Quantitativa, in tempo reale Analisi dell'attività riparazione per escissione Base in lisati cellulari Utilizzando Molecular Beacons Lesione specifici

L'obiettivo generale del seguente esperimento è misurare in tempo reale i tassi di riparazione del DNA e di estratti nucleari cellulari utilizzando sonde molecolari che fluorescono una volta riparate. Le sonde molecolari per la riparazione mediante escissione di base sono costituite da oligonucleotidi deossiribonucleici in una struttura a stem-loop contenente una singola lesione di base, con sei gruppi fluorofori ossi-fluoresceina legati alle estremità 5' e dil moti coniugato alle estremità 3'. Quando la struttura è ripiegata, il gruppo fam sei viene spento da dab sil in modo non fluorescente mediante trasferimento di energia di risonanza di Förster.

Per valutare l'attività di riparazione del DNA, le sonde vengono incubate con estratti nucleari cellulari, che contengono enzimi di riparazione. Il DNA glicosilasi riconosce e rimuove la lesione del DNA presente nella sonda. I siti ABA risultanti sono substrati per l'endonucleasi AP uno o ape uno. Dopo il riconoscimento, APE uno taglia lo scheletro del DNA nel sito ABA, consentendo al filamento di DNA contenente il gruppo fam di dissociarsi liberamente dalla struttura a forcina.

Il distacco dal quencher provoca un aumento della fluorescenza proporzionale al livello di riparazione del DNA, che può essere valutato in tempo reale mediante un apparato per PCR quantitativa in tempo reale. La capacità di riparare i danni al DNA è fondamentale per ogni cellula e ogni organismo. Tra le numerose vie cellulari di riparazione del DNA, la riparazione per escissione di basi mira a basi danneggiate che possono derivare da attacchi ossidativi o chimici; chiarire il ruolo di singoli elementi cellulari che potrebbero influenzare questa via di riparazione rappresenta uno degli obiettivi principali dei nostri studi in laboratorio.

Pertanto, misurare con precisione e sensibilità l'attività di riparazione del DNA è diventato un interesse del nostro laboratorio. Questo saggio può fornire tali dati. Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come la marcatura con 32 PN e l'analisi mediante elettroforesi su gel, è che la nostra tecnica non utilizza substrati marcati radioattivamente, può misurare i tassi di riparazione in tempo reale e presenta un intervallo dinamico molto ampio.

Inoltre, questo approccio può utilizzare diverse basi fluorescenti e/o lesioni della base per determinare la specificità del substrato. Abbiamo dimostrato che questo saggio è altamente quantitativo e molto sensibile in diverse condizioni. Questo saggio molecolare basato sul riparo delle escissioni di basi è adatto all'analisi cinetica.

L'elevata sensibilità e specificità del saggio permettono una quantificazione accurata della riparazione mediante escissione di basi, risultando quindi utile per schermate di inibitori della riparazione o per la validazione. Inoltre, è adattabile per misurare l'attività di riparazione in lisati di tessuti e cellule tumorali al fine di effettuare misurazioni funzionali di biomarcatori. Quando si progettano sonde molecolari destinate a questo saggio, prendere in considerazione gli oligonucleotidi di DNA di 43 basi di lunghezza riportati qui di seguito.

Lavorare bene. La sequenza di DNA non è unica, ma deve permettere la formazione di una struttura a forcina. Quando è piegata come mostrato qui, la specificità viene raggiunta mediante l'inserimento di lesioni di basi specifiche, come l'uracile o la tetraidrofuran.

Alla posizione X, sei basi dall'estremità 5′, il contenuto di GC dovrebbe essere almeno del 32% e una base GB non dovrebbe essere posizionata all'estremità 5′. Il fluorocromo sei carbossi fluoresceina o sei fam deve essere coniugato all'estremità 5′ e l'estremità 3′ deve essere modificata con dab sil. Questo costituirà il substrato per le proteine di riparazione del DNA per garantire il legame e l'attività dei glicosilasi.

La posizione della lesione è stata scelta in modo da garantire uno spazio sufficiente rispetto alla struttura a forcina e all'estremità del DNA. La lunghezza dello stelo o del tratto duplex a forcina deve essere di almeno 15 paia di basi. La lunghezza consigliata per il loop è di 13 basi.

La sonda molecolare di controllo deve essere identica alla sonda molecolare sperimentale, tranne per il fatto che non contiene una lesione del DNA. Di conseguenza, non dovrebbe essere riconosciuta dagli enzimi di riparazione del DNA. Una volta ottenute le sonde molecolari, si dovrebbe eseguire una valutazione della qualità per assicurarsi che le sonde non emettano fluorescenza fino a quando non vengono riscaldate.

