Costante pressione controllata metodo di estrusione per la preparazione del Nano di dimensioni vescicole lipidiche

L'obiettivo generale del seguente esperimento è presentare un metodo affidabile per la preparazione di vescicole lipidiche di rilevanza biologica. Questo viene ottenuto mescolando e trasferendo fosfolipidi in vial di vetro e idratandoli con un tampone acquoso per creare una sospensione multilamellare di SLE. Come secondo passaggio, si esegue un metodo di congelamento e scongelamento, che successivamente porta alla produzione di vescicole Ella a partire da vescicole multilamellari.

Successivamente, la sospensione di liposomi viene fatta passare attraverso un estrusore utilizzando la pressione ottimale determinata per produrre vescicole lipidiche omogenee di dimensioni desiderate. Sono stati ottenuti risultati che mostrano dimensioni costanti delle vescicole submicroniche, basati sulla diffusione dinamica della luce e sull'analisi del tracciamento delle nanoparticelle. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti come la sonificazione e la sedimentazione è che questo metodo utilizza un sistema di controllo della pressione con portate ottimali di azoto determinate per una preparazione efficiente delle dimensioni delle vescicole lipidiche.

Per iniziare questa procedura, procurarsi un vial di vetro da 20 millilitri con tappo rivestito in Teflon, pulire tutta la vetreria e le siringhe con cloroformio prima dell'uso per evitare contaminazioni. Trasferire 100 microlitri di cloroformio di grado reagente nel vial di vetro utilizzando una siringa di vetro ermetica da 250 microlitri. Aggiungere 30 microlitri di metanolo di grado reagente nello stesso vial di vetro utilizzando una siringa di vetro ermetica da 100 microlitri.

Preparare una soluzione lipidica di colesterolo pop C a due millimolari trasferendo 216 microlitri di pop C a 10 milligrammi per millilitro, 42 microlitri di pop E a 10 milligrammi per millilitro e 20 microlitri di colesterolo a 11 milligrammi per millilitro in un vial di vetro da 20 millilitri. Evaporare i solventi organici utilizzando un flusso lento di gas argon o azoto fino a quando si osserva un film sottile di lipidi sul fondo del vial. Posizionare il vial di vetro senza tappo in un essiccatore sotto vuoto per almeno 30 minuti.

Per rimuovere il solvente residuo, trasferire due millilitri di tampone precedentemente filtrato attraverso un filtro da 0,2 micron in un vial di vetro per idratare i lipidi. Incubare la miscela a quattro gradi Celsius per tutta la notte e utilizzarla entro 48 ore per ottenere liposomi di dimensioni comprese tra 30 e 100 nanometri. Congelare la sospensione di liposomi in azoto liquido per 15 secondi.

Quindi scongelare la sospensione di liposomi utilizzando un blocco riscaldante a 42 gradi SIUs per circa tre minuti. Ripetere il processo di congelamento e scongelamento per un totale di cinque cicli. Il congelamento e successivo scongelamento produce Ella Les da vescicole multilamellari e migliora l'efficienza di intrappolamento dei lipidi durante l'estrusione.

Successivamente, prepararsi per l'estruzione seguendo le istruzioni di Avastin per assemblare con attenzione il lipo il più rapidamente possibile. Un assemblaggio corretto dell'estrusore LF 50 è fondamentale per prevenire perdite di azoto, che influiscono sui flussi desiderati. Per garantire il successo, eseguire attentamente i seguenti passaggi.

Per creare una sigillatura ermetica, posizionare la griglia di supporto con il foro grande nella base del filtro di supporto, seguita dal piattino circolare centrale, da un disco drenante e da una membrana in policarbonato. Posizionare l'anello O nero di dimensioni ridotte sopra la membrana e fissarlo alla base del filtro di supporto.

Avvitare l'estrusore con filtro superiore stringendo quattro viti nelle quattro apposite fori corrispondenti. Assemblare l'unità dell'estrusore con filtro al di sotto del cilindro estrusore grande. Aggiungere la soluzione di liposomi al cilindro superiore posto sopra il cilindro dell'estrusione.

Posizionare un grosso anello O circolare, un tappo stretto, un altro grosso anello O circolare e un tappo circolare. Collegare il regolatore del gas alla parte superiore del cilindro dell'estrusore e chiudere tutte le valvole per prevenire perdite d'aria, inclusa la valvola di sfiato della pressione. Posizionare una fiala di vetro da 20 millilitri o un matraccio Erlenmeyer da 50 millilitri sotto l'unità filtrante dell'estrusore.

Un valvola di sicurezza è collegata al regolatore e si attiverà se la pressione supera i 600 PS.I. Accendere il gas azoto e aprire la valvola del gas collegata all'estrusore. Aumentare la pressione dell'azoto a 25 PSI per liposomi di 400 nanometri, a 125 PSI per liposomi di 100 nanometri e a 400-500 PSI per liposomi di 30 nanometri. Osservare la sospensione di liposomi finché non viene espulsa nel contenitore spinta dall'azoto.

Mantenere il flusso di azoto fino a quando non si osserva più liquido. Far passare attraverso il filtro dell'estrusore nel vial di vetro per eseguire l'analisi DLS. Preparare innanzitutto 50 microlitri di una soluzione di liposomi a 20 micromolari diluita in soluzione salina tamponata al fosfato o PBS.

