Microdialisi di etanolo durante la determinazione operante auto-amministrazione ed etanolo etanolo mediante gascromatografia

L'obiettivo generale di questa procedura è monitorare i livelli di etanolo nel dialisato cerebrale durante una sessione di autosomministrazione di etanolo. Al fine di confrontare questa misura con i comportamenti di autosomministrazione sincrona, ciò si ottiene impiantando prima chirurgicamente una guida per microdialisi, una cannula e un bullone di fissaggio, quindi addestrando i ratti ad autosomministrarsi l'etanolo. Il secondo passo consiste nell'abituare i ratti al cavo dello stadio principale in modo che non impedisca l'autosomministrazione dell'etanolo durante la microdialisi.

Quindi la microdialisi viene eseguita durante una sessione di autosomministrazione di etanolo durante la quale una porzione di dialato viene preparata per l'analisi dell'etanolo. Successivamente, i campioni di dialato vengono analizzati per la concentrazione di etanolo utilizzando un gascromatografo con rilevamento a ionizzazione di fiamma. In definitiva, i risultati ottenuti mostrano il decorso temporale dell'etanolo che raggiunge la regione cerebrale di interesse durante una sessione di autosomministrazione di etanolo.

Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti come la puntura della coda o della vena safena è che questa procedura è minimamente dirompente al momento della raccolta del campione e consente la misurazione del farmaco nel tempo nella regione del cervello di interesse mentre l'animale sta eseguendo un compito comportamentale. In generale, le persone che non conoscono questo metodo avranno difficoltà perché richiede una serie di competenze specializzate, molte delle quali possono essere acquisite solo attraverso la pratica o l'esperienza ripetuta. A dimostrare la procedura sarà anche Jeffrey Dilley, un assistente di ricerca universitario nel nostro laboratorio.

Tutte le procedure per gli animali mostrate sono approvate dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali dell'Università del Texas e seguono tutte le guide per la cura e l'uso delle normative sugli animali da laboratorio. L'Università del Texas ad Austin è una struttura accreditata ALAC: per questi esperimenti di microdialisi comportamentale vengono utilizzati ratti Evans lunghi ben maneggiati che sono stati impiantati chirurgicamente con una cannula calibro 21 sopra la regione cerebrale di interesse. Tutti gli animali devono ricevere almeno una settimana di cure post-chirurgiche e di recupero e devono essere in buona salute prima di iniziare le procedure successive.

Posizionare il ratto in una camera operante med associates, dotata di una leva retrattile lichter e di un tubo ribaltabile e addestrarlo a premere la leva per accedere a una soluzione di saccarosio al 10%. Dopo che il ratto è stato addestrato a rispondere alla soluzione di saccarosio, iniziare con un programma di allenamento appropriato durante il quale l'etanolo viene gradualmente aggiunto alla soluzione nel corso di più sessioni di consumo la notte prima della penultima sessione operativa. Dopo aver anestetizzato l'animale e controllato il livello di sedazione, collegare la molla di ancoraggio al bullone di ancoraggio sul tavolino della testa del ratto per abituarlo all'apparecchio che consiste in una leva di contrappeso, un braccio, una cinghia girevole, una molla e un supporto ad anelli.

Consentire al ratto di trascorrere la notte nella stanza operativa della sua gabbia domestica con ad lido, cibo e acqua, e poi completare la sessione di addestramento del giorno successivo con il laccio e l'attrezzatura di accompagnamento in posizione il giorno prima dell'esperimento di microdialisi. Dopo aver anestetizzato il ratto con isof fluoro, verificare la sedazione eseguendo un pizzicamento delle dita dei piedi e inserire una sonda di microdialisi perfusa con liquido cerebrospinale artificiale. Fissare la sonda in modo appropriato, quindi regolare la portata della sonda a 0,2 microlitri al minuto.

Metti il ratto nella sua gabbia domestica nella stanza operativa per passare la notte con tutte le apparecchiature di dialisi in posizione e aggiungi lib, cibo e acqua. Il giorno dopo aver inserito la sonda, almeno due ore prima dell'inizio dell'esperimento, alzare la sonda alla sua portata di lavoro. Utilizzando una siringa Hamilton, verificare che la portata della sonda sia costante e sia almeno il 90% della portata impostata.

Se si valutano i neurotrasmettitori nei campioni di dialisi, prelevare campioni durante tutte le fasi dell'esperimento. Inizia raccogliendo campioni di dialisi mentre l'animale è nella sua gabbia domestica. Conservare i campioni in modo appropriato per un'analisi successiva.

