DNA Vector-based RNA Interference per studiare la funzione del gene in Cancro

L'obiettivo generale di questa procedura è determinare la funzione genica attraverso l'uso dell'interferenza dell'RNA basata su vettori di DNA. Ciò si ottiene progettando e generando prima costrutti S-H-R-N-A che prendono di mira geni specifici. Il secondo passo consiste nel produrre lentivirus che trasporta la cassetta di espressione dell'RNA SH.

Quindi le linee cellulari stabili vengono generate infettando le cellule con il lentivirus e le cellule infettate dal lentivirus vengono utilizzate in vari saggi in vitro e in vivo per determinare gli effetti del silenziamento del gene di interesse. In definitiva, a seconda dei saggi utilizzati, i risultati possono mostrare cambiamenti nella genicità tumorale delle cellule a seguito del knockdown genico attraverso l'uso di saggi di proliferazione, migrazione e invasione in vitro, nonché di modelli di formazione di xenotrapianti in vivo. A dimostrare la procedura sarà Daniel Stowell, ma Juan, e Daniel è uno studente laureato nel mio laboratorio, ma Ma è un tecnico.

Chang è un borsista post-dottorato. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della ricerca sul cancro, ad esempio se un gene specifico ha un ruolo nello sviluppo e nella progressione del cancro e per quali aspetti di questi processi può essere importante. Per iniziare, progettare e ordinare gli oligonucleotidi in base ai criteri descritti, Anil, i due oligo complementari inversi che contengono la sequenza bersaglio da 20 a 23 nucleotidi nel gene bersaglio.

Formeranno i siti eco R one e Hindi three alle due estremità. Dopo essere stato inginocchiato, un altro oligo contiene una sequenza complementare inversa alla sequenza bersaglio e le sue tre estremità prime. Neils alle tre estremità prime del promotore H uno o U sei con un innesco a monte.

Usa una PCR per creare un frammento che abbia BAM H uno e Hindi tre siti su entrambe le estremità. Nel frattempo digerire il vettore del lentivirus e il frammento della PCR. Quindi eseguire una reazione di legatura a tre frammenti tra il vettore, il frammento PCR e gli oligonucleotidi Anil.

Con un rapporto molare da 1 a 10 a 10, il vettore risultante produrrà l'HRNA di interesse con una sequenza hindi a tre nella regione del loop. Se viene utilizzato un vettore inducibile, la produzione di HRNA dipenderà dalla presenza di una molecola induttrice come la doxiciclina per il sistema Tet. Ora trasforma cinque cellule alfa di e coli DH altamente efficienti e competenti utilizzando il prodotto ligato e identifica i vettori positivi utilizzando uno screening PCR basato su colonie.

Amplificare un prodotto che abbraccia il vettore e il sito di legatura del promotore inducibile. Prepara il DNA plasmatico dalle colonie positive con un kit commerciale. Confermare quindi la presenza dell'inserto mediante digestione BAM H one ed ECO R one e mediante elettroforesi con DNA agarosio.

Inoltre, sequenziare la regione contenente il promotore e S-H-R-N-A utilizzando il nucleotide LIGA P cinque. Utilizzando un kit di preparazione MIDI o maxi privo di endotossine, preparare il DNA del lentivirus che trasporta la cassetta di espressione HRNA. Determinare la concentrazione di DNA misurando l'assorbimento della luce a 260 nanometri e garantire la purezza del DN a controllando che il rapporto di assorbimento della luce da 260 a 280 nanometri sia compreso tra 1,8 e 2,0.

Infine, far scorrere il plasmide lentivirus su un gel aerodinamico per assicurarsi che sia avvolto in S Prima della trasfezione, prepararsi per la trasfezione facendo cadere lentamente 0,9 millilitri di soluzione A in 0,9 millilitri di soluzione B mentre l'aria gorgoglia attraverso la soluzione B con una pipetta. Quindi incubare la miscela a temperatura ambiente per 30 minuti. Quindi, far cadere lentamente 0,6 millilitri di miscela su tre diverse piastre da 10 centimetri con celle HEK 2 93 T.

Quindi rimetti le cellule nell'incubatrice da quattro a sei ore dopo. Sostituire il terreno con sette millilitri di terreno DMEM completo. Dopo 24 ore, aggiungere altri cinque millilitri di terreno e, dopo altre 24 ore, raccogliere il terreno contenente il lentivirus.

Centrifugare il terreno raccolto a 1500 giri/min a temperatura ambiente per 10 minuti. Filtrare il surnatante utilizzando un filtro da 0,45 micrometri. Far girare il flusso attraverso il terreno contenente il lentivirus mediante ultracentrifugazione.

Decantare il surnatante in un contenitore per rifiuti contenente il 5% di candeggina. Risospendere il pellet di lentivirus in mezzo litro di XPBS freddo. Quindi dividere la soluzione di lentivirus in aliquote da 50 a 100 microlitri per la conservazione a meno 80 gradi Celsius.

Infine, determina il titolo del lentivirus utilizzando una tecnica affidabile. In genere, una piastra di coltura di 10 centimetri produrrà da 50 a 100 milioni di unità infettive prima di procedere con l'infezione cellulare. Determinare il MOI del titolo lentivirale utilizzando un kit o R-T-P-C-R per questa procedura.

Si consiglia un MOI inferiore a quattro. Inizia seminando le cellule da infettare in una piastra a sei pozzetti con una fluidità del 30-40% di co e coltivale durante la notte. Il giorno dopo.

Sostituire il terreno con un millilitro di terreno fresco, contenente poli cervello o protamina. Quindi aggiungi tra uno e 2 milioni di UI. Un lentivirus contenente un marcatore fluorescente o antibiotico.

