Realizzazione e utilizzo di microarrays microambiente (MEArrays)

L'obiettivo generale del seguente esperimento è misurare gli effetti di diversi microambienti sulle funzioni cellulari di tipi cellulari aderenti, esponendoli in parallelo a una varia gamma di microambienti Combinator. Questo risultato si ottiene innanzitutto fabbricando substrati per la stampa in grado di assorbire miscele di proteine microambientali. Successivamente vengono preparate piastre madri contenenti proteine microambientali, che vengono utilizzate per stampare array di ME mediante un robot per la stampa a microarray a penna o a pinza capillare.

Successivamente vengono preparate le piastre madri di proteine microambientali. Quindi le cellule aderenti vengono coltivate sull'array ME con la possibilità di limitare il numero di cellule. I risultati ottenuti mostrano l'impatto dei diversi microambienti sulle funzioni cellulari come differenziazione o proliferazione, in base all'analisi di immunofluorescenza.

L'idea iniziale di questo metodo è nata quando abbiamo voluto quantificare gli effetti dei microambienti tissutali sulle decisioni di destino delle cellule staminali della memoria umana, ma abbiamo capito che lavorare in vivo è impossibile. Ora che è stato sviluppato, questo metodo ha numerose applicazioni nella biologia cellulare, nella ricerca e nella scoperta di farmaci. Il PDMS viene utilizzato come substrato che imita tessuti più rigidi, poiché è economico, facile da preparare e facile da stampare.

Tuttavia, l'idrofobicità del PDMS può renderlo incompatibile con alcune linee cellulari quando si lavora con dispositivi in PDMS. Indossare guanti privi di lattice, poiché il lattice può inibire la polimerizzazione del PDMS. Per iniziare, in un bicchiere di plastica monouso, mescolare la base di elastomero siliconico Sylgard 184 con l'agente indurente in un rapporto di 10 a 1 e agitare vigorosamente con un bastoncino di legno o plastica.

Successivamente, sgrassare la miscela in una campana a vuoto a temperatura ambiente per 30 minuti. Posizionare quindi al centro un normale vetrino microscopico sul mandrino a vuoto azionato di una spin coater, quindi versare 0,5 millilitri del polimero elastomerico miscelato al centro della superficie del vetrino e rivestire mediante rotazione a 6.000 giri al minuto per 60 secondi. Polimerizzare i vetrini rivestiti con PDMS a 70 gradi Celsius per un periodo compreso tra quattro ore e tutta la notte.

Le lamelle possono essere conservate in modo ermetico a temperatura ambiente per diversi mesi. L'PA è un idrogel che può imitare tessuti più morbidi nell'intervallo in cui le cellule PA si attaccheranno soltanto a punti in cui sono presenti proteine che favoriscono l'adesione cellulare. Iniziare incollandole le lamelle con idrossido di sodio.

Posizionare i vetrini su un blocco riscaldante a 80 gradi Celsius. Aggiungere una goccia di un millilitro di idrossido di sodio 0,1 N su ciascun vetrino. Assicurarsi di coprire l'intera superficie del vetrino, altrimenti l'AP fallirà.

Lasciare evaporare l'idrossido di sodio, lasciando un film bianco. Ripetere questo processo se la superficie non è completamente ricoperta. Il vetrino può essere conservato a temperatura ambiente per diversi giorni, se necessario.

Successivamente, ricoprire i vetrini con un PES in una cappa da laboratorio. Posizionare i vetrini in una piastra da 15 millilitri. Aggiungere 300 microlitri di un PES su ciascun vetrino trattato con idrossido di sodio.

Lasciare che il PES A reagisca con l'idrossido di sodio sui vetrini esattamente per cinque minuti. Non di più. Lavare accuratamente il PES A con acqua deionizzata due o tre volte su entrambi i lati dei vetrini.

Altrimenti, si ossiderà formando un deposito bruno sui vetrini nel passaggio successivo. Ora aspirare tutte le soluzioni dalle superfici dei vetrini in ogni piastra. Aggiungere 25 millilitri di glutaraldeide 0,5% in PBS.

Posizionare i vetrini al buio e attendere 30 minuti. Trascorsi 30 minuti, aspirare tutta la soluzione di glutaraldeide dalla superficie del vetrino. Quindi asciugare attentamente i vetrini utilizzando carta assorbente senza pelucchi.

Le vetture possono ora essere conservate a temperatura ambiente durante la notte, se necessario. Dopo aver preparato e disaerato le miscele di PA, collocarle sul ghiaccio per rallentarne la polimerizzazione. Poco prima di preparare le vetture, aggiungere a ciascuna miscela sul ghiaccio persolfato di ammonio e TEMED, quindi mescolarle con una pipetta per cinque-dieci secondi.

Ora pipettare la miscela di PA sulle superfici del vetrino. La quantità di PA varia in base alla durezza del gel richiesta. Successivamente, posizionare dei coprioggetti in vetro sulla parte superiore del PA senza applicare alcuna pressione per evitare la formazione di bolle d'aria.

Lasciare polimerizzare il gel di PA per due ore, quindi rimuovere le lamelle sotto acqua deionizzata. Lavare le vetrini con gel di PA in barattoli coplan grandi con acqua per tutta la notte. Per rimuovere le acrilammidi non reattive il giorno successivo, asciugare i vetrini fino a quando il gel di PA non si sarà completamente indurito.

