DNA Vector-based RNA Interference per studiare la funzione del gene in Cancro

L'obiettivo generale di questa procedura è determinare la funzione genica attraverso l'uso dell'interferenza dell'RNA mediata da vettori di DNA. Questo viene ottenuto innanzitutto progettando e generando costrutti S-H-R-N-A che bersagliano geni specifici. Il secondo passaggio consiste nella produzione di lentivirus portatori della cassetta di espressione dell'RNA SH.

Successivamente, vengono generate linee cellulari stabili infettando le cellule con il lentivirus, e le cellule infettate vengono utilizzate in vari saggi in vitro e in vivo per determinare gli effetti dell'interferenza silenziante sul gene di interesse. In definitiva, a seconda dei saggi impiegati, i risultati possono mostrare variazioni nella genicità tumorale delle cellule conseguenti alla riduzione dell'espressione genica, mediante saggi in vitro di proliferazione, migrazione e invasione, nonché modelli in vivo di formazione di xenotrapianti. A dimostrare la procedura saranno Daniel Stowell, ma Juan e Daniel, uno studente laureato del mio laboratorio, mentre Ma Ma è un tecnico.

Chang è un ricercatore postdottorato. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande fondamentali nel campo della ricerca sul cancro, come ad esempio se un gene specifico abbia un ruolo nello sviluppo e nella progressione del cancro, e quali aspetti di questi processi potrebbero dipendere da esso. Per iniziare, progettare e ordinare gli oligonucleotidi in base ai criteri descritti, identificando i due oligonucleotidi complementari inversi che contengono la sequenza bersaglio di 20-23 nucleotidi nel gene target.

Essi formeranno siti eco R uno e Hindi tre alle due estremità. Dopo essere stati denaturati, un altro oligonucleotide contiene una sequenza complementare inversa alla sequenza bersaglio e alla sua estremità tre primi. Si lega all'estremità tre primi del promotore H uno o U sei mediante un primer upstream.

Utilizzare una PCR per ottenere un frammento che presenti siti BAM H1 e HindIII alle due estremità. Nel frattempo, digerire il vettore lentivirale e il frammento PCR. Successivamente, eseguire una reazione di ligazione a tre frammenti tra il vettore, il frammento PCR e gli oligonucleotidi Anil.

In un rapporto molare uno a 10 a 10, il vettore risultante produrrà l'HRNA di interesse con una sequenza Hindi tre nella regione del loop. Se viene utilizzato un vettore inducibile, la produzione di HRNA dipenderà dalla presenza di una molecola induttrice come la doxiciclina per il sistema Tet on. Ora trasformate cellule di E. coli DH cinque alpha altamente competenti ed efficienti utilizzando il prodotto ligato e identificate i vettori positivi mediante un'analisi PCR basata su colonie.

Amplificare un prodotto che comprende il vettore e il sito di ligazione del promotore induttibile. Preparare il DNA plasmidico dalle colonie positive utilizzando un kit commerciale. Successivamente, confermare la presenza dell'inserto mediante digestione con BAM H one ed ECO R one e tramite elettroforesi su agarosio del DNA.

Inoltre, sequenziare la regione contenente il promotore e S-H-R-N-A utilizzando il nucleotide P cinque di LIGA. Utilizzando un kit MIDI o maxi prep privo di endotossine, preparare il DNA del lentivirus contenente la cassetta di espressione HRNA. Determinare la concentrazione del DNA misurando l'assorbimento della luce a 260 nanometri e verificare la purezza del DNA controllando che il rapporto tra l'assorbimento della luce a 260 e 280 nanometri sia compreso tra 1,8 e 2,0.