Quindi accendere la fonte di alimentazione e la sorgente della lampada. Procedere aprendo il software dynapro. Impostare il software sul modello algoritmico per rilevare i liposomi alla dimensione desiderata.

Dopo aver prelevato con la pipetta 14 microlitri di campione di liposomi e averlo trasferito nel vasetto di quarzo, inserire il vasetto nel portacampioni e premere avvio. Dopo circa 20-30 acquisizioni, premere arresta. Analizzare i picchi del diametro medio dei liposomi registrati nell'istogramma. L'analisi del tracciamento delle nanoparticelle inizia con la preparazione di una soluzione di liposomi di 500 microlitri a 0,1 micromolare, solubilizzata in PBS; risciacquare il comparto del campione con acqua ed etanolo.

Quindi asciugare il comparto del campione con un panno di carta senza pelucchi. Accendere la sorgente laser e il computer ed erogare 300 microlitri di soluzione di liposomi 0,1 M nel comparto del campione. Aprire il software di controllo della temperatura e di analisi del tracciamento delle nanoparticelle.

Premere il pulsante di acquisizione per attivare il laser. Utilizzare le regolazioni orizzontali e verticali per spostare la piastra e regolare il fuoco del microscopio. Impostare la temperatura desiderata e il tempo di registrazione.

Premere il pulsante di registrazione per acquisire più fotogrammi delle particelle di liposomi per un periodo di tempo specificato. Analizzare i picchi corrispondenti alle dimensioni diametrali dei liposomi sull'istogramma mentre viene tracciato il movimento di ciascuna particella. La DLS è un metodo consolidato che raccoglie la luce dispersa per determinare il diametro delle particelle ed è stata eseguita per determinare le dimensioni dei liposomi.

Le liposoma idratate sono state estruse attraverso membrane di policarbonato di diverse dimensioni e a diverse pressioni, come descritto nel protocollo scritto. I diametri delle liposoma misurati mediante DLS per una dimensione dei pori di 30 nanometri erano di 66 ± 28 nanometri. Per una dimensione dei pori di 100 nanometri erano di 138 ± 80 nanometri, e per una dimensione dei pori di 400 nanometri erano di 360 ± 25 nanometri.

È stato utilizzato un sospensione di perle di Irene lucidate da 50 nanometri come standard di calibrazione, ottenendo un diametro registrato di 47 più o meno 16 nanometri. La percentuale di polidispersità indica che non vi è sovrapposizione tra le dimensioni dei liposomi. È tipico osservare diametri superiori a 30 nanometri durante l'analisi DLS a causa del noto bias dello strumento verso particelle più grandi.

Nonostante questa limitazione strumentale, la curva di calibrazione descrive una correlazione lineare. L'analisi del tracciamento delle nanoparticelle è una nuova tecnologia che misura la dimensione di ciascuna particella attraverso osservazioni dirette della diffusione in un mezzo liquido, indipendentemente dall'indice di rifrazione o dalla densità della particella. Questa tecnica ad alta risoluzione può essere utilizzata per integrare la misurazione dei liposomi mediante DLS; i diametri registrati da NTA di 95 più o meno 48 nanometri e 356 più o meno 51 nanometri per due soluzioni di polistirene da 100 nanometri e 400 nanometri sono stati utilizzati per la calibrazione.

Le soluzioni lipidiche presentano un diametro più comparabile rispetto alla DLS, producendo dimensioni medie di 29 ± 14 nanometri per una dimensione dei pori di 30 nanometri, 95 ± 17 nanometri per una dimensione dei pori di 100 nanometri e 359 ± 73 nanometri per una dimensione dei pori di 400 nanometri. La NTA potrebbe rappresentare una tecnica di caratterizzazione più generale per la quantificazione di particelle microscopiche, poiché la sua sensibilità consente la misurazione di particelle comprese tra 50 e 1000 nanometri. La curva di calibrazione mostra una correlazione lineare tra la dimensione dei pori della membrana in policarbonato e il diametro registrato mediante NTA. Le immagini di microscopia elettronica a trasmissione con colorazione negativa mostrano chiaramente dimensioni distinte di ciascun liposoma dopo l'estruzione, rispettivamente di 30, 100 e 400 nanometri.

L'ingrandimento è stato impostato a 25.000 volte, con la barra della scala che rappresenta 0,5 micron. È stato condotto un esperimento in funzione del tempo con tre dimensioni di liposomi. La DLS è stata misurata per ogni soluzione di liposomi immediatamente dopo l'estruzione.

Tutte le soluzioni di liposomi sono state conservate a quattro gradi Celsius durante la notte. I loro diametri sono stati registrati nuovamente mediante DLS dopo un'incubazione notturna. È stata osservata poca o nessuna variazione dopo un periodo di incubazione di 60 ore. Durante l'esecuzione di questa procedura, è importante ricordare che più passaggi attraverso il filtro di estrusione miglioreranno l'omogeneità della soluzione di Vesco.

Inoltre, ricordarsi di utilizzare vial in vetro e siringhe per la preparazione del campione al fine di prevenire contaminazioni dovute al rilascio di sostanze dai tubi in polipropilene causato dal cloroformio.