamente utilizzati in gene delivery a causa della capacità di infettare sia divisione e non-divisione delle cellule. Tuttavia, due gravi rischi esistono negli studi che utilizzano lentivirus. (1) Il potenziale per la generazione di replicazione-competenti lentivirus. Questo rischio può essere notevolmente ridotto se il sistema di terza generazione lentivirale viene utilizzato. (2) Il potenziale di oncogenesi. Questo rischio può essere aggravato se gli inserti trasportate sono oncogeno o reprimere soppressori tumorali.Le attività di ricerca coinvolte nel lentivirus HIV-based dovrebbero seguire le &quot;Considerazioni sulla biosicurezza per la ricerca con vettori lentivirali&quot; del NIH ( <a href="http://oba.od.nih.gov/rdna_rac/rac_guidance_lentivirus.html" target="_blank">http://oba.od.nih.gov/rdna_rac/rac_guidance_lentivirus.html</a> ) e richiedono l&#39;approvazione da parte del Comitato Biosicurezza di istituzione di un ricercatore. Generalmente, maggiore livello di biosicurezza-2 (BSL-2) di contenimento è richiesto per l&#39;impostazione laboratorio se si utilizzano vettori lentivirali. <ol><li> Tavola 4 × 10 6 cellule HEK 293T con DMEM completo (DMEM fornito con 10% siero bovino fetale (FBS), 2 mM L-glutammina, 100 unità / ml di penicillina, 100 pg / ml di streptomicina) in 10 cm e piatti di coltura durante la notte a 37 ° C in 5% CO 2 incubatore. Sostituire il mezzo con 5 ml di pre-riscaldato Opti-MEM ho ridotto siero Media (Invitrogen). </li><li> Preparare la soluzione A: 10 microgrammi di shRNA contenenti vettori lentivirali, 5 mg ciascuna delle gene terzozione lentivirus plasmidi imballaggio (preparato con elevata purezza, i tre plasmidi di imballaggio comprendono VSV-G: per una proteina di involucro, PRSV-Rev: per rev, e pMDLg / pRRE: per gag / pol, che sono essenziali per l&#39;imballaggio lentivirus), 36 pl di 2M CaCl 2, e 300 pl di acqua sterile. </li><li> Preparare la soluzione B: 300 microlitri di 2 × Hepes Buffered Saline (281 mM NaCl, 100 mM di HEPES, 1,5 mM Na 2 HPO 4, pH regolato a 7,12 per 0,5 N NaOH e sterilizzato di 0,22 um filtro). </li><li> Lentamente goccia di soluzione A alla soluzione B, mentre bolle d&#39;aria attraverso Soluzione B con una pipetta. Lasciare il tubo a temperatura ambiente per 30 min. </li><li> Lentamente cadere le soluzioni miste A / B nel piatto di coltura cellulare HEK 293T preparato nella fase 2,1 e incubare a 37 ° C in 5% CO 2 incubatore per 4-6 h. </li><li> Sostituire il terreno con 7 ml di terreno DMEM completo. Dopo 24 ore, aggiungere un ulteriore 5 ml di terreno DMEM completo. Raccogliere il cont mediaaining il lentivirus, dopo altre 24 h della cultura. </li><li> Gira il supporto a 1.500 giri, temperatura ambiente per 10 min. Filtrare il supernatante utilizzando un filtro da 0,45 um e ruotare il flusso attraverso il mezzo contenente lentivirus mediante ultracentrifugazione a 25.000 rpm (pari a 125.000 xg con un rotore SW28 secchio oscillante, ultracentrifuga Beckman XL-90), 4 ° C per 90 min. Decantare il surnatante in un contenitore con il 5% di candeggina (concentrazione finale). </li><li> Risospendere il pellet lentivirus in 0,5-1,0 ml di PBS freddo e fare aliquote lentivirus in 50-100 ul per provetta. Conservare a -80 ° C. </li><li> Il titolo del lentivirus può essere determinata kit commerciale (come kit di quantificazione Lentivirus QuickTiter da Biolabs cellulari, Inc.), da una PCR in tempo reale protocollo 8, oppure determinando la co-espresso marcatore fluorescente mediante microscopia a fluorescenza o citometria di flusso . In genere, uno di 10 cm piatto di coltura in grado di produrre circa 0,5-1,0 × 10 8 infezioniunità infettive (UI). </li></ol> 3. Infezione e caratterizzazione di cellule infette <ol><li> Seme le cellule infettate da in 2 ml di mezzo completo in una piastra da 6 pozzetti con 30-40% di confluenza (circa 5-8 x 10 5 cellule, a seconda delle dimensioni delle celle). Coltivare le cellule notte a 37 ° C in 5% CO 2 incubatore. </li><li> Sostituire