Name: Mouse Isolotto di Langerhans isolamento utilizzando una combinazione di Collagenasi depurato e proteasi neutra (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-09-07T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 59 s
Description: Impara l'isolamento degli isolotti di Langerhans da pancreas murino utilizzando collagenasi purificata e proteasi neutra. Questo metodo migliora la resa e la morfologia degli isolotti riducendo la variabilità tra lotti enzimatici.

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Questo lavoro è stato sostenuto in parte da sovvenzioni NIH R01 DK060581, R01 DK083583 (sia per RGM).

A. Materiali necessari: vedere la tabella 1 (reagenti) prima della preparazione <ol><li> HBSS (P / S): 100 HBSS 10X ml + 900 ml di H 2 0 + 1% di penicillina / streptomicina (conservato in frigorifero o tenuta in ghiaccio). </li><li> 20% magazzino BSA è fatto in acqua e aliquotati e conservati a -20 ° C. </li><li> HBSS (BSA): 200 ml HBSS 1X (P / S) + 3 ml di 20% BSA (concentrazioni finali BSA 0,3%) </li><li> Islet media: RPMI + 10% FBS + glutammina 1% + 1% penicillina / streptomicina </li><li> Histopaque 1100: 240 ml 1119 Histopaque + 200 ml 1077 Histopaque </li><li> Sutura 4-0 (McKesson): tagliato in 2 pezzi ¾ pollici e conservati in una capsula di Petri cm 10 </li><li> Strumenti: Piegare la pinza da Strumenti Scienza Belle a 90 °, e limare i denti seghettati di tutte e tre le coppie di pinze. L&#39;obiettivo è quello di attutire i denti, non per rimuoverli. </li><li> Cannula per la somministrazione di collagenasi / proteasi miscela: 27G ½ pollici aghi, 30 ½ polliciago, PE50 tubi tagliati a 12 in pezzi. File entrambi gli aghi fino ad una estremità arrotondata liscia che non presenta spigoli vivi. Inserire l&#39;ago 27G in una estremità di un 12 pollici pezzo di tubo PE50. Rimuovere l&#39;ago 30G dal corpo rompendo l&#39;involucro con un paio di pinze, ruotando il corpo di ¼ di giro ogni volta. Rimuovere l&#39;ago con le pinze dall&#39;involucro e inserirlo nella estremità del tubo PE50 sotto un microscopio di dissezione. Assicurarsi di non piegare il tubo quando si inserisce l&#39;ago nel tubo PE50. L&#39;ago 27G è la fine che si allega la siringa di collagenasi. </li><li> Collagenasi (CI zyme MA) e Neutral proteasi (enzima CI BP). Ricostituire il TDE le istruzioni del produttore. Fare riferimento al Certificato lotto specifico di analisi per calcolare la concentrazione dell&#39;enzima attività. Trasferimento per un totale di 350.000 degradanti attività collagene (CDA) unità della collagenasi ricostituito e 100.000 unità di proteasi neutre del reconstitbuite Protease BP in una provetta conica e si diluisce a 15 ml in totale HBSS (P / S) </li></ol> B. Step-by-Step protocollo 1. L&#39;inflazione di pancreas con collagenasi / Proteasi Miscela <ol><li> Eutanasia del mouse per dislocazione cervicale, saturare il busto del mouse con il 70% EtOH, aperta cavità addominale completamente da ano a membrana con le forbici di dissezione e pinze. </li><li> Posizionare il mouse sulla piattaforma di un microscopio di dissezione. </li><li> Tirare il cieco e del colon ascendente fuori e metterli al di fuori della cavità del corpo alla vostra sinistra. Vedere la Figura 1 per una sintesi dei seguenti passaggi. </li><li> Posizionare i lobi del fegato contro il diaframma, che devono rimanere lì se la cavità corporea è aperto abbastanza lontano. Trova l&#39;arteria epatica, la vena porta ed il dotto biliare fagotto che porta nel fegato afferrando il duodeno con pinze curve. Con un&#39;altra coppia