E per determinare la temperatura di fusione ottimale, tutti i passaggi durante la procedura di estrazione devono essere eseguiti su ghiaccio o a quattro gradi Celsius. Per garantire la stabilità delle proteine, prepararsi per l'esperimento pre-raffreddando. Due becher da un litro per tampone di dialisi per campione, camere di dialisi, microcentrifuga, provette, siringhe e aghi.

Etichettare provette coniche da 15 millilitri e posizionarle sul ghiaccio. Aspirare il mezzo di crescita dalle cellule, quindi lavarle due volte con 7,5 millilitri di PBS freddo dopo il secondo lavaggio. Aggiungere cinque millilitri di PBS freddo in ogni piastra e utilizzare un cell lifter per staccare le cellule dalla piastra.

Trasferire le cellule in un tubo conico da 15 millilitri pre-raffreddato, quindi centrifugare a 500 volte G a quattro gradi Celsius per cinque minuti. Al termine della centrifugazione, rimuovere il soprannatante e stimare il volume cellulare compatto confrontandolo con volumi noti di liquido in tubi simili. Centrifugare nuovamente i tubi per un altro minuto, quindi rimuovere il PBS residuo con una pipetta.

Sospendere il pellet cellulare in 150 microlitri di reagente di estrazione Nuke Buster uno per ogni 50 microlitri di volume cellulare compresso. Successivamente, trasferire le cellule risospese in una provetta da 1,5 millilitro preraffreddata ed eseguire un vortex per 15 secondi ad alta velocità. Dopo il vortex, incubare la provetta sul ghiaccio per cinque minuti, quindi eseguire un altro vortex per 15 secondi e centrifugare a 13.000 ×g per cinque minuti a quattro gradi Celsius.

Dopo la centrifugazione, rimuovere e scartare il soprannatante, che contiene la frazione citoplasmatica. Risospendere il pellet in una miscela di un microlitro di cocktail inibitore di proteasi 100x, un microlitro di DTT 100 millimolari e 75 microlitri di reagente di estrazione Nuke Buster, per ogni 50 microlitri di volume cellulare compresso.

Vortexare le cellule per 15 secondi ad alta velocità. Incubare sul ghiaccio per cinque minuti e quindi vortexare nuovamente per 15 secondi ad alta velocità, centrifugare a 13.000 × g per cinque minuti a 4 °C. Dopo la centrifugazione, utilizzare una siringa per trasferire il soprannatante, che contiene le proteine nucleari, in una cassetta per dialisi su vetrino con un cutoff di peso molecolare di 7.000.

Successivamente, aggiungere 500 microlitri di DTT uno molare a 500 millilitri di tampone per dialisi preraffreddato e sottoporre il lisato a dialisi per 90 minuti a quattro gradi Celsius con agitazione delicata. Dopo 90 minuti, trasferire la cassetta per dialisi in un secondo becher contenente 0,5 litri di tampone per dialisi preraffreddato con DTT ed eseguire ulteriormente la dialisi per 90 minuti a quattro gradi Celsius con agitazione delicata. Al termine della dialisi, l'estratto potrebbe essersi cristallizzato a causa dell'elevata concentrazione proteica.

Successivamente, inserire una nuova siringa in un port diverso da quello utilizzato per iniettare la cassetta e raccogliere la soluzione proteica nucleare dializzata dalla cassetta di dialisi. Cercare di includere i cristalli dal colore torbido durante il prelievo della soluzione proteica nucleare dializzata. Aliquotare il campione in provette microcentrifuga da 20 microlitri ciascuna, congelarle rapidamente su ghiaccio secco e quindi conservarle a meno 80 gradi Celsius fino al momento dell'uso.

Determinare la concentrazione delle proteine ed eseguire il controllo di qualità come descritto nel documento allegato. Per eseguire il saggio con sonde molecolari, scongelare e diluire i lisati cellulari fino a due microgrammi per microlitro di proteina con tampone di reazione per la riparazione basica degli escissi contenente un millimolare di DTT; diluire le sonde molecolari a 200 micromolari con il tampone di reazione per la riparazione basica degli escissi. Poiché il termociclatore per PCR quantitativa in tempo reale non viene generalmente utilizzato come fluorimetro, modificare il metodo di esecuzione sul termociclatore per PCR quantitativa in tempo reale in modo da raccogliere i dati ogni 20 secondi a 37 gradi Celsius per almeno 180 cicli.

Poi ogni 20 secondi per 15 cicli al massimo della fluorescenza del beacon molecolare per ottenere dati per la normalizzazione. Impostare il volume della reazione a 25 microlitri. Quindi configurare la progettazione della piastra sullo strumento utilizzando il software Applied Biosystem con la curva standard selezionata come tipo di esperimento e completare il layout della piastra.

Un esempio è mostrato in questa tabella, che può essere trovato anche nel documento allegato. Non aggiungere nulla al pozzetto selezionato come curva standard. Mettere su ghiaccio il buffer di reazione per la riparazione per escissione di base, il DTT, il lisato cellulare a una concentrazione di due microgrammi per microlitro e tutte le sonde molecolari utilizzate nell'esperimento.