il mezzo con 1 ml di mezzo fresco contenente 8 ug / ml di polibrene (Sigma, Cat # H9268) o 5 pg / ml di protamina (Sigma, Cat. # P4020). </li><li> Determinare una molteplicità adeguato di infezione (MOI) intervallo 9 per una linea cellulare particolare utilizzando lentivirus con marcatore fluorescente. Calcolare empiricamente o determinare la quantità di lentivirus da utilizzare per infettare la linea cellulare. Lentamente cadere il lentivirus nella piastra e scuoterla delicatamente per 10 sec. </li><li> Incubare la piastra a 37 ° C in 5% CO 2 incubatore per 6 ore e quindi sostituire il mezzo normale con mezzo completo. </li><li> Almeno due days dopo l&#39;infezione, controllare le cellule usando la microscopia a fluorescenza per i lentivirus che esprimono marcatori fluorescenti e / o aggiungere l&#39;antibiotico corrispondente al mezzo di vettori lentivirali che esprimono geni resistenti agli antibiotici. Per un vettore inducibile, ad esempio un sistema Tet-On (figura 2), coltura le cellule a terreno preparato con tetraciclina privo FBS. Dividere le celle 2-3 giorni dopo l&#39;infezione. Prendere una porzione delle cellule per testare knockdown gene inducibile da coltura in terreno con e senza 1,5 pg / ml doxiciclina (Dox) per ≥ 2 giorni. </li><li> Controllare l&#39;atterramento gene mediante Western blot, Real-Time PCR o immunostaining ≥ 2 giorni dopo l&#39;infezione, 2 giorni dopo la selezione antibiotica, o (per un Tet-On sistema inducibile) ≥ 2 giorni dopo l&#39;aggiunta Dox. </li><li> Utilizzare approcci diversi, come saggi di proliferazione cellulare, morbide studi di coltura di agar, saggi di migrazione, saggi di invasione e studi formazione del tumore) per determinare gli effetti della kn gene bersaglioockdown sulla malignità delle cellule. </li></ol> 4. Xenotrapianto mouse Studio Modello <ol><li> Pulire tutte le superfici del mouse per anestesia e iniezione di etanolo al 70% per prevenire l&#39;infezione di topi. Anestetizzare topi nudi atimici (NCI-Frederick) usando 2% isoflurano miscelato con ossigeno in anestesia induzione camera 10 min prima della inoculazione delle cellule. Mantenere l&#39;anestesia utilizzando 1% isoflurano misto con l&#39;ossigeno attraverso un cono di naso. Eseguire questo passo in una stanza con un&#39;eccellente ventilazione e montare filtri scavenger isofluorano alla camera di induzione. </li><li> Propagare le cellule che trasportano shRNAs. Utilizzare tetraciclina terreno privo di Tet-On vettori inducibili. Tripsinizzare le cellule e risospendere in mezzo completo contenente 50% Matrigel. Posizionare i topi nudi su un cuscinetto riscaldante (30 ° C) e iniettare 200 pl delle cellule (1-10 × 10 6, a seconda della malignità delle cellule) in topi con 1-2 siti di iniezione per topo. Utilizzare siringhe con 25.5-calibro aghi per iniezioni sottocutanee, e aghi di calibro 28-30 per iniezioni ortotopici. </li><li> Per costitutivi vettori shRNA, utilizzano 2 gruppi di topi iniettati con le cellule che esprimono il gene bersaglio shRNA e strapazzate shRNA. Per Tet-On vettori shRNA inducibili, utilizzano 4 gruppi di topi iniettati con cellule che portano il gene bersaglio shRNA e criptato shRNA, alimentato con acqua normale e Dox (1,5 mg / ml) contenente acqua (2 × 2 shRNAs trattamenti = 4 gruppi) . Sostituire il Dox acqua contenente due volte la settimana. </li><li> Monitorare la lunghezza e larghezza dei tumori settimanali o bisettimanali da un nonio calibro digitale e calcolare i volumi del tumore (V) con la formula V = 1/2 (lunghezza x larghezza 2) 10. Assicurarsi che il volume del tumore non superi gli orientamenti del ACUC istituzionale (ad esempio, il 10% del peso corporeo). Euthanize qualsiasi mouse utilizzando un protocollo approvato dalla ACUC istituzionale se mostra segni di ulcerazione o necrosi estesa, infectio evidenten, sanguinamento incontrollato o allo stadio terminale malattia. </li><li> La crescita tumorale e metastasi possono essere monitorati per le