Lensfree On-chip Tomographic Microscopia Utilizzando Multi-angolo di illuminazione e Pixel Super-risoluzione
16 agosto 2012
Lensfree ottico tomografia è una tecnica tridimensionale microscopia che offre una risoluzione spaziale di <1 um x <1 um x <3 pm di x, y e Z, rispettivamente, per un grande volume di imaging di 15-100 mm 3, Che può essere particolarmente utile per l'integrazione con lab-on-a-chip piattaforme.
L'obiettivo generale di questa procedura è quello di ottenere l'imaging tridimensionale senza lenti su chip di campioni biologici su un grande volume di imaging. Ciò si ottiene posizionando prima il campione direttamente sul chip del sensore e fornendo un'illuminazione parzialmente coerente. Il secondo passo consiste nello spostare lateralmente la sorgente luminosa di diverse posizioni per registrare.
I subpixel hanno spostato le immagini olografiche del campione. I subpixel successivi sono stati spostati. Le immagini olografiche vengono registrate a multipli di illuminazione per l'imaging tomografico.
La fase finale è l'elaborazione dei dati, in cui il set di dati acquisito viene ricostruito digitalmente per ottenere infine immagini tomografiche tridimensionali del campione. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti come la microscopia ottica convenzionale è che fornisce immagini ad alta produttività in un'architettura compatta. Ciò rende la nostra piattaforma particolarmente utile per l'integrazione con le piattaforme di chip Lebanon.
In questo rapporto viene descritta la configurazione di imaging di base per un'implementazione da banco verso la tomografia di campioni statici. Un monocromatore con una lampada allo xeno è stato regolato per fornire un'uscita con una larghezza spettrale di circa 1-10 nanometri attorno a una lunghezza d'onda centrale da 450 a 650 nanometri. Questa uscita parzialmente coerente viene quindi accoppiata a una fibra ottica multimodale per fornire una luce parzialmente coerente al sistema.
La fibra ottica è montata su uno stadio di rotazione motorizzato per modificare l'angolo di illuminazione. Il tavolino motorizzato con la sorgente luminosa collegata è montato su un tavolino XY lineare bidimensionale, che viene utilizzato per ottenere spostamenti semplici della sorgente luminosa a un determinato angolo per il rilevamento. Viene utilizzato un array di sensori A-C-M-O-S da cinque megapixel con una dimensione dei pixel di 2,2 micron.
Il rivelatore viene utilizzato per registrare le immagini olografiche ad ampio campo visivo dei campioni. È fondamentale che l'array di sensori sia posizionato sullo stesso piano assiale dell'asse di rotazione della sorgente luminosa per garantire che controlliamo se il sensore riceve luce sufficiente a grandi angoli di illuminazione. Mentre la tomografia ottica senza lenti può visualizzare una varietà di oggetti come cellule e microrganismi, i principi di base sono dimostrati qui eseguendo la microscopia tridimensionale di un campione di elgano marino utilizzando un bisturi o una spatola.
Prendi un pezzetto di AGA dalla capsula di Petri contenente la coltura degli organi sigillanti. Un pezzo cubico di diversi millimetri lungo ogni dimensione conterrà centinaia di nematodi. Mettere il pezzetto di agar in una fiala di polipropilene contenente un millilitro di acqua deionizzata.
Agitare delicatamente per 30 secondi a un minuto. Dopo 10-15 minuti, il verme dovrebbe strisciare fuori dall'agar nell'acqua deionizzata. Si noti che i vermi sono troppo piccoli per essere visti qui per immobilizzare temporaneamente i vermi e un millilitro di Lima da cinque a 10 millimolari.
Quindi soluzione e attendi 10 minuti. Pipettare da cinque a 10 microlitri di campione dal fondo della fiala e inserirlo tra due vetrini. Questo campione contenente un gran numero di vermi temporaneamente immobilizzati può essere posizionato sul rivelatore per avviare l'acquisizione dei dati.