di pinze curve, mani sotto la vena arteria, e condotto bundle e tirare un 2 ¾ in pezzo di filo di sutura 4-0 sotto, arteria vena, dotto biliare e legare una volta e tirare il più vicino al fegato il più possibile. </li><li> Utilizzando due coppie di pinze curve, accuratamente afferrare il duodeno e trovare il dotto biliare attaccato al duodeno al papilla. Utilizzare una pinza della pinza per colpire attraverso il pancreas e proprio tessuto connettivo sotto la chiusura dotto biliare alla papilla. Ficcare il forcipe rapidamente attraverso l&#39;organo di fare un buco e poi mettere entrambe le pinze di pinza attraverso e prendere un altro 2 ¾ pollici pezzo di filo di sutura 4-0 e legarlo con una volta e tirarlo in un piccolo cerchio, ma non tirare. </li><li> Passare alla 90 ° pinze e le forbici Superfine Vännäs. Con i 90 ° pinza, pizzicare e tirare con cura l&#39;intestino tenue fino a quando il dotto biliare è teso. Fai un taglio orizzontale attraverso la papilla con le forbici a coltellate le forbici aperte nell&#39;intestino e poi il taglio con un unico movimento. Provate a fare solo one attraversano la papilla senza staccare il dotto biliare dalla papilla. </li><li> Tenendo ancora l&#39;intestino con le pinze 90 °, inserire la cannula nel dotto biliare fino a metà della lunghezza del dotto biliare, e quindi estrarre delicatamente la sutura stretto intorno alla cannula. </li><li> Riempire una siringa da 3 ml con 2,0 ml di collagenasi / proteasi o della miscela e iniettare nella cannula ad un passo lento e costante. </li><li> Dopo l&#39;inflazione del pancreas, rimuovere cannula dal dotto biliare e utilizzare le pinze curve e forbici a molla curve per rimuovere il pancreas gonfio iniziando dal colon discendente e snipping il tessuto connettivo, come si tira su l&#39;intestino. Continuare a rimuovere il pancreas dall&#39;intestino fino a raggiungere il dotto biliare, quindi rimuovere il pancreas dalla milza, poi lo stomaco e poi dai visceri della cavità addominale. Completare la rimozione tagliandoli via i punti di sutura. Aggiungere il pancreas a una provetta da 50 ml contenente 5 ml di HBSS(P / S). Questo tubo deve essere su ghiaccio. </li><li> Ripetere la procedura per ogni animale fino a quattro animali. Per ottenere risultati ottimali, si dissociano solo quattro pancreas contemporaneamente. In genere, mentre i primi quattro sono in 37 ° C bagno d&#39;acqua, si gonfia un altro pancreas quattro. </li></ol> 2. Pancreas dissociazione <ol><li> Posizionare le provette da 50 ml contenenti il ​​pancreas in un bagno di acqua 37 ° C per 15 min. </li><li> Agitare delicatamente il tubo e verificare la dissociazione dei tessuti, assicurati tessuto si smonta facilmente, quindi agitare il tubi di 12 volte mentre si sta tenendo il tubo con il coperchio. </li><li> Aggiungere non più di 30 ml di HBSS (BSA) (questo può essere una quantità inferiore, a seconda di quanto è necessario per bilanciare i tubi per la fase di centrifugazione), e centrifugare a 290 xg per un min. </li><li> Aspirare il surnatante con cura e lasciare una piccola quantità di surnatante (2-3 ml) in basso in modo da non disturbare il pellet. </li><li> Usando una siringa da 30 ml attached a 14G ago, aggiungere non più di 10 ml di HBSS (BSA) e aspirare la sospensione su e giù per 2 volte. </li><li> Filtrare la miscela cellulare attraverso un colino di plastica in una provetta da 50 ml e lavare con altri 10 millilitri HBSS (BSA). </li><li> Centrifugare a 330 xg per 2 minuti. </li><li> Sopranatante e invertire tubi di scarico su un tovagliolo di carta