Trasferire con cautela il ratto nella camera operante e avviare il programma operante che controlla la camera. Continuare a prelevare campioni mentre il ratto attende che la leva si estenda nella camera di due campioni prima che la leva si estenda. Iniziare a raccogliere una parte di ciascun campione di dialisato per l'analisi dell'etanolo pipettando un'aliquota appropriata di dialisato in una fiala di vetro da due millilitri e sigillando la fiala con un setto ermetico, pipettare e sigillare rapidamente i campioni di etanolo.

Poiché l'etanolo è volatile e il volume del campione è piccolo, una preparazione del campione incoerente o lenta porterà a risultati imprecisi. Conservare il resto per l'analisi dei neurotrasmettitori. Il periodo di bevuta di 20 minuti inizia dopo che il programma informatico di Med Associates estende la leva nella camera e il topo la preme per accedere a una bottiglia di soluzione potabile.

Continuare a prelevare campioni per tutto il periodo di bevuta dopo il periodo di bevuta, il programma del computer ritira la bottiglia dalla camera. Tenere l'animale nella camera per un ulteriore periodo di 20 minuti dopo l'assunzione al termine dell'esperimento di microdialisi. Dopo aver anestetizzato il ratto, rimuovere la sonda.

Se l'animale non viene immediatamente soppresso in modo umanitario, sostituire l'obteratore per garantire la visualizzazione del tratto della sonda. Raccogli il cervello entro tre giorni dall'esperimento. Analizza i campioni insieme agli standard di etanolo esterni utilizzando un gascromatografo con un rivelatore a ionizzazione di fiamma, un campionatore automatico dello spazio di testa, riscaldato a 50 gradi Celsius e una colonna capillare con elio come fase mobile.

Per la registrazione e l'analisi dei cromatogrammi, utilizzare il software della workstation cromatografica per preparare il sistema per l'analisi dell'etanolo. Utilizzare un bagno d'acqua a ricircolo per riscaldare la piastra del campionatore dell'auto e aprire i serbatoi dell'aria e dell'idrogeno. Quindi, avvia il programma di avvio.

Quando è pronto, inizia una combustione di 20 minuti, che decontamina la fibra. Fate degli standard utilizzando un matraccio tarato da 100 millilitri per diluire 238 microlitri di etanolo al 95% con acqua fino a un volume finale di 100 millilitri. Utilizzare una diluizione seriale uno a uno per creare standard.

Pipettare gli standard in fiale di vetro e sigillarli esattamente come sono stati preparati i campioni. Assicurati di eseguire un vuoto d'acqua insieme ai tuoi standard. Posizionare gli standard e i campioni nel vassoio del campionatore automatico e riscaldarli fino a quando l'intera aliquota del liquido non è stata vaporizzata.

Per eseguire gli standard e i campioni, creare un elenco di campioni che indichi quale campione si trova in quale slot del campionatore automatico e che ogni campione debba essere perforato. Una volta instradati i file di dati in una cartella selezionata, selezionare un metodo di scelta per i campioni e iniziare l'esecuzione. Dopo che il sistema ha analizzato i campioni, verificare che il programma abbia integrato correttamente ogni picco.

Grafico, l'altezza del picco in funzione di ogni standard esterno noto. Concentrazione di etanolo. Utilizzare la funzione lineare data dai punti per interpolare la concentrazione di etanolo di ciascun campione di dializzato.

Questa figura mostra esempi di cromatogrammi per tre concentrazioni di standard di etanolo e uno per un campione di dialisato di ratto raccolto alla fine della sessione di autosomministrazione di etanolo. I picchi di etanolo dovrebbero essere relativamente simmetrici, avere tempi di ritenzione costanti e un rapporto segnale/rumore superiore a 10. Il mancato rispetto di questi criteri significa che il sistema richiede manutenzione, cromatografia di qualità e standard corretti che producono una curva standard lineare che viene utilizzata per calcolare la concentrazione di etanolo dei campioni di dialisato raccolti da animali autosomministrati di etanolo nel corso della loro autosomministrazione.

Le concentrazioni di etilizzato dialisato derivate non sono corrette per il recupero della sonda in vivo e sono solo una frazione della concentrazione di etanolo nel tessuto cerebrale. Se è necessaria la microdialisi quantitativa dell'etanolo, viene determinata sperimentalmente la frazione di estrazione dell'etanolo che si diffonde dallo spazio extracellulare nella sonda. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in circa quattro o cinque ore se eseguita correttamente.

Questo varierà in base alla durata della sessione comportamentale. Il completamento con successo della fase di microdialisi dell'esperimento dipende in gran parte dalla qualità delle fasi preparatorie. Durante il tentativo di questa procedura è importante essere sicuri che i ratti siano ben maneggiati e che li abbiate abituati a eventuali stimoli distraenti che potrebbero verificarsi durante l'esperimento di dialisi, in modo che il comportamento di autosomministrazione dell'animale non ne risenta.