A scopo dimostrativo, le fasi di acquisizione delle immagini per una tipica tomografia ottica senza lente o esperimento LOT sono riassunte in questa sezione, tuttavia, l'intero processo è stato automatizzato utilizzando l'interfaccia di visualizzazione del laboratorio sviluppata su misura. Per iniziare i passaggi manuali, regolare l'angolo iniziale del tavolino di rotazione su un valore negativo di 50 gradi, dove zero gradi corrisponde alla posizione verticale della sorgente luminosa. Regolare la posizione iniziale del tavolino XY su zero zero, che è la posizione iniziale.
Regolare il tempo di esposizione del rivelatore per utilizzare al meglio la sua gamma dinamica in modo tale che l'immagine sia il più luminosa possibile senza pixel saturi senza modificare l'angolo dello stadio di rotazione. Cattura nove immagini per ogni immagine. Sposta lo stage XY in una nuova posizione in una griglia quadrata tre per tre, in modo che ogni immagine si sposti di circa un quarto di pixel rispetto alla precedente.
L'acquisizione di più immagini ad ogni angolazione potrebbe migliorare la risoluzione a seconda del tipo di oggetto e del rapporto segnale/rumore. Dopo aver raccolto nove immagini con l'angolo iniziale, regolare la posizione dello stadio XY riportandola alla posizione zero zero. Quindi aumentare l'angolo dello stadio di rotazione con incrementi di due gradi fino a raggiungere i 50 gradi positivi.
Dopo ogni incremento ad ogni nuova angolazione, ripetere i passaggi descritti. Gli incrementi angolari possono essere più fini o più grossolani a seconda dell'ottimizzazione del tempo di acquisizione rispetto alla risoluzione dell'imaging. Dopo l'acquisizione dei dati, viene acquisito un set di 459 immagini, che contengono nove immagini spostate in subpixel per ciascuno dei 51 diversi angoli di illuminazione.
Ogni set di nove immagini viene elaborato digitalmente utilizzando algoritmi di super risoluzione dei pixel per ottenere una proiezione ad alta risoluzione. I super risultati dell'ologramma per pixel angolari vengono quindi ricostruiti digitalmente per ottenere 51 immagini di proiezione. L'elaborazione dei dati viene mostrata qui utilizzando un laptop.
La ricostruzione richiederebbe meno di un secondo per l'intero campo visivo utilizzando unità di elaborazione grafica. Questo set di 51 immagini di proiezione viene quindi riproiettato utilizzando il plug-in Tom OJA. Per l'immagine J, le immagini di proiezione vengono prima caricate nell'immagine J, dopodiché viene richiamato il plug-in Tom OJ.
Una tabella di ricerca che fornisce l'angolo di visione per ogni immagine di proiezione viene caricata in OJ. Utilizzando il metodo della retroproiezione ponderata, è possibile ottenere immagini tomografiche tridimensionali del campione. L'ampio campo visivo della tomografia ottica senza lenti è dimostrato qui, poiché il campione viene posizionato direttamente sulla parte superiore dell'array di rivelatori. Le immagini olografiche degli oggetti possono essere registrate su un campo visivo di 24 millimetri quadrati, che può essere ulteriormente aumentato utilizzando array di rivelatori emergenti con aree attive più grandi.
Sebbene la dimensione dei pixel dell'array di rivelatori limiti la risoluzione delle immagini olografiche registrate, le tecniche di super risoluzione dei pixel mitigano questo problema, mostrate qui sono ologrammi con super risoluzione dei pixel, insieme alle immagini di proiezione ricostruite che offrono una risoluzione spaziale submicrometrica per tre diversi angoli di illuminazione. Le immagini di proiezione possono essere combinate utilizzando tecniche di ricostruzione tomografica dell'immagine per calcolare i terreni TOM del campione. Qui sono mostrate tre immagini di fette nel piano XY attraverso la parte anteriore del verme in cui il tubo faringeo è visibile solo nella fetta attraverso Z uguale a otto micron, come previsto da questa struttura approssimativamente cilindrica con un diametro esterno di circa cinque micron.