assorbente per 1 min. </li><li> Risospendere ogni provetta in 10 ml di freddo 1100 HISTOPAQUE. </li><li> Sovrapporre il HISTOPAQUE con 10 ml di HBSS (BSA) e centrifugare a 900 xg per 18 min. </li><li> Rimuovere l&#39;intero 20 ml di surnatante con un ampio passaggio pipetta 25 ml e passare il surnatante attraverso un filtro invertiti 70 pm. </li><li> Sciacquare le isole in una piastra da 10 cm Petri pipettando 10 media delle isole ml attraverso il filtro tenendolo a destra verso l&#39;alto sopra il piatto. </li><li> Cultura gli isolotti a 37 ° C, 5% di CO 2 coltura tissutale incubatore fino al momento per la sperimentazione. In genere, le isole sono raccolte a mano e contate prima di compeimentation. </li></ol> 3. Risultati rappresentativi Rendimenti Islet, morfologia, e la qualità sono i parametri generali utilizzati per valutare il successo di isolamento delle isole. Nelle nostre mani, rese isolotto dalla media C57BL / 6 topo sono nella gamma di 150-250 isolotti usando questo protocollo (vedere Tabella 2), e sono paragonabili ai dati ottenuti usando ottimizzato Sigma collagenasi tipo XI. Tuttavia, le rese possono variare a seconda del ceppo di topo utilizzato e l&#39;età del mouse. La maggior parte degli animali che utilizziamo sono nella fascia di età 8-16 settimane Questo protocollo è stato testato su diversi ceppi di topi, compresi C57BL / 6 (180-250 isole / topo), CD1 (200-300 isole / topo), 129 / B6 (200-300 isole / mouse), BLKS-db/db (120-200 isole / mouse), NOD (10 settimane di età, 100-150 isole / mouse), e NOD-SCID (100-150 isole / topo ). Isolotto morfologia tipica è mostrata in figura 2, in cui isole hanno un ciclo di forma allungata, con dimensioni relativamente uniforme (anche se le dimensioni uniformity può variare da ceppo a ceppo). La figura 3 mostra la nostra analisi tipica di glucosio-stimolata la secrezione di insulina da C57BL / 6 isole di topo isolate utilizzando TDES purificati vs Sigma collagenasi tipo XI. Tipicamente, una elevata qualità dei risultati delle isole preparazione in una stimolazione di insulina a 25 mM di glucosio che è 6-20 volte maggiore di quello osservato con 2,5 mM di glucosio. Altre applicazioni possono anche essere utilizzati per verificare la qualità di isole isolate, e questi includono l&#39;uso di tecniche perifusion, Ca 2 + imaging (con Fura2), e trascrizione inversa PCR, tra gli altri 11. <img src="/files/ftp_upload/4137/4137fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. Una sintesi della cannulazione del dotto biliare. <img src="/files/ftp_upload/4137/4137fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. Aspetto tipico delle isole C57BL / 6 a 24 ore di isolamento seguente. Immagini sono state acquisite su un amicroscopio convertito con ingrandimento 40X. <img src="/files/ftp_upload/4137/4137fig3.jpg" alt="Figura 3" /> Figura 3. Glucosio secrezione di insulina stimolata di C57BL / 6 isole. At 24 hr isolamento seguente, 100 isolotti sono stati incubati in un piatto da 12 pozzetti per 1 ora a 37 ° C in Krebs-Ringer Hepes tamponata soluzione contenente 2,5 mM di glucosio. Isolette sono state poi trasferite Krebs-Ringer Hepes a 2,5 mM di glucosio per una ulteriore ora, dopo che è stato raccolto il surnatante per la misura insulina utilizzando due immunospecifico sito enzimatico immunoenzimatico (ELISA) (Crystal Chem). Gli isolotti stessi sono stati successivamente trasferiti Krebs-Ringer Hepes-soluzione tamponata contenente 25 mM di glucosio, e il rilascio di insulina nel mezzo è stata misurata mediante ELISA dopo 1 ora di incubazione.