cellule tumorali che esprimono un inoculate bioluminescente marcatore 11, quale luciferasi di lucciola. Pulire tutte le superfici per anestesia del mouse e di imaging del 70% di etanolo per prevenire l&#39;infezione di topi. Anestetizzare i topi come descritto al punto 4.1. Iniettare luciferina (150 mg / kg) per via intraperitoneale. Mettere i topi in una camera di imaging disinfettata di un sistema di imaging commerciale, come un sistema IVIS Imaging (Caliper Life Sciences, Inc.). Attivare la leva per mantenere l&#39;anestesia anestesia dell&#39;1% isoflurano mescolato con ossigeno. Condurre questa fase in una stanza con un&#39;eccellente ventilazione. </li><li> Prendere la prima immagine esponendo 5 min e controllare l&#39;intensità del segnale. Regolare il tempo di esposizione per ottenere immagini con segnale ottimale rispetto al fondo. Determinare il tempo di imaging empiricamente, che è generalmente 1-5 min per tumori sottocutanei. </li><li> Euthanize i topi da un protocollo approvatodal ACUC istituzionale quando le dimensioni del tumore raggiunge circa 1.000 mm 3, o come specificato dalle linee guida ACUC. Excise tumori lo xenotrapianto, li pesano e scattare foto. Trattare i campioni tumorali di diversi studi, come ad esempio le analisi patologiche per determinare la morfologia delle cellule tumorali, e Western blot e Real-Time PCR per testare studi di espressione genica. </li></ol> 5. Risultati rappresentativi Questo protocollo è stato utilizzato per studiare gli effetti della YY1 knockdown sul trapianto di formazione del tumore della Firefly luciferasi che esprimono MDA-MB-231 cellule (cellule di adenocarcinoma della mammella; Caliper Life Sciences) in topi nudi atimici. La sequenza bersaglio di shRNA YY1 umana è &quot;GGG AGA AGC AGC AGG TGC AGA T&quot;. Una sequenza criptato &quot;GGG ACT ACT CTA TTA CGT CAT T&quot; è stato creato anche per un controllo (cont) shRNA, che non hanno una somiglianza notevole a qualsiasi trascrizione conosciuto. Gli oligonucleotidi utilizzati per rendere Tet-On costrutti shRNA inducibili, con YY1 come esempio, Sono mostrati nella Tabella 1. Come risultato, due vettori lentivirali, PLU-Puro-Indu-YY1 shRNA e PLU-Puro-Indu-cont shRNA, sono stati costruiti e sono stati utilizzati per la produzione di lentivirus. Abbiamo usato per infettare tali lentivirus singolarmente due MDA-MB-231 cloni cellulari (cloni 1 e 3) che esprimono sia regolatore tetraciclina (tetR) e luciferasi di lucciola. Popolazioni cellulari policlonali sono stati ottenuti dopo la selezione puromicina. Figura 3A mostra Dox indotta YY1 smontabile in questi MDA-MB-231 cellule infettate da plu-Puro-Indu-YY1 shRNA lentivirus. Abbiamo poi utilizzato le cellule policlonali del clone 3 infettati singolarmente da questi inducibile shRNA YY1 e cont lentivirus shRNA e ha osservato che YY1 esaurimento ridotta invasività della MDA-MB-231 cellule (Figura 3B). Analisi Western Blot ha confermato Dox indotta YY1 silenziamento in MDA-MB-231 cellule con l&#39;indu-YY1 shRNA, mentre le celle che contengono indu-cont shRNA non hanno mostrato questo effetto (Figura 3C). Abbiamo poi usato<html> queste cellule per lo studio xenotrapianto modello murino. Rispetto ai gruppi di controllo, i topi impiantati dalle MDA-MB-231 cellule con indu-YY1 shRNA e fornito con Dox acqua contenente mostrato una ridotta formazione di tumori, quando visualizzato mediante bioluminescenza (Figura 4A) e determinata da pesi tumorali (Figura 4B ). YY1 silenziamento in questi tumori xenotrapianto è stato confermato da studi Western blot mostrato nella figura 4C. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/4129/4129fig1.jpg" /> Figura 1. Schema per la generazione di un costrutto shRNA e trascrizione shRNA. Il primer P1 a P6 sono mostrati (vedere Tabella 1 per sequenze esempio). Pol III: RNA polimerasi III (d):. End digerito. Disegno non è in scala. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/4129/4129fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere l&#39;immagine ingrandita</a> . 