Infine, eseguire il plasmide lentivirale su un gel ad alta risoluzione per verificare che sia a spirale singola. Prima della trasfezione, preparare la trasfezione lasciando cadere lentamente 0,9 millilitri della soluzione A in 0,9 millilitri della soluzione B, mentre si fa passare aria nella soluzione B mediante una pipetta. Incubare quindi la miscela a temperatura ambiente per 30 minuti. Successivamente, aggiungere lentamente 0,6 millilitri della miscela su tre piastre diverse da 10 centimetri contenenti cellule HEK 293T.

Quindi, quattro-sei ore dopo, reinserire le cellule nell'incubatore. Sostituire il mezzo con sette millilitri di mezzo DMEM completo. Dopo 24 ore, aggiungere altri cinque millilitri di mezzo e, dopo ulteriori 24 ore, raccogliere il mezzo contenente il lentivirus.

Centrifugare il mezzo raccolto a 1500 giri/min a temperatura ambiente per 10 minuti. Filtrare il soprannatante utilizzando un filtro da 0,45 micrometri. Centrifugare il mezzo filtrato contenente il lentivirus mediante ultracentrifugazione.

Decantare il soprannatante in un contenitore per rifiuti contenente candeggina al 5%. Risospendere il pellet di lentivirus in mezzo millilitro fino a un millilitro di PBS 1X freddo. Quindi dividere la soluzione di lentivirus in aliquote da 50 a 100 microlitri per la conservazione a meno 80 gradi Celsius.

Infine, determinare il titolo del lentivirus utilizzando una tecnica affidabile. Tipicamente, una piastra di coltura da 10 centimetri produrrà da 50 a 100 milioni di unità infettive prima di procedere con l'infezione cellulare. Determinare il MOI del titolo del lentivirus utilizzando un kit o la R-T-P-C-R per questa procedura.

Si raccomanda un MOI inferiore a quattro. Iniziare seminando le cellule da infettare in una piastra a sei pozzetti al 30-40% di confluenza e coltivarle per tutta la notte. Il giorno successivo.

Sostituire il mezzo con un millilitro di mezzo fresco contenente polibrene o protamina. Quindi aggiungere da uno a 2 milioni di UI di un lentivirus contenente un marcatore fluorescente o antibiotico.

Agitare lentamente la piastra per 10 secondi per mescolare e incubare per sei ore. Dopo sei ore, sostituire il mezzo con mezzo normale e completo, e coltivare le cellule per due giorni. Il mezzo non deve contenere antibiotici o induttori, indipendentemente dal lentivirus utilizzato, dopo due giorni.

Aggiungere l'antibiotico appropriato se il lentivirus contiene un marcatore antibiotico. Analogamente, aggiungere l'induttore a metà delle colture se il lentivirus è inducibile. Dopo aver coltivato le cellule per altri due o tre giorni con antibiotici e induttori, eseguire un'analisi western blot per verificare il silenziamento del gene bersaglio prima degli innesti xenotrapianti con tripsina oculari.

Le cellule provenienti da piatti di coltura cellulare di grandi dimensioni vengono sospese nel mezzo originale contenente Matrigel al 50%. È essenziale mantenere le cellule tumorali sospese in Matrigel al 50% e tenere la siringa in ghiaccio. In caso contrario, esiste il rischio che il Matrigel si solidifichi e l'infezione dovrà essere interrotta a causa di ciò.

Preparare il sito chirurgico pulendolo accuratamente con etanolo al 70% ed eseguire l'anestesia con un'ottima ventilazione e un filtro di captazione per isoflurano collegato alla camera di induzione. Anestetizzare dei topi nudi timici utilizzando isoflurano al 2% miscelato con ossigeno al 1,5% da tre a cinque minuti prima dell'inoculazione cellulare. Successivamente, mantenere l'anestesia mediante isoflurano al 2% miscelato con ossigeno attraverso un cono nasale.