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</ol>

NDS, SAT, e RGM non hanno nulla da rivelare. AGB Autore è un dipendente VitaCyte. Autore RCM ha un interesse di proprietà in VitaCyte.

In questo protocollo, abbiamo descritto la nostra procedura per l&#39;incannulazione, perfusione con collagenasi, e la dissociazione del pancreas murino, con lo scopo di isolare le isole di Langerhans. Tecnicamente, il nostro metodo, una volta appreso, dovrebbe consentire l&#39;isolamento del pancreas entro 4 min eutanasia degli animali, e per 1 ora dovrebbe comportare l&#39;isolamento di isole da un singolo animale. La rapidità della tecnica ci permette di isolare isolotti da fino a 12 topi a un tratto tipico, ottenendo in tal modo l&#39;isolamento di fino a 3.000 isolotti. A differenza di altri protocolli che utilizzano preparazioni grezze di collagenasi, il nostro protocollo è caratterizzata dall&#39;uso di proteasi purificata, CI zyme Collagenasi MA CI enzima proteasi e BP. Variazioni nella consistenza dei preparati TDE che sono commercialmente disponibili richiede che ciascun lotto singolarmente testato e ottimizzato prima uso generale. Questo lotto a lotto variabilità ci ha portato a prendere in considerazione l&#39;uso di PuriTDES cati da VitaCyte. Questi TDES altamente purificate sono caratterizzati da più metodi tra cui l&#39;uso di sensibili saggi fluorescenza substrato marcato. Il saggio di fluorescenza CDA è più sensibile alle diverse forme molecolari di collagenasi che hanno differenti cinetiche in degradante collagene nativo. Saggi storici substrato peptidico fornire una valutazione incompleta di collagenasi. Caratterizzare collagenasi con metodi diversi assicura una maggiore attività enzimatica tra i lotti. Sulla base della nostra in-house test utilizzando una varietà di preparazioni collagenasi disponibili in commercio, abbiamo trovato che le combinazioni di enzimi purificati prodotto riproducibili da lotto a lotto risultati. I vantaggi principali di usando TDES altamente purificata e rigorosamente caratterizzato in questa applicazione sono una composizione enzimatica ottimale è definito, il lotto a lotto costanza delle prestazioni è assicurato. Tale coerenza elimina il laborioso processo di qualificazione partita normalmente richiestocollagenasi per prodotti grezzi o arricchito. TDES purificati anche consentire ulteriori modifiche della composizione per migliorare la resa e la qualità di isolotti recuperati da differenti ceppi di topi. Notifica composizioni enzimatiche ottimali per l&#39;isolamento di isolotti da diversi ceppi di topi possono essere più efficacemente comunicata. Questo, a sua volta, porta ad un uso più produttivo delle risorse e maggiore flessibilità nel disegno sperimentale. Ci sono molti passaggi critici che possono influenzare il risultato di isolamenti delle isole con il nostro protocollo. La prima è la necessità di ottenere un gonfiaggio efficace del pancreas durante la perfusione del preparato enzimatico. È importante iniziare il gonfiaggio con forza dolce sulla siringa, e aumentare la forza come si gonfia pancreas. E &#39;utile per spostare l&#39;intestino e sollevare il pancreas durante il gonfiaggio in modo che la collagenasi perfusione l&#39;intero organo. Un altro passo importante è la forza con cui si scuote il afte tubir incubazione a 37 ° C (fase 2.2). Abbiamo trovato che scuotendo il pancreas duro contro il tappo della provetta provoca frammentazione di isolotti, ma senza alcuna forma di dissociazione meccanica in questa fase, i rendimenti insule può cadere drammaticamente. È