2 &quot;src =&quot; / files/ftp_upload/4129/4129fig2.jpg &quot;/&gt; Figura 2. Diagrammi di (A) un vettore lentivirale e (B) il meccanismo del Tet-On promotore inducibile H1 utilizzato per il silenziamento genico. Il vettore lentivirale stato ricostruito sulla base pLL3.7 14. H1-Pr: promotore H1; UBC-Pr: Human promotore di ubiquitina C; Puro: puromicina; TRE: elemento che risponde alle tetracicline; Dox: doxiciclina. TetR: regolatore di tetraciclina. 5&#39;LTR, 3&#39;SIN-LTR e WRE sono componenti essenziali di un 14 vettori lentivirali. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/4129/4129fig3.jpg" /> Figura 3. Dox-indotta YY1 silenzio e il suo effetto sulla invasività della MDA-MB-231 cellule. A. YY1 livelli in due popolazioni cellulari policlonali derivate da TetR-esprimere cloni 1 e 3 infettati da plu-Puro-Indu-YY1 shRNA lentivirus e coltivate in assenza e presenza di Dox. B. Boyden test camera di MDA-MB-231 celle con shRNAs inducibili. (* P &lt;00,05 rispetto agli altri tre gruppi). C. rappresentativi Western blot di YY1 espressione in queste quattro popolazioni di cellule. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/4129/4129fig4.jpg" /> Figura 4. Effetti del silenziamento indotto YY1 sulla formazione di tumori trapiantati da MDA-MB-231 cellule. A. Schema di impianto cella (a sinistra) e rappresentativi bioluminescenti immagini catturate dal sistema di imaging IVIS a 4 settimane (a destra) inoculazione delle cellule post. B. pesi tumorali xenotrapianto a 4 settimane. * P ≤ 0,05. C. occidentali blot di YY1 e β-actina di espressione in eterotrapianti di MDA-MB-231 cellule con indu-YY1 shRNA in assenza e presenza di DOX. Le etichette sulla parte superiore sono i nomi dei singoli topi. <table border="1"><tbody><tr><td> Oligonucleotide </td><td> Sequence (5 &#39;- 3&#39;) </td><td> Utilizzo e la posizione </td></tr><tr><td> P1 (Tet-On H1) </td><td> cagt GGATCC CGA ACG CTG ACG TCA TCA ACC C </td><td> PCR; alla estremità 5 &#39;del promotore H1 </td></tr><tr><td> P1 (U6) </td><td> cagt GGATCC GAC GCC GCC ATC TCT AGG </td><td> PCR; alla estremità 5 &#39;del promotore U6 </td></tr><tr><td> P2 (per YY1 con Tet-On H1) </td><td> CAGC AAGCTT GAA atc TGC acc TGC ttc TGC tcc c GGG ATC ATC TCT ACT GAT AGG GAA C </td><td> PCR; alla estremità 3 &#39;del promotore Tet-On inducibile H1 </td></tr><tr><td> P2 (per YY1 con U6) </td><td> CAGC AAGCTT GAA atc TGC acc TGC ttc TGC tcc c aaa caa GGC ttt TCT cca agg gat uno </td><td> PCR; alla estremità 3 &#39;del promotore U6 </td></tr><tr><td> P3 (per YY1) </td><td> agc tt ATC TGC acc TGC ttc TGC tcc c ttttt g </td><td> Per essere ricotto con P4 </td></tr><tr><td> P4 (per YY1) </td><td> aattc AAAAA <strong&gt; ggg agc aga agc agg TGC aga ta </td><td> Per essere temperati con P3 </td></tr><tr><td> P5 (per pLL3.7) </td><td> ggg tac AGT gca ggg gaa aga ata g </td><td> Per lo screening PCR, utilizzato con P6 </td></tr><tr><td> P6 (per Tet-On H1) </td><td> GAT TTC CCA GAA CAC ATA GCG AC </td><td> Per lo screening PCR, utilizzato con P5 </td></tr><tr><td> P6 (per U6) </td><td> AGG GTG AGT TTC CTT TTG TGC TG </td><td> Per lo screening PCR, utilizzato con P5 </td></tr></tbody></table> Tabella 1. Oligonucleotidi sintetizzati utilizzati per generare costrutti shRNA. P1 e P6 sequenze per la U6 mouse e Tet-On promotori inducibili H1 umani sono forniti. Umana YY1 viene utilizzato come un esempio con una sequenza bersaglio di shRNA GGG AGC AGC AGG AGA AGA TGC T. Le sequenze specifiche di YY1 sono evidenziati. Due sequenze P2 di YY1 sono progettati per i due promotori, rispettivamente. Il costitutiva U6 / YY1 shRNA è stato descritto precedentemente erano 15, mentre il Tet-On H1/YY1 è stato utilizzato in questo protocollo. P5 è vettoriale specifica e la sequenza di pLL3.7 14 è mostrato. Le sequenze di enzimi di restrizione sono sottolineati, mentre le sequenze per temprare i promotori durante l&#39;amplificazione PCR sono in corsivo.