Inoltre, l'immagine della sezione trasversale nel piano XZ mostra chiaramente i confini del verme e del tubo faringeo all'interno, dimostrando il successo dell'imaging 3D della faringe. Con il suo sviluppo, questa tecnica può aprire la strada ai ricercatori per eseguire la microscopia tridimensionale su tubi di decine di millimetri di volume di imaging. Pertanto, la tomografia ottica senza lenti può essere uno strumento utile per applicazioni di imaging ad alta produttività nelle piattaforme di chip libaniche.
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Panoramica
Questo articolo tratta la tomografia ottica senza lente, una tecnica di microscopia tridimensionale che consente l'acquisizione di immagini ad alta risoluzione di campioni biologici. Il metodo permette l'acquisizione su un ampio volume, rendendolo adatto all'integrazione con piattaforme di tipo lab-on-a-chip.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Neuroscienze
- Immagini biologiche
- Tecniche di microscopia
Sfondo
- La tomografia ottica senza lenti fornisce una risoluzione spaziale di <1 μm × <1 μm × <3 μm.
- La tecnica è in grado di acquisire volumi compresi tra 15 e 100 mm³.
- È particolarmente vantaggiosa per applicazioni nelle tecnologie di laboratorio su chip.
- Questo metodo utilizza un'illuminazione parzialmente coerente per l'acquisizione delle immagini.
Scopo dello studio
- Realizzare immagini tridimensionali senza lente di campioni biologici.
- Esplorare l'integrazione di questa tecnica con piattaforme di tipo lab-on-a-chip.
- Potenziare le capacità di imaging su volumi estesi.
Metodi Utilizzati
- Posizionamento del campione direttamente sul chip del sensore.
- Utilizzo di un'illuminazione parzialmente coerente.
- Spostamento laterale della sorgente luminosa per acquisire immagini olografiche con spostamento sub-pixel.
- Acquisizione di più immagini olografiche per l'imaging tomografico.
Risultati principali
- Acquisizione di immagini riuscita di campioni biologici in tre dimensioni.
- Dimostrazione delle capacità di alta risoluzione spaziale.
- Integrazione efficace con piattaforme di tipo lab-on-a-chip.
- Convalida del metodo mediante diversi test di imaging.
Conclusioni
- La tomografia ottica senza lenti è una tecnica promettente per l'immagine biologica.
- Il metodo offre vantaggi significativi in termini di risoluzione spaziale e volume di imaging.
- Le future applicazioni potrebbero espandersi in vari campi della ricerca biologica.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Metodo
La microscopia tomografica senza lenti su chip consente un'acquisizione tridimensionale ad alto rendimento e senza marcatura di campioni biologici su grandi volumi, senza l'uso di ottiche ingombranti, facilitando l'integrazione con piattaforme microfluidiche e di tipo lab-on-a-chip. Questo approccio riduce l'ingombro e il costo dello strumento mantenendo una risoluzione sub-micrometrica, affrontando colli di bottiglia nella fase di scoperta relativi al rendimento del campione e alla compatibilità dei saggi. La tecnologia aumenta l'affidabilità predittiva nella validazione precoce dei bersagli fornendo dati strutturali quantitativi risolti in profondità per lo screening fenotipico e la riduzione del rischio meccanicistico.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Valore scientifico: Consente l'analisi di ipotesi terapeutiche mediante la visualizzazione tridimensionale di fenotipi cellulari e organelli subcellulari.
- Valore operativo: Permette l'immagine senza marcatura di campioni vivi, riducendo gli artefatti di preparazione e preservando la biologia nativa per studi sull'interazione con il bersaglio.
- Valore predittivo: Genera dati volumetrici quantitativi per chiarire il meccanismo d'azione e ridurre i rischi associati ai percorsi del bersaglio nella fase iniziale della scoperta.