inoltre indispensabile che durante la fase di dissociazione con la siringa (passo 2.5), un livello medio forza viene applicata durante il movimento su e giù con lo stantuffo, questo assicura un&#39;adeguata dissociazione tessuto prima della fase di filtrazione (2,6), dove poco il tessuto deve essere trattenuta dal filtro colino da tè. Infine, l&#39;ultimo passo da seguire con attenzione è l&#39;aspirazione di tutta la 20 ml delle isole HISTOPAQUE frazionati. Anche se isole sono in genere a livello di interfaccia del HISTOPAQUE e HBSS, abbiamo scoperto che si perde isole quando cerchiamo di rimuovere solo l&#39;interfaccia, invece, ora rimuovere l&#39;intero 20 ml con un ampio passaggio pipetta 25 ml. Abbiamo aggiunto la filtrazione attraverso il filtro inverso 70 micron (passo 2.11) per eliminare la necessità di centrifuge le isolette più volte per lavare via il HISTOPAQUE.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome del reagente </td><td> Azienda </td><td></td><td> Catalogo # </td></tr><tr><td> HBSS 10X </td><td> Life Technologies </td><td> 14065 </td><td></td></tr><tr><td> RPMI </td><td> Fisher Scientific </td><td> 10-040 </td><td></td></tr><tr><td> BSA </td><td> Sigma Aldrich </td><td> qualsiasi </td><td></td></tr><tr><td> Histopaque 1077 </td><td> Sigma Aldrich </td><td> 10771 </td><td></td></tr><tr><td> Histopaque 1119 </td><td> Sigma Aldrich </td><td> 11191 </td><td></td></tr><tr><td> 4-0 sutura 100 m rotolo </td><td> McKesson </td><td> 451521 </td><td></td></tr><tr><td> 14 g smussato &#39;ago </td><td> Fisher Scientific </td><td> 14-8216M </td><td></td></tr><tr><td>Vännäs Superfine SCISS </td><td> Fisher Scientific </td><td> 501778 </td><td></td></tr><tr><td> Forbici curve Primavera </td><td> Fisher Scientific </td><td> 14127 </td><td></td></tr><tr><td> Pinze curve (2) </td><td> Fisher Scientific </td><td> 15914G </td><td></td></tr><tr><td> Pinze curve (di 90 °) </td><td> Strumenti Scienza Belle </td><td> 11052-10 </td><td></td></tr><tr><td> 27G mezzo ago pollici </td><td> Fisher Scientific </td><td> 305109 </td><td></td></tr><tr><td> 30G ago 1/2 pollice </td><td> Fisher Scientific </td><td> 305106 </td><td></td></tr><tr><td> PE tubo </td><td> Becton Dickinson </td><td> 427411 </td><td></td></tr><tr><td> Collagenasi MA </td><td> Vitacyte, LLC </td><td> 001-2030 </td><td></td></tr><tr><td> BP Proteasi </td><td> Vitacyte, LLC </td><td> 003-1000 </td><td></td></tr><tr><td> 3 ml siringa </td><td> Fisher Scientific </td><td> 309585 </td><td></td></tr><tr><td> Siringa da 30 ml </td><td> Fisher Scientific </td><td> 309650 </td><td></td></tr><tr><td> 70 pm filtro </td><td> Fisher Scientific </td><td> 352350 </td><td></td></tr><tr><td> 10 cm 2 Petri </td><td> Fisher Scientific </td><td> 351005 </td><td></td></tr><tr><td> Tè colino in plastica </td><td> Ogni cucina di alimentazione </td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Reagenti Tabella 1. E attrezzature </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td><table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0" width="510"><tbody><tr><td> Sigma tipo XI (L010M8618) </td><td> MA (100615) BP (110329) </td><td> MA (081104) BP (100823) </td><td> MA (091211) BP (101109) </td></tr><tr><td> 216 (± 74) </td><td> 260 (± 45) </td><td> 157 (± 37) </td><td> 200 (± 4) </td></tr></tbody></table></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Tabella 2. Rendimenti isole media (± DS) con un sacco TDE diverse * * I dati rappresentano i rendimenti medi delle isole di almeno 10 topi. I numeri di lotto tra parentesi </td></tr></tbody></table>