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Non ci sono conflitti di interesse dichiarati.

Questo protocollo descrive un metodo per abbattere un gene utilizzando shRNA e visualizzare il suo effetto biologico utilizzando l&#39;imaging bioluminescente di crescita di cellule tumorali in vivo. Il sito bersaglio di un shRNA non dovrebbe contenere uno qualsiasi dei tre siti di restrizione (BamHI, EcoRI e HindIII) utilizzati per subcloning. In uno scenario raro quando uno di questi siti è presente, un enzima di restrizione aggiuntivo può essere utilizzato per sostituirlo nel generare il costrutto. <p cl...

Oltre alle attrezzature di laboratorio comunemente utilizzato per le analisi di RNA e proteine ​​e la cultura delle cellule, i seguenti materiali e reagenti sono necessari per questo protocollo. <table border="1"><tbody><tr><td> Nome del reattivo </td></tr><tr><td> Biosicurezza adatto per livello di biosicurezza 2 contenimento Cabinet </td></tr><tr><td> PCR termociclatore </td></tr><tr><td> Ultracentrifuga </td></tr><tr><td> Anestesia-induzione da camera con spazzini isofluorano </td></tr><tr><td> Digital Vernier pinza </td></tr><tr><td> IVIS sistema di imaging </td></tr><tr><td> Altamente competenti DH5a E. coli </td></tr><tr><td> EcoRI, BamHI, e gli enzimi di restrizione HindIII </td></tr><tr><td> DNA ligasi T4 </td></tr><tr><td> Di terza generazione lentivirus plasmidi imballaggio VSV-G, PRSV-Rev e pMDLg / pRRE </td></tr></tbody></table> Elenco dei materiali

