Mouse Isolotto di Langerhans isolamento utilizzando una combinazione di Collagenasi depurato e proteasi neutra
7 settembre 2012
Una descrizione dettagliata di isolamento del mouse isolotto è descritta utilizzando la tecnica di incannulazione in situ duttale pancreatico e perfusione di una combinazione di purificato collagenasi e proteasi neutra.
L'obiettivo generale di questa procedura è isolare con successo gli isolotti dal pancreas di un topo. Questo viene ottenuto isolando innanzitutto il pancreas dal tessuto circostante. Successivamente, il dotto biliare viene cannullato in modo che il pancreas possa essere gonfiato con la miscela di proteasi collagenasi.
Dopo il gonfiamento, il pancreas viene rimosso e gli isolotti vengono accuratamente dissociati. Infine, gli isolotti isolati vengono filtrati e seminati per un uso futuro. In definitiva, questo metodo di isolamento degli isolotti mediante collagenasi purificata e proteasi neutra viene utilizzato per ottenere un rendimento massimo di isolotti e una morfologia ottimale degli isolotti.
Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti di isolamento degli anelli tracheali è che abbiamo eliminato la variabilità tra diversi lotti utilizzando enzimi purificati. Inoltre, abbiamo apportato modifiche o miglioramenti ad alcuni protocolli per ottimizzare la morfologia degli anelli. Dopo l'eutanasia, coprire il tronco con etanolo al 70% prima di aprire completamente la cavità addominale dall'ano al diaframma.
Successivamente, posizionare il topo sulla piattaforma di un microscopio stereoscopico. Estrarre il cieco e il colon ascendente e spostarli all'esterno della cavità corporea a sinistra; spostare i lobi del fegato contro il diaframma. Se questi non rimangono in posizione autonomamente, allargare l'apertura della cavità corporea.
Afferrare il duodeno con pinze curve e individuare il fascio composto dall'arteria epatica, dalla vena porta e dal dotto biliare che si dirige verso il fegato. Con un'altra coppia di pinze curve, inserire un punto di sutura sotto il fascio di arteria, vena e dotto, quindi stringerlo il più vicino possibile al fegato.
Utilizzando due paia di pinze curve, afferrare con cura il duodeno e individuare il dotto biliare attaccato alla papilla. Con una delle ganasce della pinza, forare il pancreas e il tessuto connettivo subito al di sotto del dotto biliare e in prossimità della papilla. Rapidamente, passare la pinza attraverso il foro e inserire un punto di sutura, legandolo in modo lento attorno al dotto biliare per creare un piccolo cerchio utilizzando pinze a 90 gradi.
Estrarre l'intestino tenue fino a quando il dotto biliare non risulta teso. Effettuare un taglio orizzontale attraverso la papilla con forbici finissime senza staccare il dotto biliare dalla papilla, tenendo ferma l'intestino. Inserire una cannula nel dotto biliare e quindi stringere delicatamente il punto intorno alla cannula.
Successivamente, riempire una siringa da tre millilitri con 2,0 millilitri di miscela di collaghenasi e proteasi. Iniettare questa miscela nella cannula a un ritmo lento e costante. Al termine del rigonfiamento del pancreas, rimuovere la cannula dal dotto biliare.
Partendo dal colon discendente, recidere il tessuto connettivo tirando verso l'alto l'intestino fino a raggiungere il dotto biliare. Successivamente, separare il pancreas dalla milza e dai tessuti circostanti. Infine, tagliare i punti di sutura ed asportare il pancreas.
Dopo il prelievo, collocare il pancreas in un tubo da 50 millilitri contenente cinque millilitri di HBSS su ghiaccio. Una volta raccolti tutti i campioni, inserire i tubi da 50 millilitri contenenti il tessuto pancreatico in un bagnomaria a 37 gradi Celsius. Agitare delicatamente il tubo per 15 minuti e verificare la dissociazione del tessuto.
