Name: Quantitativa, in tempo reale Analisi dellattività riparazione per escissione Base in lisati cellulari Utilizzando Molecular Beacons Lesione specifici (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-08-06T13:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 1 s
Description: Scopri un metodo per misurare in tempo reale l'attività delle glicosilasi e delle AP endonucleasi nei lisati nucleari cellulari utilizzando beacon molecolari. Questa tecnica consente analisi cinetiche quantitative della riparazione del DNA.

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Questo lavoro è stato supportato anche da finanziamenti della Fondazione Pittsburgh e il National Institutes of Health (NIH) [GM087798; CA148629; ES019498] per RWS. Il supporto per lo strumento UPCI lentivirale è stata fornita RWS mediante la concessione di supporto Cancer Center dal National Institutes of Health [P30 CA047904]. Il sostegno è stato fornito anche dalla University of Pittsburgh Dipartimento di Farmacologia &amp; Chemical Biology al DS. Il sostegno è stato fornito anche da ESTRO a CV.

<ol><li>Mutamba, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((XRCC1+and+base+excision+repair+balance+in+response+to+nitric+oxide%5BTitle%5D)+AND+%22DNA+Repair+%28Amst%29%22%5BJournal%5D)">XRCC1 and base excision repair balance in response to nitric oxide.</a> DNA Repair (Amst). 10, 1282-1293 (2011).</li>
<li>Tang, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((N-methylpurine+DNA+glycosylase+and+DNA+polymerase+beta+modulate+BER+inhibitor+potentiation+of+glioma+cells+to+temozolomide%5BTitle%5D)+AND+%22Neuro-oncology%22%5BJournal%5D)">N-methylpurine DNA glycosylase and DNA polymerase beta modulate BER inhibitor potentiation of glioma cells to temozolomide.</a> Neuro-oncology. 13, 471-486 (2011).</li>
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<li>Kreklau, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+fluorometric+oligonucleotide+assay+to+measure+O%28+6%29-methylguanine+DNA+methyltransferase%2C+methylpurine+DNA+glycosylase%2C+8-oxoguanine+DNA+glycosylase+and+abasic+endonuclease+activities%3A+DNA+repair+status+in+human+breast+carcinoma+cells+overexpressing+methylpurine+DNA+glycosylase%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">A novel fluorometric oligonucleotide assay to measure O( 6)-methylguanine DNA methyltransferase, methylpurine DNA glycosylase, 8-oxoguanine DNA glycosylase and abasic endonuclease activities: DNA repair status in human breast carcinoma cells overexpressing methylpurine DNA glycosylase.</a> Nucleic Acids Res. 29, 2558-2566 (2001).</li>
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<li>Liu, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+molecular+beacon+to+monitor+activity+of+E.+coli+DNA+ligase%5BTitle%5D)+AND+%22The+Analyst%22%5BJournal%5D)">Using molecular beacon to monitor activity of E. coli DNA ligase.</a> The Analyst. 130, 350-357 (2005).</li>
<li>Xiao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Catalytic+beacons+for+the+detection+of+DNA+and+telomerase+activity%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Catalytic beacons for the detection of DNA and telomerase activity.</a> J. Am. Chem. Soc. 126, 7430-7431 (2004).</li>
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<li>Sokol, D. L., Zhang, X., Lu, P., Gewirtz, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real+time+detection+of+DNA.RNA+hybridization+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Real time detection of DNA.RNA hybridization in living cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95, 11538-11543 (1998).</li>
<li>Yang, X., Tong, C., Long, Y., Liu, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+fluorescence+assay+for+hSMUG1+activity+based+on+modified+molecular+beacon%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+cellular+probes%22%5BJournal%5D)">A rapid fluorescence assay for hSMUG1 activity based on modified molecular beacon.</a> Molecular and cellular probes. 25, 219-221 (2011).</li>
<li>Mirbahai, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+a+molecular+beacon+to+track+the+activity+of+base+excision+repair+protein+OGG1+in+live+cells%5BTitle%5D)+AND+%22DNA+Repair+%28Amst%29%22%5BJournal%5D)">Use of a molecular beacon to track the activity of base excision repair protein OGG1 in live cells.</a> DNA Repair (Amst). , (2009).</li>
<li>Maksimenko, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+molecular+beacon+assay+for+measuring+base+excision+repair+activities%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Biophys.+Res.+Commun%22%5BJournal%5D)">A molecular beacon assay for measuring base excision repair activities.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 319, 240-246 (2004).</li>
</ol>

RWS è un consulente scientifico per Trevigen, Inc. Il resto degli autori dichiarano che non ci siano conflitti di interesse.