dna vector-based rna interference per studiare la funzione del gene in cancro

DNA Vector-based RNA Interference to Study Gene Function in Cancer

RNA interference (RNAi) inibisce l&#39;espressione genica attraverso mRNA bersaglio specifico degradanti. Dalla scoperta del double-stranded RNA interference piccola (siRNA) in silenziamento genico 1, RNAi è diventato un potente strumento di ricerca in studi di funzione del gene. Rispetto a delezione genetica, RNAi-mediata silenziamento genico possiede numerosi vantaggi, come la facilità con cui viene effettuata e la sua idoneità per più linee cellulari. Molteplici studi hanno dimostrato le applicazioni della tecnologia RNAi nella ricerca sul cancro. In particolare, lo sviluppo della tecnologia del DNA vettoriale basato su di produrre piccole forcina RNA (shRNA) guidato dal promotore U6 o H1 ha reso lungo termine e gene inducibile silenziamento possibile 2,3. Il suo impiego in combinazione con geneticamente vettori virali, quali lentivirus, facilita elevato rendimento di consegna shRNA e / o integrazione nel DNA genomico per espressione stabile shRNA. Descriviamo un detaileprocedura d con il vettore basato su tecnologia del DNA RNAi per determinare la funzione del gene, compresa la costruzione di vettori lentivirali esprimenti shRNA, la produzione di lentivirus e l&#39;infezione delle cellule, e studi funzionali utilizzando un modello di xenotrapianto mouse. Varie strategie sono stati riportati nella generazione di costrutti shRNA. Il protocollo qui descritto impiegando amplificazione PCR e un 3-frammento legatura può essere utilizzato per generare direttamente ed efficacemente shRNA contenenti costrutti lentivirali senza lasciare alcuna ulteriore adiacente ad una sequenza nucleotidica codificante shRNA. Poiché le shRNA-cassette di espressione creato da questa strategia può essere tagliato con enzimi di restrizione, possono essere facilmente spostato con altri vettori diversi marcatori fluorescenti o antibiotici. Reagenti di trasfezione più commerciali possono essere utilizzati nella produzione lentivirus. Tuttavia, in questa relazione, mettiamo a disposizione un metodo economico utilizzando fosfato di precipitazione di calcio che può raggiungere oltre il 90% di efficienza di transfezione inCellule 293T. Rispetto ai vettori di espressione shRNA costitutivi, un sistema inducibile shRNA è particolarmente adatto ad abbattere un gene essenziale per la proliferazione cellulare. Dimostriamo il silenziamento del gene Yin Yang 1 (YY1), un oncogene potenziale nel cancro della mammella 4,5, da un Tet-On sistema inducibile shRNA ei suoi effetti sulla formazione di tumori. La ricerca che utilizza lentivirus richiede l&#39;esame e l&#39;approvazione di un protocollo sulla biosicurezza dal Comitato di Biosicurezza di istituzione di un ricercatore. La ricerca che utilizza modelli animali richiede l&#39;esame e l&#39;approvazione di un protocollo animale dalla cura degli animali e Comitato uso (ACUC) dell&#39;istituzione di un ricercatore.

RNA interference (RNAi) possiede molti vantaggi rispetto knockout del gene ed è stato ampiamente utilizzato come strumento in studi di geni funzionali. L&#39;invenzione di DNA vettoriale basata RNAi tecnologia ha fatto lungo termine e smontabile gene inducibile possibile, e anche aumentata la possibilità di silenziamento genico<em&gt; In vivo</em&gt;.

DNA Vector-based RNA Interference per studiare la funzione del gene in Cancro

L'interferenza dell'RNA (RNAi) inibisce l'espressione genica degradando specificamente gli mRNA bersaglio. Fin dalla scoperta dei piccoli RNA interferenti a doppio filamento...

L'obiettivo generale di questa procedura è determinare la funzione genica attraverso l'uso dell'interferenza dell'RNA basata su vettori di DNA. Questo viene ottenuto innanzitutto progettando e generando costrutti S-H-R-N-A mirati a geni specifici. Il secondo passaggio consiste nella produzione di lentivirus che trasportano la cassetta di espressione SH RNA.Successivamente, vengono generate linee cellulari stabili infettando le cellule con il lentivirus, e le cellule infettate con il lentivirus vengono utilizzate in vari saggi in vitro e in vivo per determinare gli effetti del silenziamento del gene di interesse. In definitiva, a seconda dei saggi utilizzati, i risultati possono mostrare cambiamenti nella genicità tumorale delle cellule in seguito alla riduzione dell'espressione genica, mediante saggi di proliferazione, migrazione e invasione in vitro, nonché modelli di formazione di xenotrapianti in vivo. A dimostrare la procedura saranno Daniel Stowell, ma Juan e Daniel, uno studente laureato nel mio laboratorio, mentre Ma Ma è un tecnico.Chang è un ricercatore postdottorato. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande fondamentali nel campo della ricerca sul cancro, come ad

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Fattori dell'ospite romanzo coinvolti nella infezione virale può essere identificato tramite cell-based genome-wide perdita della funzione di screening RNAi.