Assicurarsi che il tessuto si separi facilmente tenendo il tubo dal coperchio. Ruotare 12 volte per dissociare ulteriormente il tessuto. Aggiungere non più di 30 millilitri di HBSS e centrifugare.
Aspirare con attenzione il soprannatante lasciando una piccola quantità di soprannatante sul fondo, in modo da non disturbare il pellet cellulare. Utilizzando una siringa da 30 millilitri collegata a un ago da 14 gauge, aggiungere non più di 10 millilitri di HBSS ed aspirare su e giù la sospensione per due volte. Filtrare la miscela cellulare attraverso un filtro T in plastica in un tubo da 50 millilitri.
Risciacquare con altri 10 millilitri di HBSS e centrifugare. Decantare il soprannatante e capovolgere le provette per farle sgocciolare su carta assorbente per un minuto. Ripesare ogni provetta in 10 millilitri.
Freddo 1100. Il suo strato opaco, il suo strato opaco con 10 millilitri di HBSS e centrifuga. Rimuovere tutti i 20 millilitri di sopranatante utilizzando una pipetta da 25 millilitri a grande apertura e far passare il sopranatante attraverso un filtro da 70 micron posizionato al contrario.
Filtrare direttamente gli anellini in una piastra di Petri e risciacquare pipettando 10 millilitri di mezzo per anellini attraverso la coltura filtrata. Mantenere gli anellini in un incubatore per colture cellulari fino al momento dell'esperimento. I parametri generali utilizzati per valutare il successo dell'isolamento degli anellini sono la resa, la morfologia e la qualità.
Viene mostrata qui la morfologia tipica degli occhielli. Gli occhielli hanno una forma rotonda o leggermente allungata con dimensioni relativamente uniformi. Qui, occhielli isolati sono stati analizzati per la secrezione di insulina stimolata dal glucosio.
La stimolazione dell'insulina è stata simile tra gli occhietti preparati con Sigma Type 11 rispetto a ci zyme TM, MABP, indicando un'elevata qualità della preparazione degli occhietti. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come cannuclare il dotto biliare di un topo. Lavora con zyme collagenasi e neutro proteasi per isolare le tue palpebre per qualsiasi saggio.
Panoramica
In questo articolo viene descritta una procedura dettagliata per l'isolamento di isolotti dal pancreas di un topo mediante canulazione duttale pancreatica in situ e l'uso di una miscela di collagenasi-proteasi. Il metodo mira a migliorare il rendimento e la morfologia degli isolotti riducendo al minimo la variabilità.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Neuroscienze
- Biologia cellulare
- Endocrinologia
Sfondo
- Le cellule delle isole sono fondamentali per la produzione di insulina.
- I metodi tradizionali di isolamento possono portare a variabilità nei risultati.
- L'uso di enzimi purificati può migliorare la qualità delle isole isolate.
- Protocolli migliorati possono portare a una migliore morfologia delle isole.
Scopo dello studio
- Isolare efficacemente gli isolotti dal pancreas del topo.
- Ridurre la variabilità tra diversi lotti nelle preparazioni enzimatiche.
- Ottimizzare la morfologia degli isolotti per applicazioni di ricerca.
Metodi Utilizzati
- Isolamento del pancreas murino dai tessuti circostanti.
- Canulazione del dotto biliare per l'infusione di enzimi.
- Insufflazione del pancreas con una miscela di collaghenasi-proteasi.
- Filtrazione e semina degli "eyelets" isolati per esperimenti.
Risultati principali
- Dissociazione e isolamento riusciti degli occhiolini.
- Miglioramento della morfologia degli occhiolini osservato dopo l'isolamento.
- Preparazioni di occhiolini di alta qualità indicate dai test di secrezione dell'insulina.
- Il metodo ha dimostrato una variabilità ridotta rispetto alle tecniche tradizionali.
Conclusioni
- Il metodo descritto è efficace per l'isolamento di occhioli di alta qualità.
- L'uso di enzimi purificati migliora l'affidabilità dei risultati.