Ci sono più di 600 citazioni usando &#39;faro molecolare&#39; il termine per rilevare e quantificare molecole di numerose attività enzimatiche, inclusa l&#39;attività elicasi 6, attività di DNA polimerasi 7,8, l&#39;attività del DNA ligasi 9, l&#39;attività della telomerasi 10, l&#39;attività del DNA fotoliasi 11 e DNA / RNA ibridi 12, tra molti altri. Oltre all&#39;uso di segnali molecolari per la misurazione delle attività di riparazione del DNA sopra e...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome del reattivo </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td><td> Comments </td></tr><tr><td> Cloruro di potassio </td><td> Pescatore </td><td> P217-500 </td><td> Grade molecolare </td></tr><tr><td> EDTA </td><td> Pescatore </td><td> BP120-500 </td><td></td></tr><tr><td> Glicerina </td><td> Pescatore </td><td> BP229-1 </td><td> Grade molecolare </td></tr><tr><td> DTT </td><td> Pescatore </td><td> BP172-5 </td><td></td></tr><tr><td> HEPES-Solution </td><td> Invitrogen </td><td> 15630 </td><td></td></tr><tr><td> HEPES-Salt </td><td> Sigma </td><td> H4034-500G </td><td></td></tr><tr><td> Idrossido di potassio </td><td> Sigma </td><td> 17-8 </td><td></td></tr><tr><td> 0.22μM filtro </td&gt; <td> Nalgene </td><td> 167-0020 </td><td></td></tr><tr><td> Slide-A-Lyzer dialisi Prodotti </td><td> Perforare </td><td> 66373 </td><td> MW 7000 </td></tr><tr><td> Siringa </td><td> Pescatore </td><td> 309659 </td><td></td></tr><tr><td> Ago </td><td> Pescatore </td><td> 305196 </td><td></td></tr><tr><td> Microcentrifuga 1,5 ml Tubes </td><td> Pescatore </td><td> 05-408-129 </td><td> Nero </td></tr><tr><td> Falcon 15 ml Tubes </td><td> Pescatore </td><td> 352097 </td><td></td></tr><tr><td> NucBuster Protein Extraction Kit </td><td> Calbiochem </td><td> 71183 </td><td></td></tr><tr><td> PBS </td><td> Invitrogen </td><td> 14190 </td><td></td></tr><tr><td> Molecular Beacons </td><td> IDT </td><td></td><td></td></tr><tr><td> BioRad Protein test dye reagente di concentrato </td><td> BioRad </td><td> Cat # 500-0006 </td><td></td></tr></tbody></table>

quantitativa, in tempo reale analisi dell&#39;attività riparazione per escissione base in lisati cellulari utilizzando molecular beacons lesione specifici

Quantitative, Real-time Analysis of Base Excision Repair Activity in Cell Lysates Utilizing Lesion-specific Molecular Beacons