Lo screening RNAi per fattori di accoglienza che partecipano Vaccinia Infezione da virus utilizzando Drosophila Celle

RNA interference è stato dimostrato molto efficace per analizzare la funzione del gene...

L&#39;interferenza di RNAi per iniezione in dsRNA Drosophila Embrioni

Fonte: Fuchs, M. et al. Adenofezione: Un metodo per lo studio del ruolo delle chaperonine molecolari nella morfodinamica cellulare mediante esperimenti di deplezione e recupero funzionale. J. Vis. Exp. (2016)Questo video dimostra il trasferimento mediato da adenovirus di un transgene fluorescente combinato con la trasfezione con fosfato di calcio-siRNA in cellule di cancro alla cervice. L'adenovirus esprime una proteina di sostituzione fluorescente, mentre l'siRNA induce la degradazione mirata...

Trasduzione adenovirale combinata e knockdown mediato da siRNA in cellule tumorali

Qui, vi presentiamo i protocolli per l'allevamento di un coleottero intermedio di germi, Dermestes maculatus (D. maculatus) in laboratorio. Condividiamo anche protocolli per embrionale e genitori RNAi e metodi per l'analisi dei fenotipi embrionali per studiare la funzione dei geni in questa specie.

Allevamento e RNA a doppio filamento mediata silenziamento genico nel Hide Beetle, Dermestes maculatus

Vi presentiamo un protocollo per dimostrare un sistema di trasferimento di romanzo genica somatica che utilizza RIP-Tag; RIP-tva modello di topo per studiare la funzione dei geni in metastasi. Il retrovirus aviaria vengono consegnati intracardiacally per garantire il trasferimento genico in lesioni pre-maligne, non invasive delle cellule β del pancreas in topi adulti.

Identificazione e caratterizzazione di fattori metastatici di trasferimento genico nel romanzo RIP-Tag; RIP-tva modello murino

Qui descriviamo un protocollo per impiegando HTS RNAi per scoprire destinazioni di host che possono essere manipolate per migliorare la terapia virus oncolytic, specificamente terapia del rhabodvirus e del vaccinia virus, ma può essere facilmente adattata ad altri oncolytic piattaforme di virus o di scoperta di geni ospitanti che modulano la replicazione del virus in generale.

Genome-wide RNAi Screening per identificare i fattori ospite che modulano la terapia Virus Oncolytic

Questo protocollo descrive un flusso di lavoro di editing genico CRISPR (Short Palindromic Repeats) ad alto rendimento per l'analisi della rete di cluster di microRNA che consente la rapida generazione di un pannello di linee cellulari geneticamente modificate che trasportano combinazioni uniche di delezione dei membri del cluster di miRNA fino a 35 kb all'interno di un singolo esperimento.

Strumento di editing genetico CRISPR per l'analisi della rete di cluster microRNA

Molti geni sovraregolati stimolano la migrazione e l'invasione delle cellule tumorali, portando a una prognosi infausta. Determinare quali geni regolano la migrazione e l'invasione delle cellule tumorali è fondamentale. Questo protocollo presenta un metodo per studiare gli effetti dell'aumentata espressione di un gene sulla migrazione e l'invasione delle cellule tumorali in tempo reale.

Misurazione quantitativa in tempo reale della migrazione e dell'invasione delle cellule tumorali in seguito alla trasfezione sintetica di mRNA

Il presente protocollo descrive l'iniezione intraduttale di vettori virali attraverso la tettarella per fornire geni di interesse nelle cellule epiteliali mammarie.

In vivo Consegna genica nelle cellule epiteliali mammarie di topo attraverso l'iniezione intraduttale mammaria

Questo studio presenta un doppio sistema CRISPRi che ha come bersaglio lunghi RNA non codificanti in cellule di melanoma. Consente il knockdown genico combinatorio e lo screening letale sintetico, identificando le interazioni lncRNA specifiche del cancro per potenziali strategie terapeutiche.

Doppia strategia di interferenza CRISPR per il targeting delle interazioni letali sintetiche tra RNA non codificanti nelle cellule tumorali

Impara a utilizzare l'RNA interference basata su vettore DNA per studiare la funzione genica nel cancro. Questo metodo permette il silenziamento genico a lungo termine e inducibile in vivo mediante costrutti shRNA e lentivirus.

DNA Vector-based RNA Interference per studiare la funzione del gene in Cancro

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