Studio genetico della rigenerazione assonale con colture di neuroni adulti Root dorsali gangliari

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di stabilire un modello in vitro per lo studio della rigenerazione degli assoni nei mammiferi utilizzando neuroni gangliari della radice dorsale adulta o neuroni DRG. Ciò si ottiene sezionando prima i DRG da topi adulti, che vengono poi dissociati in singole cellule. Quindi i neuroni dissociati vengono trasfettati mediante elettroporazione e coltivati per alcuni giorni per manipolare geneticamente la loro espressione genica.

Il passaggio finale consiste nel risospendere e reflazionare i neuroni per un'ulteriore coltura notturna. In definitiva, l'analisi della lunghezza degli assoni basata sulla microscopia viene utilizzata per studiare la ricrescita degli assoni da neuroni geneticamente manipolati. Il vantaggio principale della sospensione del resus cellulare e del passaggio ripetuto utilizzati in questa tecnica è che consente l'analisi della crescita degli assoni da neuroni che sono già stati manipolati geneticamente.

Questa tecnica è particolarmente utile per la perdita di funzione Gli studi in cui l'approccio RNI viene utilizzato per sottoregolare il gene di interesse che dimostrano la procedura sarà il Dr.Sfu, un borsista postdoc del mio laboratorio. Per preparare prima i vetrini di copertura per coltura neuronale, bagnarli in acido cloridrico al 10% per una notte. Il giorno successivo scaldateli sonicamente in acqua distillata per un'ora.

In tre segmenti di 20 minuti, conservare i vetrini coprioggetto puliti in etanolo al 70% e lasciarli asciugare all'aria prima dell'uso. Successivamente per rivestire i vetrini di copertura essiccati. Impostare una piastra multipozzetto con una barbottina e 100 microlitri di soluzione di rivestimento per pozzetto.

Incubare le piastre senza alcuna agitazione per una o due ore a 37 gradi Celsius. Dopo l'incubazione, rimuovere la soluzione di rivestimento e lavare il coperchio Slips tre volte con un XPBS sterile. Dopo aver sacrificato un topo adulto di sei-10 settimane completamente anestetizzato, insensibile alle sensazioni dolorose.

Per prima cosa, rimuovi la sua pelle dorsale. In secondo luogo, tagliare tutte le vertebre dal collo alla coda, compresi i tessuti attaccati. Infine, rimuovere tutti gli organi interni attaccati all'interno del tessuto.

Sciacquare la colonna vertebrale rimossa con un XPBS due o tre volte, quindi fissarla a una placca di dissezione con il lato ventrale rivolto verso l'alto. Rimuovere con cura i muscoli per esporre i nervi sensoriali. I nervi collegati ai DRG a livello lombare sono i più spessi e sono facilmente localizzabili.

Pertanto, per la maggior parte degli esperimenti, vengono raccolti solo i DRG lombari. Taglia ogni vertebra lungo la linea centrale con piccole forbici e rimuovi con cura i dischi intervertebrali per isolare le vertebre. Iniziando da L uno, usa una pinza per dividere ciascuna vertebra e sezionare i DRG lombari.

Localizzare i DRG con una pinza tracciando ciascun nervo lombare verso il midollo spinale. Ripeti questo processo da L due a L sei. Quindi, usa le forbici a molla per tagliare le radici dorsali e ventrali del nervo periferico dai DRG isolati.

Se necessario, conservare i DRG in una provetta refrigerata da 1,5 millilitri riempita con terreno em EM. La stessa procedura può essere utilizzata per raccogliere DRG da altri livelli spinali. Dopo aver raccolto tutti i DRG, sostituire il terreno MEM con un millilitro, collagenasi una soluzione e incubare i DRG a 37 gradi Celsius per 90 minuti.

Successivamente, sostituire la soluzione di collagenasi A con 500 microlitri di una soluzione di digestione tripla E express e rimettere i tubi nell'incubatore per altri 15-20 minuti dopo la seconda digestione. Lavare i DRG sostituendo la soluzione con un millilitro di terreno preparato contenente il 5% di FBS, agitare i DRG e lasciarli depositare. Ripetere questo lavaggio.

Procedere due volte prima di procedere. Dopo aver rimosso l'ultimo lavaggio, aggiungere 600 microlitri di terreno di coltura e pipettare delicatamente su e giù per tri i tessuti. Eseguire questa operazione da 20 a 30 volte utilizzando un puntale per pipetta da 1000 microlitri dopo che il tri ha permesso ai tessuti non dissociati di depositarsi sul fondo del tubo per microfuge.