Noi descriviamo un metodo per la determinazione quantitativa, misurazione in tempo reale di DNA glicosilasi e attività di endonucleasi di AP in lisati cellulari nucleari di base utilizzando escissione riparazione (BER) segnali molecolari. Il substrato (beacon) è costituito da un deoxyoligonucleotide contenente una singola lesione base con un 6-carbossifluoresceina (6-FAM) porzione coniugata alla estremità 5 &#39;e una frazione DABCYL coniugato all&#39;estremità 3&#39; dell&#39;oligonucleotide. Il faro BER molecolare è 43 basi di lunghezza e la sequenza è progettato per favorire la formazione di una forcina struttura con 13 nucleotidi nel ciclo e 15 coppie di basi in 1,2 stelo. Quando ripiegato in questa configurazione il 6-FAM frazione viene bloccata mediante DABCYL in un modo non fluorescente tramite trasferimento di energia di risonanza Förster (FRET) 3,4. La lesione è posizionato in modo tale che in seguito alla rimozione lesione base e scissione filamento il restante 5 oligonucleotide base contenente il 6-FAM frazione viene rilasciato dallo stelo. Rilasciare undistacco dalle nd (DABCYL) risultati quencher in un aumento di fluorescenza che è proporzionale al livello di riparazione del DNA. Con la raccolta di più letture dei valori di fluorescenza, valutazione in tempo reale dell&#39;attività BER è possibile. L&#39;impiego di standard quantitativa PCR in tempo reale strumenti consente l&#39;analisi simultanea di numerosi campioni. La progettazione di questi fari BER molecolari, con una lesione singola base, è suscettibile di analisi cinetica, la quantificazione BER e convalida inibitore ed è adattabile per la quantificazione dell&#39;attività riparazione del DNA in tessuto e lisati cellulari tumorali o con proteine ​​purificate. L&#39;analisi dell&#39;attività BER in lisati tumorali o tessuto aspira utilizzando questi segnali molecolari può essere applicabile a misurazioni biomarker funzionali. Inoltre, l&#39;analisi dell&#39;attività BER con proteine ​​purificate utilizzando questo saggio quantitativo fornisce una rapida, ad alta capacità metodo per la scoperta e la convalida di inibitori BER.

Noi descriviamo un metodo per la determinazione quantitativa, misurazione in tempo reale di DNA glicosilasi e attività di endonucleasi di AP in lisati cellulari nucleari. Il test produce tassi di attività DNA Repair suscettibili di analisi cinetica ed è adattabile per la quantificazione delle attività di riparazione del DNA nei tessuti e lisati tumorali o con le proteine ​​purificate.

Quantitativa, in tempo reale Analisi dell&#39;attività riparazione per escissione Base in lisati cellulari Utilizzando Molecular Beacons Lesione specifici

Descriviamo un metodo per la misurazione quantitativa e in tempo reale delle attività della DNA glicosilasi e dell'AP endonucleasi in lisati nucleari cellulari utilizzando basi...

L'obiettivo generale del seguente esperimento è misurare in tempo reale i tassi di riparazione del DNA e di estratti nucleari cellulari utilizzando sonde molecolari che fluorescono una volta riparate. Le sonde molecolari per la riparazione mediante escissione di base sono costituite da oligonucleotidi deossiribonucleici in una struttura a stem-loop contenente una singola lesione di base, con sei gruppi fluorofori ossi-fluoresceina legati alle estremità 5' e dil moti coniugato alle estremità 3'. Quando la struttura è ripiegata, il gruppo fam sei viene spento da dab sil in modo non fluorescente mediante trasferimento di energia di risonanza di Förster.Per valutare l'attività di riparazione del DNA, le sonde vengono incubate con estratti nucleari cellulari, che contengono enzimi di riparazione. Il DNA glicosilasi riconosce e rimuove la lesione del DNA presente nella sonda. I siti ABA risultanti sono substrati per l'endonucleasi AP uno o ape uno. Dopo il riconoscimento, APE uno taglia lo scheletro del DNA nel sito ABA, consentendo al filamento di DNA contenente il gruppo fam di dissociarsi liberamente dalla struttura a forcina.Il distacco dal quencher provoca un aumento della fluoresce

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Qui, lo studio di diversi approcci di riconoscimento delle lesioni del DNA tramite l'imaging AFM a singola molecola è dimostrato con il sistema di riparazione per escissione nucleotidica come esempio. Vengono descritte le procedure di preparazione dei campioni di DNA e proteine e i dettagli sperimentali e analitici per gli esperimenti AFM.

Microscopia a forza atomica Ricerche del riconoscimento delle lesioni del DNA nella riparazione di excisione dei nucleotidi

Qui viene dimostrato come può essere utilizzato il test di Ligation Proximity (PLA) in situ per rilevare e visualizzare le interazioni proteiche-proteiche dirette tra ATM e p53 nelle colture di cellule di sospensione esposte a stress genotossico.

Rilevamento e visualizzazione di complessi proteici indotti da danni a DNA nelle cellule di cellule di sospensione utilizzando il test di legatura di prossimità

Studiare la cinetica di riparazione danni del DNA richiede un sistema di indurre lesioni alle regioni definite sub-nucleare. Descriviamo un metodo per creare interruzioni di double-stranded localizzate utilizzando un microscopio confocale a scansione laser, dotato di un laser di 405 nm e forniscono procedure automatizzate per quantificare la dinamica di fattori di riparazione a queste lesioni.