Sviluppo di screening e saggi
- Valore scientifico: Fornisce immagini 3D con risoluzione sub-micrometrica su ampi campi visivi, consentendo schermate fenotipiche ad alto contenuto per microorganismi e popolazioni cellulari.
- Valore operativo: Elimina la necessità di lenti e ottiche complesse, standardizzando i flussi di lavoro di imaging per lo sviluppo di saggi riproducibili e scalabili.
- Prontezza del saggio: Facilita la preparazione di sistemi biologici validati per la valutazione di composti successivi mediante acquisizione automatizzata di dati ad alta produttività.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Continuità traslazionale Collega la scoperta alla validazione preclinica fornendo un'immagine 3D coerente attraverso diversi sistemi modello, come C. elegans e embrioni di pesce zebra.
- De-risking meccanicistico Consente il monitoraggio longitudinale dei cambiamenti strutturali nei sistemi rilevanti per la malattia, al fine di supportare l'allineamento dei biomarcatori e le decisioni di avanzamento corrette in base al rischio.
- Fedeltà del modello preclinico: Preserva l'architettura e la dinamica native del tessuto, migliorando la traslabilità dei risultati ottenuti in contesti in vitro a contesti in vivo.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il metodo si integra nel percorso di scoperta dalla biologia iniziale fino all'identificazione del composto guida, supportando la verifica delle ipotesi, la standardizzazione dei saggi e le analisi quantitative senza richiedere un'estesa lavorazione del campione o l'etichettatura.
- Biologia della scoperta: Consente la verifica di ipotesi e la chiarificazione di vie biologiche mediante la visualizzazione tridimensionale di fenotipi strutturali in sistemi biologici non perturbati.
- Screening: Fornisce immagini pronte per saggi, riproducibili e con output quantitativi per confrontare condizioni di controllo e trattamento su ampie popolazioni di campioni.
- Analisi: Produce ricostruzioni tomografiche risolte in profondità e immagini di proiezione che facilitano il confronto statistico di caratteristiche morfologiche.
- Ricerca traslazionale: Supporta la continuità preclinica acquisendo immagini di organismi modello rilevanti per le malattie con risoluzione e copertura volumetrica costanti.
- Riutilizzo aziendale: Funziona come piattaforma di imaging riutilizzabile, compatibile con diversi tipi di campioni e formati microfluidici, riducendo gli investimenti tecnologici ridondanti.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva grazie a un'immagine 3D ad alta risoluzione senza etichette che riduce l'ambiguità meccanicistica nella validazione degli obiettivi.
- Valore operativo: Migliora standardizzazione e scalabilità attraverso un design senza lenti, acquisizione automatizzata e compatibilità con matrici di sensori di grande formato.
- Valore strategico: Migliora le decisioni di proseguimento/cessazione consentendo un rilevamento precoce di anomalie fenotipiche, riducendo i rischi biologici in fasi avanzate e l'inefficienza del capitale.
- Impatto sul portafoglio: Supporta la priorizzazione corretta rispetto al rischio fornendo dati quantitativi di imaging multiparametrico per un confronto oggettivo dei candidati terapeutici.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze specifiche nell'imaging computazionale, nell'olografia e negli algoritmi di ricostruzione tomografica.
- È dipendente da matrici di sensori CMOS ad alta risoluzione e da piattaforme di illuminazione motorizzate per l'acquisizione di dati multiangolari.
- Necessita di una standardizzazione condivisa tra i gruppi di lavoro per quanto riguarda i protocolli di illuminazione, le impostazioni di esposizione e le procedure di spostamento sub-pixel, al fine di garantire la riproducibilità.
- L'applicazione a diversi sistemi modello potrebbe richiedere un'ottimizzazione delle tecniche di preparazione e immobilizzazione del campione per mantenerne la vitalità durante l'acquisizione delle immagini.
- I limiti pratici includono la sensibilità alle variazioni dell'indice di rifrazione e alle proprietà di scattering del campione, che possono influenzare il rapporto segnale-rumore in campioni densi o altamente assorbenti.