Trasferire solo la sospensione cellulare in una provetta sterile da 10 millilitri e aggiungere altri 600 microlitri di terreno di coltura. Ripetere il tri step fino a quando la maggior parte dei tessuti non si è dissociata. La sospensione contiene sia neuroni che cellule non neuronali.

Tipicamente, circa 50.000 cellule vengono raccolte da sei dgs sufficienti per una reazione di elettroporazione, centrifugano le celle dissociate di sei dgs e scartano quanto più surnatante possibile. Quindi risospendere le cellule in 100 microlitri di soluzione di trasfezione contenente DNA, plasmide o RNA SI con tre o quattro movimenti delicati attraverso un puntale di pipetta da 200 microlitri. Trasferire la sospensione in un elettroporazione, vete ed elettroporare le celle dopo l'elettroporazione.

Aggiungere immediatamente 500 microlitri di terreno di coltura caldo contenente FBS alla vete. Per la maggior parte degli esperimenti che richiedono la sospensione di Resus e la coltura di replating, i neuroni su un piatto di coltura di plastica a 10-20.000 cellule per pozzetto. Tuttavia, per esaminare la crescita degli assoni direttamente dopo l'elettroporazione, i neuroni possono essere placcati direttamente su vetrini di vetro rivestiti a una velocità compresa tra tre e 5.000 cellule per pozzetto.

Dopo quattro ore di coltura cellulare, i neuroni si saranno attaccati al substrato. Sostituire delicatamente il terreno contaminato con la soluzione di trasfezione con 500 microlitri di terreno fresco riscaldato e rimettere le piastre nell'incubatore. L'analisi dell'espressione genica dai plasmidi del DNA è fattibile solo poche ore dopo l'elettroporazione.

Tuttavia, per analizzare la sottoregolazione dell'espressione genica nella nuova crescita assonale, è necessario un tempo di coltura più lungo. Dopo tre giorni di coltura sulle piastre ad alta densità, sostituire il terreno con un millilitro di terreno fresco preriscaldato e lavare i neuroni in soluzione con sei-10 colpi delicati della pipetta. Quindi le cellule non neuronali rimarranno attaccate alla piastra, trasferiranno i neuroni risospesi in un tubo micro fuge e li T delicatamente da 10 a 15 volte per dissociare i grumi cellulari.

Per garantire un uso più facile della sospensione del neurone attaccato dopo tre giorni di coltura, il rivestimento del piatto di coltura prima della coltura iniziale è limitato a sole 1, 2, 3 ore. Durante le fasi di sospensione a S, di solito controlliamo costantemente le cellule al microscopio invertito per osservare se le cellule sono staccate dalla piastra di coltura. I neuroni su vetrini di copertura appena preparati a bassa densità il giorno successivo, analizzano le nuove escrescenze assonali.

In assenza di fattori di crescita extracellulari aggiunti, i neuroni DRG adulti di solito iniziano a crescere gli assoni. 48 ore dopo la prima placcatura, gli assoni mostrano spesso morfologie ramificate. Al contrario, i neuroni riplaccati iniziano ad estendere gli assoni solo poche ore dopo la placcatura e gli assoni si allungano con una ramificazione ridotta.

Questi risultati suggeriscono che i neuroni riposizionati condividono proprietà simili a quelle dei neuroni rigeneranti in vivo. Utilizzando questo approccio, è stato utilizzato uno studio sulla perdita di funzione per esaminare il ruolo dei fattori di trascrizione associati alla rigenerazione assonale vedi JU nella crescita degli assoni dai neuroni DRG adulti. In vitro.

I risultati hanno mostrato che l'elettroporazione di un gruppo di quattro diversi irna che prendono di mira diverse regioni di cgen riduce notevolmente i livelli proteici di cgen nei neuroni DRG adulti. Tre giorni dopo la trasfezione, quando i neuroni sono stati riplaccati e coltivati durante la notte, la crescita degli assoni da cgen knockdown è stata significativamente ridotta. Questi risultati indicano che i neuroni DRG adulti in coltura forniscono un utile sistema modello per studiare la crescita degli assoni dai neuroni adulti.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come sezionare il trasfetto e la cultura. L'adulto deve anche radicare i neuroni gangliari per studiare la rigenerazione degli incidenti di membrana in vitro.