mouse isolotto di langerhans isolamento utilizzando una combinazione di collagenasi depurato e proteasi neutra

Mouse Islet of Langerhans Isolation using a Combination of Purified Collagenase and Neutral Protease

L&#39;interrogazione di espressione genica delle cellule beta e funzione in vitro è spostato esattamente negli anni dallo studio di linee cellulari tumorali roditore allo studio di isole isolate roditori. Isole principali offrono il vantaggio che più rispecchiano fedelmente la biologia di vie di segnalazione intracellulare e risposte secretorie. Considerando che il metodo di isolamento delle isole utilizzando tessuti dissociando enzimatici (TDE) preparativi è stato ben definito in molti laboratori di 1-4, le variazioni nella consistenza della resa delle isole e di qualità da qualsiasi ceppo roditore dato limitare la portata e la fattibilità di studi delle isole principali. Queste variazioni si verificano spesso come risultato delle TDES grezzi parzialmente purificati utilizzati nella procedura di isolamento isolotto; TDES spesso presentano lotto a lotto variazioni nell&#39;attività e spesso richiedono adattamenti della dose di enzima impiegato. Un piccolo numero di report hanno utilizzato purificato TDES per isolamenti cellulari roditore 5, 6 </sup&gt;, ma la pratica non è diffusa, nonostante l&#39;uso di routine ed i vantaggi di purificato TDES per isolamenti delle isole umane. In collaborazione con VitaCyte, LLC (Indianapolis, IN), abbiamo sviluppato un protocollo modificato isolotto topo isolamento basato su quello descritto da Gotoh 7, 8, in cui vengono perfuse le TDES direttamente nel dotto pancreatico di topi, seguito da frazionamento tessuto greggio attraverso un gradiente Histopaque 9, e l&#39;isolamento di isolotti purificato. Una differenza significativa nel nostro protocollo è l&#39;uso di collagenasi purificata (CI zyme MA) e neutro proteasi (CI zyme BP) combinazione. La collagenasi è caratterizzato dall&#39;uso di un collagene 6 degradante attività di fluorescenza (CDA) saggio che utilizzato contrassegnati in modo fluorescente solubili fibrille vitello come substrato 6. Questo substrato è più predittiva della cinetica di degradazione del collagene nella matrice del tessuto perché si basa su collagene nativo come substrato. La proteasi è characterized con un sensibile test di fluorescenza cinetica 10. Utilizzando questi saggi migliori insieme con la più tradizionale analisi biochimiche consentire la TDE da produrre in modo più coerente, con conseguente miglioramento delle prestazioni la coerenza tra i lotti. Il protocollo qui descritto è stato ottimizzato per la massima resa isolotto e morfologia isolotto ottimale utilizzando topi C57BL / 6. Durante lo sviluppo di questo protocollo, diverse combinazioni di collagenasi e proteasi neutre stati valutati a diverse concentrazioni, e il rapporto finale di collagenasi: proteasi neutra di 35:10 rappresenta enzima prestazioni paragonabili a Sigma tipo XI. Poiché significativa variabilità delle rese insule media da diversi ceppi di topi e ratti sono stati riportati, ulteriori modifiche della composizione TDE dovrebbe essere fatto per migliorare la resa e la qualità di isolotti recuperati da diverse specie e ceppi.

Una descrizione dettagliata di isolamento del mouse isolotto è descritta utilizzando la tecnica di incannulazione in situ duttale pancreatico e perfusione di una combinazione di purificato collagenasi e proteasi neutra.

Mouse Isolotto di Langerhans isolamento utilizzando una combinazione di Collagenasi depurato e proteasi neutra

L'indagine sull'espressione genica e sulla funzione delle cellule beta in vitro è passata negli anni, in modo netto, dallo studio di linee cellulari tumorigeniche di roditore...

