Mouse Isolotto di Langerhans isolamento utilizzando una combinazione di Collagenasi depurato e proteasi neutra
September 7th, 2012
Una descrizione dettagliata di isolamento del mouse isolotto è descritta utilizzando la tecnica di incannulazione in situ duttale pancreatico e perfusione di una combinazione di purificato collagenasi e proteasi neutra.
L'obiettivo generale di questa procedura è isolare con successo gli occhielli dal pancreas di un topo. Ciò si ottiene isolando prima il pancreas dal tessuto circostante. Successivamente, il dotto biliare viene incannulato in modo che il pancreas possa essere gonfiato con la miscela di collagenasi proteasi.
Una volta gonfiato, il pancreas viene rimosso e gli occhielli vengono accuratamente dissociati. Infine, gli occhielli isolati vengono filtrati e placcati per un uso futuro. In definitiva, questo metodo di isolamento degli occhielli con collagenasi purificata e proteasi neutra viene utilizzato per ottenere la massima resa degli occhielli e una morfologia ottimale degli occhielli.
Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti di isolamento degli occhielli è che abbiamo eliminato la variabilità da lotto a lotto utilizzando enzimi purificati. Inoltre, abbiamo modificato o apportato miglioramenti ad alcuni protocolli per migliorare la morfologia degli occhielli. Dopo l'eutanasia, coprire il busto con etanolo al 70% prima di aprire completamente la cavità addominale dall'ano al diaframma.
Quindi posizionare il mouse sulla piattaforma di un microscopio da dissezione. Estrarre il cieco e il colon ascendente e posizionarli all'esterno della cavità corporea a sinistra spostando i lobi del fegato contro il diaframma. Se non rimangono lì da soli, aumentare l'apertura della cavità corporea.
Afferrare il duodeno con una pinza curva e individuare l'arteria, la vena porta epatica e il fascio del dotto biliare che porta al fegato. Con un altro paio di pinze curve. Inserire una sutura sotto la vena arteriosa e il fascio del dotto e stringerla il più vicino possibile al fegato.
Usando due paia di pinze curve, afferra con cura il duodeno e trova il dotto biliare attaccato Alla papilla, usa una pinza per infilare il pancreas e il tessuto connettivo proprio sotto il dotto biliare e vicino alla papilla funzionante. Rapidamente, posiziona la pinza attraverso il foro e inserisci una sutura. Scioltamente. Legare la sutura attorno al dotto biliare per creare un piccolo cerchio usando una pinza a 90 gradi.
Tirare l'intestino tenue fino a quando il dotto biliare è tau. Fai un taglio orizzontale sulla papilla con forbici super sottili senza spostare il dotto biliare dalla papilla mentre tieni l'intestino. Inserire una cannula nel dotto biliare e quindi tirare delicatamente la sutura attorno alla cannula.
Quindi, riempire una siringa da tre millilitri con 2,0 millilitri di miscela di collagenasi proteasi. Iniettare questa miscela nella cannula a un ritmo lento e costante. Dopo che il gonfiaggio del pancreas è completo, rimuovere la cannula dal dotto biliare.
Partendo dal colon discendente, tagliare il tessuto connettivo mentre si tira l'intestino verso l'alto fino a raggiungere il dotto biliare. Quindi, separa il pancreas dalla milza e dai tessuti circostanti. Infine, tagliare i punti di sutura e rimuovere il pancreas.
Una volta rimosso, posizionare il pancreas in una provetta da 50 millilitri contenente cinque millilitri di HBSS con ghiaccio. Una volta raccolti tutti i campioni, posizionare le provette da 50 millilitri contenenti tessuto pancreatico in un bagno d'acqua a 37 gradi Celsius. Per 15 minuti, agitare delicatamente la provetta e verificare la dissociazione dei tessuti.
Assicurati che il fazzoletto si stacchi facilmente tenendo il tubo per il coperchio. Agitare 12 volte per dissociare ulteriormente il tessuto. Aggiungere non più di 30 millilitri di HBSS e centrifugare.
Aspirare il surnatante con cura e lasciare una piccola quantità di surnatante sul fondo in modo da non interrompere la tavolozza cellulare. Utilizzando una siringa da 30 millilitri collegata ad un ago calibro 14, aggiungere non più di 10 millilitri di HBSS e aspirare la sospensione su e giù due volte. Filtrare la miscela di cellule attraverso un colino a T di plastica in un tubo da 50 millilitri.
Risciacquare con altri 10 millilitri, HBSS e centrifugare. Decantare il surnatante e capovolgere i tubi per scolarli su un tovagliolo di carta assorbente per un minuto. Risospendere ogni provetta in 10 millilitri.
Freddo 1100. La sua sovrapposizione opaca, il suo opaco con 10 millilitri, HBSS e centrifuga. Rimuovere tutti i 20 millilitri di surnatante utilizzando una pipetta da 25 millilitri di grande diametro e far passare il surnatante attraverso un filtro invertito da 70 micron.
Filtrare gli occhielli direttamente in una capsula di Petri e risciacquare pipettando 10 millilitri di terreno per occhielli attraverso la coltura filtrante. Gli occhielli in un incubatore di coltura tissutale fino al momento della sperimentazione. La resa, la morfologia e la qualità degli occhielli sono i parametri generali utilizzati per giudicare il successo dell'isolamento degli occhielli.