I vetrini possono quindi essere conservati a quattro gradi Celsius per un mese in una scatola per vetrini sigillata. Per iniziare, si monta una camera di plastica per delimitare l'array stampato da un vetrino a due camere. Rimuovere le camere e tagliarle a metà con una lametta.

Utilizzare una punta da un millilitro per applicare un sottile filo di silicone per acquariolo sul bordo di una camera e premere quest'ultima sulla superficie di un array Emmy. Evitare di far toccare il silicone a qualsiasi parte delle caratteristiche dell'array. È fondamentale assicurare un buon fissaggio delle camere di coltura all'array Emmy, poiché eventuali spazi tra le camere possono causare perdite di mezzo, con conseguente morte cellulare diffusa.

Per le lamelle rivestite con PDMS, bloccare le lamelle incubandole in una soluzione acquosa al 1% di F 108 per 15 minuti sotto vuoto per entrambi i tipi di gel; risciacquare gli array con mezzo di coltura cellulare contenente antibiotici per tre volte, cinque minuti per ogni lavaggio. Questo passaggio rimuove i monomeri non reattivi, che possono risultare tossici per le cellule nel caso dei gel di PA. Dopo il terzo lavaggio, procedere con un'ulteriore incubazione di 30 minuti nel mezzo di coltura per riidratare il gel.

Ora posizionare quattro o cinque array in una piastra Petri sterile da 15 centimetri. Aggiungere alla piastra metà del volume finale di mezzo contenente le cellule di interesse alla concentrazione richiesta per l'applicazione. Gli array ME devono essere collocati in un incubatore appropriato per il mantenimento del tipo cellulare utilizzato.

Verificare al microscopio ogni 15-20 minuti l'adesione uniforme delle cellule alle strutture stampate durante l'osservazione. Scuotere delicatamente le matrici ME per distinguere le cellule aderenti da quelle in sospensione. Il tempo di adesione può variare, ma è generalmente completato entro due ore su una matrice ME codificata con PA.

Dopo aver raggiunto la saturazione dell'adesione o il limite di tempo, aspirare le cellule non legate e riempire la piastra al volume finale su matrici ME rivestite con PDMS. Rimuovere completamente il mezzo ucciderebbe le cellule. Pertanto, per ogni successivo cambio di mezzo su queste preparazioni, sostituire progressivamente metà del volume del mezzo, quindi riempire la piastra al volume finale.

La coltura può proseguire per molti giorni con normali cambi di mezzo. Comuni fissativi come paraformaldeide, aldeide e acetone metanolico sono compatibili con i sistemi di array Emmy. Non dimenticare che, anche durante la colorazione, gli array ME rivestiti in PDMS devono rimanere umidi.

Proseguire quindi con la tecnica di sostituzione del volume dimezzato per preparare vetrini delle matrici ME colorate. Utilizzare una lametta per rimuovere le camere e montare i coverslip usando la flora. La proteina G è stata depositata su una matrice ME codificata in PDMS stampata utilizzando perni di silicio con estremità quadrata su un perno a piuma.

Il deposito di varie proteine effettuato tramite robot per la stampa di microarray è stato verificato mediante immunofluorescenza utilizzando anticorpi. I livelli di diluizione delle soluzioni proteiche nella piastra madre riflettevano la quantità depositata sulle superfici di substrato, dove le cellule si attaccavano alle strutture stampate in maniera chiaramente ordinata. Analogamente, lo stesso schema evidente di adesione cellulare si osserva quando un array Emmy viene stampato su scala di 40.000 passaggi.

I gel di PA con due proteine di microambiente hanno indotto profili di espressione delle cheratine dipendenti dalla concentrazione in una linea cellulare umana progenitrice epiteliale mammaria multipotente. Il rapporto logaritmico tra i segnali della cheratina otto e quelli della cheratina 14 illustra la variazione e la riproducibilità del segnale. Dopo 24 ore di coltura, le cellule non legate vengono rimosse con un lavaggio nell'analisi di 12 matrici me.

Sono state utilizzate analisi statistiche standard per determinare se le diverse diluizioni di collagene di tipo uno e di p-caderina umana ricombinante determinassero variazioni nell'espressione della cheratina. Inizialmente, non si è osservata alcuna variazione dalla media tra le cellule sulle caratteristiche subito dopo l'adesione. Tuttavia, dopo 24 ore, concentrazioni elevate di collagene di tipo uno hanno indotto un'espressione significativamente più elevata della cheratina otto.

Concentrazioni elevate di PCA hanno invece indotto un forte segnale di cheratina 14. Questo risultato è in accordo con precedenti osservazioni riguardo le cellule progenitrici di memoria bipotenti. A causa della natura dinamica e reciproca delle interazioni tra queste cellule e il loro microambiente, le cellule stesse possono alterare la composizione dei microambienti stampati.

Pertanto, per comprendere gli effetti acuti dei microambienti stampati, il tempo di esposizione non dovrebbe superare le 48 ore seguendo questa procedura. Qualsiasi processo biologico misurabile, mediante marcatura fluorescente o colorimetrica, può essere analizzato come funzione del microambiente al fine di rispondere ad ulteriori domande, come ad esempio: come diversi microambienti modificano la risposta ai farmaci nelle linee cellulari tumorali? Ciò è determinato da variazioni nell'apoptosi e nella proliferazione.

O in che modo i microambienti modificano la differenziazione dei progenitori.