Costante pressione controllata metodo di estrusione per la preparazione del Nano di dimensioni vescicole lipidiche

L'obiettivo generale del seguente esperimento è quello di presentare un metodo di preparazione robusto per vescicole lipidiche biologicamente rilevanti. Ciò si ottiene mescolando e trasferendo i fosfolipidi in fiale di vetro e idratandoli con tampone acquoso per creare una sospensione SLE multi lamellare. Come seconda fase, viene eseguito un metodo di congelamento e scongelamento, che successivamente si traduce nella produzione di vescicole Ella da vescicole multi lamellari.

Successivamente, la sospensione liposomica viene fatta passare attraverso un estrusore utilizzando la pressione ottimale determinata per produrre vescicole lipidiche omogenee della dimensione desiderata. Sono stati ottenuti risultati che mostrano dimensioni costanti delle vescicole submicroniche sulla base della diffusione dinamica della luce e dell'analisi del tracciamento delle nanoparticelle. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti come la sonicazione e la sedimentazione, è che questo metodo utilizza un sistema di controllo della pressione con portate di azoto determinate ottimali per un'efficiente preparazione delle dimensioni delle vescicole lipidiche.

Per iniziare questa procedura, recuperare una fiala di vetro da 20 millilitri con un tappo rivestito in teflon, pulire tutta la vetreria e le siringhe con cloroformio prima dell'uso per evitare contaminazioni. Trasferire 100 microlitri di cloroformio reattivo nella fiala di vetro utilizzando una siringa di vetro ermetica da 250 microlitri. Aggiungere 30 microlitri di metanolo reagente alla stessa fiala di vetro utilizzando una siringa di vetro ermetica da 100 microlitri.

Preparare una soluzione lipidica di papavero pop C da due millimolari trasferendo 216 microlitri da 10 milligrammi per millilitro pop C 42 microlitri da 10 milligrammi per millilitro. Pop e 20 microlitri da 11 milligrammi per millilitro. Le soluzioni di colesterolo nella fiala di vetro da 20 millilitri fanno evaporare i solventi organici utilizzando argon a flusso lento o azoto gassoso fino a quando non si osserva un sottile film di lipidi sul fondo della fiala, porre la fiala di vetro senza tappo in un essiccante sottovuoto per almeno 30 minuti.

Per rimuovere il solvente residuo, trasferire due millilitri di tampone precedentemente passato attraverso un filtro da 0,2 micron nella fiala di vetro per idratare i lipidi. Incubare la miscela a quattro gradi Celsius durante la notte e utilizzare entro 48 ore per liposomi di dimensioni comprese tra 30 e 100 nanometri. Liberare la sospensione liposomica in azoto liquido per 15 secondi.

Quindi scongelare la sospensione liposomica utilizzando un blocco riscaldante a 42 gradi SIU per circa tre minuti. Ripetere il processo di congelamento, scongelamento per un totale di cinque cicli. Il congelamento e il successivo scongelamento producono Ella Les da vescicole multilamellari e migliorano l'efficienza dell'intrappolamento dei lipidi durante l'estrusione.

Successivamente, preparati per l'estrusione seguendo le istruzioni di Avastin per assemblare con cura il lipo così velocemente. Il corretto montaggio dell'estrusore LF 50 è fondamentale per evitare perdite di azoto, che influiscono sulle portate desiderabili. Per garantire il successo, eseguire attentamente i seguenti passaggi.

Per produrre una chiusura ermetica. Posizionare lo schermo di supporto del foro grande nella base del filtro di supporto, seguito dal piatto centrale circolare, un disco di scarico e una membrana in policarbonato. Posizionare il piccolo O-ring nero sopra la membrana e fissarlo alla base del filtro di supporto.

Fissare l'estrusore del filtro superiore serrando le quattro viti nei quattro fori corrispondenti. Montare l'unità di estrusione del filtro sotto il grande cilindro dell'estrusore. Aggiungere la soluzione di liposomi al cilindro sopra il cilindro di estrusione.

Posizionare un O-ring circolare grande, un tappo stretto, un O-ring circolare grande e un tappo circolare. Collegare il regolatore del gas alla parte superiore del cilindro dell'estrusore e chiudere tutte le valvole per evitare perdite d'aria, compresa la valvola limitatrice di pressione. Posizionare una fiala di vetro da 20 millilitri o un pallone di erlenmeyer da 50 millilitri sotto l'unità filtro dell'estrusore.

Una valvola di sicurezza è collegata al regolatore e si sgancia se la pressione supera i 600 PS. Accendo l'azoto gassoso e apro la valvola del gas collegata all'estrusore. Aumentare la pressione dell'azoto a 25 PSI per liposomi da 400 nanometri, a 125 PSI per liposomi a 100 nanometri e da 400 a 500 PSI per liposomi a 30 nanometri. Osservare la sospensione del liposoma fino a quando non viene espulsa nel contenitore mentre viene spinta dall'azoto.

Mantenere il flusso di azoto fino a quando non si osserva alcun liquido. Passaggio attraverso il filtro dell'estrusore nel file di vetro per eseguire l'analisi DLS. Per prima cosa, preparare 50 microlitri di una soluzione liposomica da 20 micromolari diluita in soluzione salina tamponata con fosfato o PBS.