Qui è mostrata la tipica morfologia degli occhielli. Gli occhielli hanno una forma da rotonda a oblunga con dimensioni relativamente uniformi. Qui. Gli occhielli isolati sono stati analizzati per la secrezione di insulina stimolata dal glucosio.
La stimolazione insulinica è risultata simile tra gli occhielli preparati da Sigma Type 11 rispetto a quelli preparati da CIZYME TM, dove MABP indica un'alta qualità della preparazione degli occhielli. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come incannulare un dotto biliare di topo. Lavora con la collagenasi zimica e le neutroproteasi per isolare le palpebre per qualsiasi test.
Panoramica
Questo articolo descrive una procedura dettagliata per l'isolamento degli isolotti da un pancreas di topo utilizzando la cannulazione dei dotti pancreatici in situ e una miscela di collagenasi-proteasi. Il metodo mira a migliorare la resa e la morfologia degli isolotti minimizzando la variabilità.
Componenti chiave dello studio
Area di scienza
- Neuroscienza
- Biologia cellulare
- Endocrinologo
Sfondo
- Le cellule isolotti sono cruciali per la produzione di insulina.
- I metodi di isolamento tradizionali possono portare a variabilità nei risultati.
- L'uso di enzimi purificati può migliorare la qualità degli isolotti isolati.
- Protocolli migliorati possono portare a una migliore morfologia degli isolotti.
Obiettivo dello studio
- Isolare efficacemente gli isolotti dal pancreas di topo.
- Ridurre la variabilità tra lotto e lotto nelle preparazioni enzimatiche.
- Ottimizzare la morfologia degli isolotti per applicazioni di ricerca.
Metodi utilizzati
- Isolamento del pancreas di topo dai tessuti circostanti.
- Cannulizzazione del dotto biliare per l'infusione di enzimi.
- Insufflazione del pancreas con una miscela di collagenasi-proteasi.
- Filtrazione e messa in piastra degli isolotti isolati per la sperimentazione.
Risultati principali
- Dissocuzione e isolamento riusciti degli isolotti.
- Miglioramento della morfologia degli isolotti osservato dopo l'isolamento.
- Preparazioni di alta qualità degli isolotti indicate dai test di secrezione di insulina.
- Il metodo ha dimostrato una variabilità ridotta rispetto alle tecniche tradizionali.
Conclusioni
- Il metodo descritto è efficace per l'isolamento di isolotti di alta qualità.
- L'uso di enzimi purificati migliora l'affidabilità dei risultati.
- Questa tecnica può essere vantaggiosa per vari saggi che coinvolgono gli isolotti.
Domande frequenti
Executive Industry Relevance
Isolation of primary pancreatic islets enables physiologically relevant assessment of beta cell function, which is critical for diabetes target validation and mechanistic de-risking. Variability in enzyme lot performance compromises reproducibility across discovery campaigns, impacting lead identification and predictive confidence. This protocol addresses lot-to-lot inconsistency through purified collagenase and neutral protease, supporting scalable, standardized islet preparation for preclinical evaluation.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of intracellular signaling pathways and secretory responses in primary islets, improving target hypothesis validation.
- Operational Value: Reduces biological noise from enzymatic variability, increasing confidence in target engagement readouts.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Provides consistent islet yield and morphology for reliable glucose-stimulated insulin secretion assays.
- Operational Value: Standardized enzyme composition supports assay reproducibility across laboratories and screening campaigns.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Maintains disease-relevant beta cell biology for preclinical efficacy and toxicity studies.
- Operational Value: Facilitates cross-strain comparability when enzyme ratios are adjusted for species-specific tissue characteristics.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target validation through lead identification to preclinical efficacy testing, where primary islet function informs go/no-go decisions.
- Discovery Biology: Supports pathway clarification and functional target validation using physiologically relevant human-like islet responses.
- Screening: Enables standardized, quantitative assessment of compound effects on insulin secretion.
- Analytics: Generates measurable dependent variables such as insulin secretion levels and islet yield for comparative condition analysis.
- Translational Research: Connects discovery-phase target modulation to preclinical outcomes through preserved islet morphology and function.
- Enterprise Reuse: Purified enzyme lots allow protocol reuse across projects, reducing re-optimization burden.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target validation through reduced mechanistic ambiguity in beta cell responses.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and scalability of islet isolation across sites and studies.
- Strategic Value: Better go/no-go decisions, capital efficiency, and reduced late-stage biological risk in diabetes programs.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization based on reliable islet-derived functional data.
Implementation Considerations
- Requires expertise in murine dissection and pancreatic duct cannulation.
- Dependent on access to purified collagenase (CIzyme MA) and neutral protease (CIzyme BP) with characterized activity.
- Necessitates standardization of enzyme ratios (e.g., 35:10 collagenase:protease) for consistent performance.
- Adaptation may be needed for non-C57BL/6 strains or rat models based on tissue density and enzyme accessibility.
- Practical limitation: Manual dissection and inflation steps constrain throughput without automation.