L'obiettivo generale di questa procedura è isolare con successo gli isolotti dal pancreas di un topo. Questo viene ottenuto isolando innanzitutto il pancreas dal tessuto circostante. Successivamente, il dotto biliare viene cannullato in modo che il pancreas possa essere gonfiato con la miscela di proteasi collagenasi.Dopo il gonfiamento, il pancreas viene rimosso e gli isolotti vengono accuratamente dissociati. Infine, gli isolotti isolati vengono filtrati e seminati per un uso futuro. In definitiva, questo metodo di isolamento degli isolotti mediante collagenasi purificata e proteasi neutra viene utilizzato per ottenere un rendimento massimo di isolotti e una morfologia ottimale degli isolotti.Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti di isolamento degli anelli tracheali è che abbiamo eliminato la variabilità tra diversi lotti utilizzando enzimi purificati. Inoltre, abbiamo apportato modifiche o miglioramenti ad alcuni protocolli per ottimizzare la morfologia degli anelli. Dopo l'eutanasia, coprire il tronco con etanolo al 70% prima di aprire completamente la cavità addominale dall'ano al diaframma.Successivamente, posizionare il topo sulla piattaforma di un microscopio stereoscopico. Estrarre il cieco e il colon ascendente e spostarli all'esterno della cavità corporea a sinistra; spostare i lobi del fegato contro il diaframma. Se questi non rimangono in posizione autonomamente, allargare l'apertura della cavità corporea.Afferrare il duodeno con pinze curve e individuare il fascio composto dall'arteria epatica, dalla vena porta e dal dotto biliare che si dirige verso il fegato. Con un'altra coppia di pinze curve, inserire un punto di sutura sotto il fascio di arteria, vena e dotto, quindi stringerlo il più vicino possibile al fegato.Utilizzando due paia di pinze curve, afferrare con cura il duodeno e individuare il dotto biliare attaccato alla papilla. Con una delle ganasce della pinza, forare il pancreas e il tessuto connettivo subito al di sotto del dotto biliare e in prossimità della papilla. Rapidamente, passare la pinza attraverso il foro e inserire un punto di sutura, legandolo in modo lento attorno al dotto biliare per creare un piccolo cerchio utilizzando pinze a 90 gradi.Estrarre l'intestino tenue fino a quando il dotto biliare non risulta teso. Effettuare un taglio orizzontale attraverso la papilla con forbici finissime senza staccare il dotto biliare dalla papilla, tenendo ferma l'intestino. Inserire una cannula nel dotto biliare e quindi stringere delicatamente il punto intorno alla cannula.Successivamente, riempire una siringa da tre millilitri con 2,0 millilitri di miscela di collaghenasi e proteasi. Iniettare questa miscela nella cannula a un ritmo lento e costante. Al termine del rigonfiamento del pancreas, rimuovere la cannula dal dotto biliare.Partendo dal colon discendente, recidere il tessuto connettivo tirando verso l'alto l'intestino fino a raggiungere il dotto biliare. Successivamente, separare il pancreas dalla milza e dai tessuti circostanti. Infine, tagliare i punti di sutura ed asportare il pancreas.Dopo il prelievo, collocare il pancreas in un tubo da 50 millilitri contenente cinque millilitri di HBSS su ghiaccio. Una volta raccolti tutti i campioni, inserire i tubi da 50 millilitri contenenti il tessuto pancreatico in un bagnomaria a 37 gradi Celsius. Agitare delicatamente il tubo per 15 minuti e verificare la dissociazione del tessuto.Assicurarsi che il tessuto si separi facilmente tenendo il tubo dal coperchio. Ruotare 12 volte per dissociare ulteriormente il tessuto. Aggiungere non più di 30 millilitri di HBSS e centrifugare.Aspirare con attenzione il soprannatante lasciando una piccola quantità di soprannatante sul fondo, in modo da non disturbare il pellet cellulare. Utilizzando una siringa da 30 millilitri collegata a un ago da 14 gauge, aggiungere non più di 10 millilitri di HBSS ed aspirare su e giù la sospensione per due volte. Filtrare la miscela cellulare attraverso un filtro T in plastica in un tubo da 50 millilitri.Risciacquare con altri 10 millilitri di HBSS e centrifugare. Decantare il soprannatante e capovolgere le provette per farle sgocciolare su carta assorbente per un minuto. Ripesare ogni provetta in 10 millilitri.Freddo 1100. Il suo strato opaco, il suo strato opaco con 10 millilitri di HBSS e centrifuga. Rimuovere tutti i 20 millilitri di sopranatante utilizzando una pipetta da 25 millilitri a grande apertura e far passare il sopranatante attraverso un filtro da 70 micron posizionato al contrario.Filtrare direttamente gli anellini in una piastra di Petri e risciacquare pipettando 10 millilitri di mezzo per anellini attraverso la coltura filtrata. Mantenere gli anellini in un incubatore per colture cellulari fino al momento dell'esperimento. I parametri generali utilizzati per valutare il successo dell'isolamento degli anellini sono la resa, la morfologia e la qualità.Viene mostrata qui la morfologia tipica degli occhielli. Gli occhielli hanno una forma rotonda o leggermente allungata con dimensioni relativamente uniformi. Qui, occhielli isolati sono stati analizzati per la secrezione di insulina stimolata dal glucosio.La stimolazione dell'insulina è stata simile tra gli occhietti preparati con Sigma Type 11 rispetto a ci zyme TM, MABP, indicando un'elevata qualità della preparazione degli occhietti. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come cannuclare il dotto biliare di un topo. Lavora con zyme collagenasi e neutro proteasi per isolare le tue palpebre per qualsiasi saggio.

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Murino pancreatica isolamento Islet

Le isole pancreatiche, chiamate anche isole di Langerhans, sono un gruppo di cellule endocrine che producono ormoni per la regolazione del glucosio e altre importanti funzioni biologiche. Questo protocollo spiega un metodo per isolare le isole pancreatiche mediante prima perfusione di collagenasi tramite l'ampolla di Vater per digerire il tessuto pancreatico esocrino e una centrifugazione semplificata in gradiente di densità per purificare le isole dai topi.

Isolamento delle isole pancreatiche attraverso la perfusione di collagenasi: un metodo enzimatico per isolare le cellule delle isole pancreatiche

Saggio funzione in vitro β-cellulare utilizzando isolate del mouse isole di Langerhans è una componente importante nello studio della fisiopatologia del diabete e terapeutica. Mentre molte applicazioni a valle sono disponibili, questo protocollo descrive specificamente la misurazione di intracellulare adenosina monofosfato ciclico (cAMP) come parametro essenziale determinare la funzione β-cellulare.