Quindi accendere la fonte di alimentazione e la lamp sorgente. Procedere con l'apertura del software dynapro. Imposta il software sul modello dell'algoritmo per rilevare i liposomi alla dimensione desiderata.

Dopo aver collegato alla pipetta hardware 14 microlitri di campione di liposomi nel vete di quarzo e inserirli nel supporto della cella, premere start dopo circa 20-30 acquisizioni, premere stop. Analizzare i picchi medi del diametro dei liposomi registrati sull'istogramma. L'analisi del tracciamento delle nanoparticelle inizia con la preparazione di una soluzione liposomica da 500 microlitri 0,1 micromolari solubilizzata in PBS, il risciacquo del vano campione con acqua ed etanolo.

Quindi asciugare lo scomparto del campione con un tovagliolo di carta privo di lanugine. Accendendo la fonte di alimentazione del laser, il computer eroga 300 microlitri di soluzione di liposomi molari 0,1 nel vano del campione. Aprire il software di controllo della temperatura e di analisi del tracciamento delle nanoparticelle.

Premere il pulsante di acquisizione per accendere il laser. Utilizzare le regolazioni orizzontale e verticale per spostare il tavolino e regolare la messa a fuoco del microscopio. Impostare la temperatura e il tempo di registrazione desiderati.

Premere il pulsante di registrazione per scattare più fotogrammi delle particelle di liposomi per un determinato periodo di tempo. Analizza i picchi corrispondenti alle dimensioni dei liposomi di diametro sull'istogramma mentre tiene traccia del movimento di ciascuna particella. Il DLS è un metodo consolidato che raccoglie la luce diffusa per determinare il diametro delle particelle ed è stato eseguito per determinare le dimensioni dei liposomi.

I liposomi idrati sono stati estrusi attraverso membrane in policarbonato a varie dimensioni e pressioni come descritto nel protocollo scritto. I diametri dei liposomi misurati dal DLS per una dimensione dei pori di 30 nanometri erano 66 più o meno 28 nanometri. Per 100 nanometri la dimensione dei pori era di 138 più o meno 80 nanometri e per 400 nanometri la dimensione dei pori era di 360 più o meno 25 nanometri.

Come standard di calibrazione è stata utilizzata una sospensione di perle di Irene lucidate a 50 nanometri, dove è stato registrato un diametro di 47 nanometri, più o meno 16 nanometri. La percentuale di polidispersione mostra che non vi è sovrapposizione all'interno delle dimensioni dei liposomi. È tipico osservare diametri superiori a 30 nanometri quando si utilizza l'analisi DLS a causa della nota distorsione che questo strumento ha verso particelle più grandi.

Nonostante questa limitazione strumentale, la curva di calibrazione descrive una correlazione alineare. L'analisi del tracciamento delle nanoparticelle è una nuova tecnologia che misura la dimensione di ciascuna particella da osservazioni dirette della diffusione in un mezzo liquido indipendentemente dall'indice di rifrazione o dalla densità delle particelle. Questa tecnica ad alta risoluzione può essere utilizzata per integrare la misurazione dei liposomi con DLS, l'NTA ha registrato diametri di 95 più o meno 48 nanometri e 356 più o meno 51 nanometri per due soluzioni di polistirene da 100 nanometri e 400 nanometri sono state utilizzate per la calibrazione.

Le soluzioni lipidiche hanno un diametro più comparabile rispetto al DLS, producendo dimensioni medie di 29 più o meno 14 nanometri per una dimensione dei pori di 30 nanometri, 95 più o meno 17 nanometri per una dimensione dei pori di 100 nanometri e 359 più o meno 73 nanometri per una dimensione dei pori di 400 nanometri. L'NTA può essere una tecnica di caratterizzazione più generale per quantificare le particelle microscopiche poiché la sua sensibilità consente la misurazione di particelle da 50 a 1000 nanometri. La curva di calibrazione mostra una correlazione lineare tra la pausa della membrana in policarbonato e la trasmissione della colorazione negativa del diametro NTA registrata Le immagini al microscopio elettronico mostrano che ogni dimensione del liposoma segue dimensioni di estrusione di 3, 100 e 400 nanometri e chiaramente distinte l'una dall'altra.

L'ingrandimento è stato impostato su 25.000 volte con la barra della scala che rappresenta 0,5 micron. È stato condotto un esperimento di decorso temporale con tre dimensioni di liposomi. Il DLS è stato misurato per ciascuna soluzione liposomica immediatamente dopo l'estrusione.

Tutte le soluzioni liposomiali sono state conservate a quattro gradi Celsius durante la notte. I loro diametri sono stati nuovamente registrati dal DLS dopo un'incubazione notturna. Dopo un periodo di incubazione di 60 ore è stato osservato un cambiamento minimo o nullo Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare che passaggi multipli attraverso il filtro di estrusione miglioreranno l'omogeneità della soluzione Vesco.

Inoltre, ricordarsi di utilizzare fiale e siringhe di vetro per la preparazione del campione per evitare la contaminazione dovuta alla lisciviazione da parte di provette di polipropilene dal cloroformio.