- Questa tecnica può risultare utile per diversi saggi che coinvolgono occhioli.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
L'isolamento delle isole pancreatiche primarie consente una valutazione fisiologicamente rilevante della funzione delle cellule beta, fondamentale per la validazione degli obiettivi nel diabete e per la riduzione del rischio meccanicistico. La variabilità nelle prestazioni dei lotti di enzimi compromette la riproducibilità tra le campagne di scoperta, influenzando l'identificazione dei composti promettenti e l'affidabilità predittiva. Questo protocollo affronta l'incoerenza tra lotto e lotto mediante l'uso di collaghenasi e proteasi neutrale purificate, favorendo una preparazione standardizzata e scalabile delle isole per la valutazione preclinica.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Valore scientifico: Consente l'analisi dei percorsi di segnalazione intracellulari e delle risposte secretorie negli isolotti primari, migliorando la validazione delle ipotesi sui bersagli.
- Valore operativo: Riduce il rumore biologico derivante dalla variabilità enzimatica, aumentando l'affidabilità delle letture riguardanti l'interazione con il bersaglio.
Sviluppo di screening e saggi
- Valore scientifico: Fornisce un rendimento e una morfologia degli isolotti costanti per saggi affidabili di secrezione di insulina stimolata dal glucosio.
- Valore operativo: Una composizione enzimatica standardizzata favorisce la riproducibilità dei saggi tra diversi laboratori e campagne di screening.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Valore scientifico: Mantiene la biologia delle cellule beta rilevante per le malattie, necessaria per studi preclinici di efficacia e tossicità.
- Valore operativo: Facilita il confronto tra ceppi diversi quando i rapporti enzimatici vengono aggiustati in base alle caratteristiche tissutali specifiche della specie.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il metodo si inserisce nel percorso di scoperta che va dalla validazione del bersaglio all'identificazione del capostazione fino alla sperimentazione dell'efficacia preclinica, in cui la funzione degli isolotti primari guida le decisioni di prosecuzione o interruzione.
- Biologia della scoperta: Supporta la chiarificazione dei percorsi e la validazione funzionale dei bersagli utilizzando risposte di isolotti simili a quelli umani fisiologicamente rilevanti.
- Screening: Permette una valutazione standardizzata e quantitativa degli effetti dei composti sulla secrezione di insulina.
- Analisi: Genera variabili dipendenti misurabili, come i livelli di secrezione di insulina e il rendimento degli isolotti, per l'analisi comparativa delle condizioni.
- Ricerca traslazionale: Collega la modulazione del bersaglio nella fase di scoperta agli esiti preclinici attraverso il mantenimento della morfologia e della funzione degli isolotti.
- Riutilizzo aziendale: Lotti di enzimi purificati consentono il riutilizzo del protocollo in diversi progetti, riducendo il carico di riottimizzazione.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Maggiore affidabilità predittiva nella validazione degli obiettivi grazie a una minore ambiguità meccanicistica nelle risposte delle cellule beta.
- Valore operativo: Standardizzazione, riproducibilità e scalabilità dell'isolamento degli isolotti in diversi siti e studi.
- Valore strategico: Decisioni più efficaci sul proseguimento o l'interruzione dei progetti, maggiore efficienza nell'uso del capitale e riduzione del rischio biologico in fase avanzata nei programmi sul diabete.
- Impatto sul portafoglio: Prioritizzazione corretta per rischio basata su dati funzionali affidabili derivati dagli isolotti.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze nella dissezione murina e nella canulazione del dotto pancreatico.
- Dipende dall'accesso a collagenasi purificata (CIzyme MA) e proteasi neutrale (CIzyme BP) con attività caratterizzata.
- Necessita della standardizzazione dei rapporti enzimatici (ad esempio, 35:10 collagenasi:proteasi) per prestazioni costanti.
- Potrebbe essere necessaria un'adattamento per ceppi diversi dal C57BL/6 o per modelli di ratto, in base alla densità del tessuto e alla disponibilità degli enzimi.
- Limite pratico: i passaggi di dissezione e di insufflazione manuale limitano la produttività in assenza di automazione.