Un metodo per l&#39;isolamento del mouse isole pancreatiche e intracellulare cAMP Determinazione

Presentiamo qui un protocollo per l'isolamento delle isole dal modello murino di diabete di tipo 2, Leprdb e i dettagli di un test su cellule vive per la misurazione della secrezione di insulina da isole intatte che utilizza la microscopia a 2 fotoni.

LEPR<sup&gt; Db</sup&gt; Mouse Modello di diabete di tipo 2: pancreas isolamento Islet e live-cella 2-Photon Imaging di isolotti Intact

Descriviamo qui un protocollo per isolare isolotti intatti da topi neonati. Pancreas sono stati parzialmente digerito con collagenasi, seguita da lavaggio e raccolta manuale. 20 - 80 clusters insule possono essere ottenuti per pancreas da topi appena nati, che sono adatti per diversi studi insulari.

Efficace isolamento di isole funzionali da neonatali mouse Pancreas

Questo protocollo di isolamento dell'isolotto ha descritto una nuova via di iniezione di collagenasi per digerire il tessuto esocrino e una procedura di gradiente semplificata per purificare le isole dai topi. Si tratta di digestione ezimatica, separazione/purificazione del gradiente e raccolta a mano dell'isolotto. Il successo dell'isolamento può produrre 250-350 isolotti di alta qualità e completamente funzionali per mouse.

Un semplice protocollo ad alta efficienza per l'isolamento delle isolozioni pancreatiche dai topi

Qui presentiamo un protocollo per isolare le cellule delle isole pancreatiche del mouse per lo screening di induzioni ROS dai xenobiotici al fine di identificare i potenziali prodotti chimici xenobiotici diabetogeni.

Uno Screening basati su cellule dell'isolotto pancreatico murino per prodotti chimici ambientali diabetogeni

In questo protocollo, viene descritto un metodo di isolamento murine ilet e trapianto nel tessuto adiposo bianco sottocutaneo inguinale. Le isole di murine singeniche isolate vengono trapiantate in un recipiente murino utilizzando un idrogel di membrana sotterranea. Viene monitorato il livello di glucosio nel sangue dei destinatari e viene eseguita l'analisi istologia degli innesti di islet.

Modello di trapianto di Murine (ISWAT) del tessuto adiposo sottocutaneo inguinale (ISWAT)

Qui delineiamo e dimostriamo un protocollo per l'isolamento primario delle cellule endoteliali sinusoidali epatiche del topo (LSEC). Il protocollo si basa sulla perfusione di collagenasi epatica, sulla purificazione delle cellule non parenchimali mediante centrifugazione a bassa velocità e sulla selezione magnetica delle perline CD146. Abbiamo anche fenotipo e caratterizzato questi LSECs isolati utilizzando la citometria a flusso e la microscopia elettronica a scansione.

Isolamento e caratterizzazione di cellule endoteliali sinusoidali primarie del fegato di topo

Questo studio ha sviluppato un metodo semplificato per estrarre in modo efficiente isolotti primari funzionali e cellule acinar dal pancreas del topo, offrendo uno strumento prezioso per studiare la comunicazione intercellulare nella patogenesi del diabete indotto da pancreatite acuta.

Un metodo semplice e rapido per l'isolamento simultaneo degli isolotti primari e delle cellule acinari pancreatiche primarie da topi

Questo protocollo descrive un metodo standardizzato per il prelievo chirurgico, la digestione enzimatica e la purificazione con gradiente di densità degli isolotti pancreatici del ratto Lewis, consentendo preparazioni ad alta resa e alta purezza per l'uso diretto in studi di trapianto o in vitro .

Isolamento e purificazione degli isoli pancreatici da ratti Lewis tramite digestione enzimatica e separazione tra densità e gradiente

Impara l'isolamento degli isolotti di Langerhans da pancreas murino utilizzando collagenasi purificata e proteasi neutra. Questo metodo migliora la resa e la morfologia degli isolotti riducendo la variabilità tra lotti enzimatici.

Mouse Isolotto di Langerhans isolamento utilizzando una combinazione di Collagenasi depurato e proteasi neutra

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