Posizionare il mouse su un tappetino riscaldante impostato a 30 gradi Celsius. Caricare le cellule in siringhe con aghi da 25 e mezzo gauge per iniezioni sottocutanee, oppure con aghi da 28 a 30 gauge per iniezioni ortotopiche. Cinque minuti dopo l'induzione dell'anestesia, iniettare da uno a dieci milioni di cellule in boli da 200 microlitri in uno o due siti.

Il numero di cellule dipende dalla malignità o aggressività delle cellule tumorali. Per vettori costitutivamente attivi, utilizzare due gruppi di topi inoculati con cellule che esprimono o il gene bersaglio S-H-R-N-A o un S-H-R-N-A randomizzato sul vettore. Utilizzare gli stessi due gruppi e suddividerli ciascuno in sottogruppi ai quali viene o non viene somministrato l'induttore nell'acqua da bere.

Sostituire la paglia contenente acqua due volte alla settimana. Monitorare il volume dei tumori settimanalmente o ogni due settimane con un C. Assicurarsi che il volume tumorale non superi il limite istituzionale o A CUC e sopprimere qualsiasi animale che presenti ulcere estese, necrosi, infezione evidente, emorragia non controllata o malattia in fase terminale. Per monitorare la crescita tumorale e le metastasi mediante un marcatore bioluminescente, disinfettare l'area di lavoro e anestetizzare i topi in una camera di imaging con anestesia gassosa.

Prima di tutto, effettuare un'esposizione della durata di due a cinque minuti e verificare l'intensità del segnale, quindi regolare di conseguenza. Se la dimensione del tumore supera i 1000 millimetri cubi o il limite dimensionale stabilito dall'istituto, sopprimere l'animale al momento dell'eutanasia, documentare le dimensioni del tumore e conservarlo per ulteriori analisi. Questo protocollo è stato utilizzato per studiare gli effetti dell'abbattimento di why Y one sulla formazione di tumori xenotrapiantati da cellule di adenocarcinoma mammario umano che esprimono luciferasi, impiantate in topi nudi atimici.

È stata testata sia la sequenza bersaglio S-H-R-N-A dell'YY umano sia una S-H-R-N-A di controllo randomizzata, che non presentava somiglianza significativa con alcun trascritto umano noto. Di conseguenza, sono stati costruiti due vettori lentivirali e utilizzati per produrre due lentivirus. Entrambi sono stati utilizzati per infettare due popolazioni cellulari diverse, ottenendo popolazioni cellulari policlonali.

Dopo la selezione con puromicina. L'analisi ematica mediante Western blot ha confermato l'induzione da parte del DS dell'abbattimento di YY1 in queste linee cellulari infette. Successivamente, la popolazione cellulare policlonale del clone tre, infettata con YY1 induttibile S-H-R-N-A e controllo S-H-R-N-A.

I LENTIVIRUS sono stati utilizzati per testare gli effetti dell'esaustione di YY uno sull'invasione. Abbiamo osservato che l'esaustione di YY uno riduceva l'invasività delle cellule. L'analisi ematica occidentale ha confermato che i documenti hanno indotto il silenziamento di YY uno nelle cellule con l'indu YY uno S-H-R-N-A, mentre le cellule contenenti il controllo.

S-H-R-N-A non ha mostrato questo effetto. Queste cellule sono state successivamente utilizzate in uno studio con modello murino di xenotrapianto, confrontato con i gruppi di controllo indu, YY one. Nei topi con S-H-R-N-A impiantati e forniti con dosi contenenti acqua, si è osservata una riduzione significativa della formazione tumorale, sia mediante visualizzazione con bioluminescenza che misurando il peso dei tumori, come previsto. L'inattivazione di YY one in questi tumori da xenotrapianto è stata facilmente confermata mediante western blot.

Gli studi non devono dimenticare che lavorare con lentivirus può essere estremamente pericoloso secondo le considerazioni sulla sicurezza del NIHB; per le ricerche con vettori lentivirali sono richieste procedure di contenimento di livello di sicurezza B due potenziate in tutti gli ambienti di laboratorio.