Quindi aggiungere il DTT al tampone di reazione per la riparazione mediante escissione basica fino a una concentrazione finale di un millimolare. Pipettare 15 microlitri di tampone di reazione per la riparazione mediante escissione basica con DTT in ciascun pozzetto di una piastra ottica Q-R-T-P-C-R compatibile posta sul ghiaccio. Successivamente, seguendo il layout della piastra, pipettare le sonde nei pozzetti appropriati.

Ogni combinazione di lisato e sonda molecolare o controllo deve essere sottoposta a saggio in triplice replicato. Infine, pipettare cinque microlitri per pozzetto del lisato nucleare diluito nei pozzetti appropriati. È importante ricordare di mantenere sempre freddi tutti i reagenti della sonda molecolare e di aggiungere i lisati nella piastra come ultimo passaggio.

Ricordare che i lisati contengono proteine attive e inizieranno a riparare i beacon molecolari non appena vengono pipettati nella miscela di reazione. Pertanto, è molto importante mantenere tutti i reagenti freddi per minimizzare la quantità di riparazione dei beacon che avviene prima di iniziare le misurazioni. Una volta aggiunti tutti i componenti, sigillare la piastra con un film adesivo ottico e mescolare agitando delicatamente la piastra.

Quindi eseguire una breve centrifugazione di dieci secondi con una centrifuga per raccogliere le soluzioni sul fondo delle provette o della piastra; al termine, inserire la piastra nel termociclatore per PCR quantitativa in tempo reale e avviare il saggio. Dopo il completamento, esportare i dati grezzi preferibilmente in formato Excel e seguire le istruzioni nel documento allegato per analizzare i dati una volta effettuate le calcolazioni necessarie. Riportare i dati di fluorescenza normalizzati come percentuale di fam libero in funzione del tempo in secondi in un grafico a dispersione con gli errori corrispondenti, al fine di valutare l'attività di riparazione del DNA e la qualità degli estratti nucleari ottenuti dalle cellule LN 4 28 e da una linea cellulare con sovraespressione di MPG indicata come LN 4 28 MPG. Il saggio descritto in questo video è stato eseguito utilizzando una sonda molecolare contenente il substrato APE one tetra furin come controllo positivo.

Come mostrato in questa figura, entrambe le linee cellulari presentano una marcata attività di APE1, indicata dalla ripida pendenza, e un'attività di DNA glicosilasi specifica per la rimozione del substrato MPG. L'ipoxantina (indicata come HX) è stata misurata nei lisati nucleari di entrambe le linee cellulari. Ciascun lisato è stato analizzato utilizzando un beacon molecolare di controllo per la riparazione mediante escissione di base o un beacon molecolare per la riparazione mediante escissione di base specifico per HX; per il beacon di controllo, LN 4 28 è mostrato in verde e LN 4 28 MPG in viola, per il beacon dell'ipoxantina.

LN 4 28 è mostrato in blu e LN 4 28 MPG in arancione. I risultati sono riportati come A unità di fluorescenza media e B, fluorescenza normalizzata. In ogni cellula si è verificato un aumento della fluorescenza dipendente dal tempo, indicativo della riparazione di HX.

Lisato incubato con la sonda molecolare HX come previsto. La linea cellulare LN 4 28 MPG indicata dal tracciato arancione ha mostrato un tasso di riparazione molto più elevato, indicato da un accumulo più rapido della fluorescenza, rispetto alla linea cellulare parentale LN 4 28, che possiede una quantità minima di proteina MPG. Pertanto, il tasso di riparazione di lesioni specifiche del DNA da parte di proteine di riparazione specifiche può essere misurato in tempo reale da estratti cellulari con livelli di fondo minimi di scissione non specifica del DNA.

Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come progettare i propri beacon molecolari e misurare i tassi di riparazione del DNA in tempo reale utilizzando proteine purificate o lisati cellulari. Per quanto riguarda l'analisi, è essenziale valutare la dinamica di risposta e i valori di fondo; per farlo, includere reazioni di controllo, ad esempio con o senza beacon di controllo positivo e negativo. Considerando la variabilità tra pozzetto e pozzetto, è utile normalizzare i dati dei singoli pozzetti rispetto ai valori iniziali.

Questi sono determinati dal passo più fine alla temperatura di fusione. Questo, insieme all'inclusione di altri coloranti come un colorante di tipo rock, tiene conto della variabilità intrinseca agli errori di pipettaggio o alle differenze nei detector. Questa tecnica ci ha permesso di chiarire l'influenza dei singoli componenti del sistema di riparazione mediante escissione sulla riparazione complessiva dell'attività e della capacità.

È sufficientemente sensibile da rivelare piccoli cambiamenti che non sarebbero stati rilevabili con metodi convenzionali.