Indagine di assunzione di proteine per lesioni del DNA utilizzando 405 Nm Laser Micro-irradiazione

L'obiettivo del presente protocollo è quello di quantificare la riparazione di definiti legami incrociati della DNA-proteina il DNA del plasmide. Lesi plasmidi sono transfected nelle linee cellulari di mammifero destinatario e basso peso molecolare raccolte a più punti di tempo post-transfezione. Cinetica di riparazione del DNA sono quantificati utilizzando primer specifici strand estensione seguita da qPCR.

Un'analisi semplice, rapida e quantitativa per riparazione di misura di legami incrociati della DNA-proteina su plasmidi Transfected nelle cellule di mammifero

Un metodo non-radio-isotopica non etichettata per correzione di bozze della polimerasi del DNA e un saggio di riparazione del DNA è stato sviluppato utilizzando la spettrometria di massa MALDI-TOF ad alta risoluzione e una strategia di estensione di singolo nucleotide. Il test ha dimostrato di essere molto specifico, semplice, rapida e facile da eseguire per la correzione di bozze e riparare le patch inferiore 9-nucleotidi.

Correzione di bozze e saggio di riparazione del DNA usando l'analisi di spettrometria di massa di singolo Nucleotide estensione e MALDI-TOF

Questo articolo introduce passaggi essenziali di immunosomodulazione e immunoprecipitazione della cromatina. Questi protocolli sono comunemente usati per studiare i processi cellulari legati ai danni al DNA e per visualizzare e quantificare il reclutamento di proteine implicate nella riparazione del DNA.

Visualizzazione e quantificazione dei danni al DNA specifici del sito basati sull'endonucleasi

Qui viene presentata l'endonucleasi sgRNA/CAS9 e il protocollo di sequenziamento di nuova generazione che può essere utilizzato per identificare le mutazioni associate alla riparazione della rottura del doppio filamento vicino al promotore CD4.

Utilizzo del sequenziamento di nuova generazione per identificare le mutazioni associate alla riparazione di una rottura a doppio filamento indotta da CAS9 vicino al promotore CD4

I saggi di acquisizione D-loop (DLC) e D-loop extension (DLE) utilizzano il principio della legatura di prossimità insieme alla PCR quantitativa per quantificare la formazione di D-loop, l'estensione del D-loop e la formazione del prodotto nel sito di una rottura inducibile a doppio filamento in Saccharomyces cerevisiae.

Individuazione di intermedi di ricombinazione omologhi tramite legatura di prossimità e PCR quantitativa in Saccharomyces cerevisiae

Qui viene presentato un protocollo per il dosaggio degli enzimi metabolizzanti degli acidi nucleici, utilizzando esempi di enzimi ligasi, nucleasi e polimerasi. Il test utilizza oligonucleotidi marcati in fluorescenza e non marcati che possono essere combinati per formare duplex che imitano i danni all'RNA e/o al DNA o gli intermedi di percorso, consentendo la caratterizzazione del comportamento enzimatico.

Utilizzo di oligonucleotidi sintetici modificati per il dosaggio degli enzimi che metabolizzano gli acidi nucleici

Presentiamo protocolli per la valutazione della competenza del percorso di riparazione a doppio filamento di rottura nelle cellule utilizzando una suite di substrati reporter extracromosomici basati sulla luminescenza.

Valutazione dell'attività di riparazione della rottura del doppio filamento del DNA utilizzando saggi reporter ad alto rendimento e quantitativi basati sulla luminescenza

Scopri un metodo per misurare in tempo reale l'attività delle glicosilasi e delle AP endonucleasi nei lisati nucleari cellulari utilizzando beacon molecolari. Questa tecnica consente analisi cinetiche quantitative della riparazione del DNA.

Quantitativa, in tempo reale Analisi dellattività riparazione per escissione Base in lisati cellulari Utilizzando Molecular Beacons Lesione specifici (Video) | JoVE Journal

Quantitativa, in tempo reale Analisi dell'attività riparazione per escissione Base in lisati cellulari Utilizzando Molecular Beacons Lesione specifici

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