Agitare lentamente la piastra per 10 secondi per mescolarla e incubarla per sei ore. Dopo sei ore, sostituire il terreno con un terreno normale e completo e propagare le cellule per due giorni. Il terreno non deve contenere antibiotici o induttori, indipendentemente dal lentivirus utilizzato dopo due giorni.

Aggiungere l'antibiotico appropriato se il lentivirus contiene un marcatore antibiotico. Allo stesso modo, aggiungi l'induttore a metà delle colture se il lentivirus è inducibile. Dopo aver coltivato le cellule per altri due o tre giorni con antibiotici e induttori, eseguire un'analisi del sangue occidentale per testare il knockdown del gene bersaglio prima dello xenotrapianto di tripsina negli occhi.

Le cellule provenienti da grandi piastre di coltura cellulare e le risolubilizzano nel terreno originale contenente il 50% di matrigel. È essenziale mantenere la risospensione delle cellule tumorali e il 50% di matrigel e la siringa sul ghiaccio. In caso contrario, c'è il rischio che il matrigel si solidifichi e l'infezione dovrà AB al riguardo.

Preparare il sito chirurgico pulendolo accuratamente con etanolo al 70% ed eseguire l'anestesia con un'eccellente ventilazione e un filtro scavenger isof al fluoro attaccato alla camera di induzione. Anestetizzare un topo nudo al timo usando il 2% di fluoro mescolato con l'1,5% di ossigeno da tre a cinque minuti prima dell'inoculazione cellulare. Quindi mantenere l'anestesia utilizzando il 2% di fluoro mescolato con ossigeno attraverso un cono nasale.

Posizionare il mouse su un termoforo impostato a 30 gradi Celsius. Caricare le cellule in siringhe con aghi da 25 gauge e mezzo per iniezioni sottocutanee o aghi da 28 a 30 gauge per iniezioni ortotopiche. Cinque minuti dopo l'induzione dell'anestesia in uno o due siti, iniettare da una a 10 milioni di cellule in boli da 200 microlitri.

Il numero di cellule dipende dalla malignità o dall'aggressività delle cellule tumorali. Per i vettori costitutivamente attivi utilizzare due gruppi di topi iniettati con le cellule che esprimono il gene bersaglio S-H-R-N-A o un fortinetto S-H-R-N-A criptato sui vettori. Usa gli stessi due gruppi e dividili ciascuno in sottogruppi che sono o non sono forniti induttori nella loro acqua.

Sostituire i documenti contenenti acqua due volte a settimana. Monitorare il volume dei tumori settimanalmente o bisettimanalmente con un C. Assicurarsi che il volume del tumore non superi il limite istituzionale o A CUC e sopprimere tutti gli animali che mostrano ulcerazioni estese, necrosi, infezioni evidenti, sanguinamento incontrollato o malattia allo stadio terminale. Per monitorare la crescita e le metastasi del tumore tramite un marcatore bioluminescente, disinfettare l'area di lavoro e anestetizzare i topi in una camera di imaging con anestesia gassosa.

Innanzitutto, fai un'esposizione da due a cinque minuti e controlla l'intensità del segnale, quindi regola di conseguenza. Se le dimensioni del tumore superano i 1000 millimetri cubi o i limiti di dimensioni istituzionali, sopprimere l'animale al momento del sacrificio, documentare le dimensioni del tumore e conservarle per ulteriori analisi. Questo protocollo è stato utilizzato per studiare gli effetti del knockdown del perché Y one sulla formazione di tumori xenotrapianto di cellule di adenocarcinoma mammario umano che esprimono luciferasi impiantate in topi nudi atimici.

Sono state testate la sequenza bersaglio S-H-R-N-A di YY uno umano e un controllo criptato S-H-R-N-A, che non aveva una somiglianza significativa con alcun trascritto umano noto. Di conseguenza, sono stati costruiti due vettori lentivirali e utilizzati per produrre due lentivirus. Entrambi sono stati utilizzati per infettare due diverse popolazioni cellulari e sono state ottenute popolazioni di cellule policlonali.

Dopo la selezione della micina. L'analisi del sangue Western ha confermato che la DS ha indotto YY one knockdown in queste linee cellulari infette. Successivamente, la popolazione di cellule policlonali del clone tre che è stato infettato con YY inducibile uno S-H-R-N-A e il controllo. S-H-R-N-A.

I LENTIVIRUS sono stati utilizzati per testare gli effetti dell'esaurimento YY one sull'invasione. Abbiamo osservato che YY una deplezione ha ridotto l'invasività delle cellule. L'analisi del sangue occidentale ha confermato che i medici hanno indotto il silenziamento di YY one nelle cellule con l'indu YY one S-H-R-N-A, mentre le cellule contenenti il controllo.

S-H-R-N-A non ha mostrato questo effetto. Queste cellule sono state poi utilizzate in uno studio su modello murino xenotrapianto rispetto ai gruppi di controllo indu, YY one S-H-R-N-A impiantati con il dos contenente acqua hanno mostrato una formazione tumorale significativamente ridotta quando visualizzati dalla bioluminescenza e quando i pesi del tumore sono stati misurati come previsto. Il silenziamento YY one in questi tumori xenotrapianto è stato prontamente confermato dal western blot.

Non dimenticare che lavorare con il lentivirus può essere estremamente pericoloso: secondo le considerazioni sulla sicurezza del NIHB per la ricerca con vettori lentivirali, sono necessarie procedure di contenimento di livello B avanzato di livello due per tutti gli ambienti di laboratorio.