Quantitativa, in tempo reale Analisi dell'attività riparazione per escissione Base in lisati cellulari Utilizzando Molecular Beacons Lesione specifici

L'obiettivo generale del seguente esperimento è misurare i tassi di riparazione del DNA e degli estratti nucleari cellulari in tempo reale utilizzando fari molecolari che emettono fluorescenza una volta riparati. I fari molecolari di riparazione per escissione di base sono costituiti da oligonucleotidi deossi in una struttura ad ansa di stelo contenente una singola lesione di base con sei frazioni di ossifluoresceina a curva coniugate alle cinque estremità primarie e dil moti coniugate alle tre estremità prime quando ripiegate. Il sei famiglie viene spento mediante dab sil in modo non fluorescente tramite trasferimento di energia di risonanza forestale.

Per valutare l'attività di riparazione del DNA, i beacon vengono incubati con estratti nucleari cellulari, che contengono enzimi di riparazione. Il glicosilato di DNA viene riconosciuto e rimuove la lesione del DNA nel faro. I siti ABA risultanti sono substrati per l'endonucleasi AP uno o per la scimmia uno Al riconoscimento, APE uno fende la spina dorsale del DNA nel sito ABA, consentendo al DNA contenente le sei fam di dissociarsi liberamente dalla forcina.

Il distacco dal quencher determina un aumento della fluorescenza che è proporzionale al livello di riparazione del DNA e può essere valutato in tempo reale utilizzando una macchina per PCR quantitativa in tempo reale. La capacità di riparare i danni al DNA è fondamentale per ogni cellula e ogni organismo. Tra la moltitudine di percorsi di riparazione del DNA cellulare, bersagli di riparazione per escissione di basi, basi danneggiate che possono derivare da insulti ossidativi o chimici, chiarire il ruolo dei singoli elementi cellulari che potrebbero influenzare la riparazione per escissione di basi è uno degli obiettivi principali nei nostri studi di laboratorio.

Pertanto, misurare l'attività di riparazione del DNA in modo accurato e sensibile è diventato un interesse per il nostro laboratorio. Questo test può fornire tali dati. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti come la marcatura a 32 PN e l'analisi mediante elettroforesi su gel è che la nostra tecnica non utilizza substrati marcati radioattivi, può misurare i tassi di riparazione dei dati in tempo reale e ha una gamma dinamica molto ampia.

Inoltre, questo approccio può utilizzare diversi fluoro quattro e/o lesioni di base per determinare la specificità del substrato. Abbiamo dimostrato che questo test è altamente quantitativo e molto sensibile in diversi contesti. Questo saggio di riparazione molecolare beacon per escissione di basi è suscettibile di analisi cinetica.

L'elevata sensibilità e specificità del test consente un'accurata quantificazione della riparazione per escissione di basi ed è quindi utile per gli screening o la convalida degli inibitori della riparazione. Inoltre, è adattabile per misurare l'attività di riparazione del dario e i tessuti e i lisati delle cellule tumorali per la misurazione dei biomarcatori funzionali. Quando si progettano i beacon molecolari che verranno utilizzati per questo test, considerare i seguenti oligonucleotidi di DNA che sono lunghi 43 basi, come mostrato qui.

Lavora bene. La sequenza del DNA non è unica, ma deve permettere la formazione di una struttura a forcina. Quando si è inginocchiati, come mostrato qui, la specificità si ottiene inserendo lesioni basali specifiche come l'uracile o la tetra idro furina.

Nella posizione X, a sei basi dall'estremità dei cinque numeri principali, il contenuto GC deve essere almeno del 32% e una base GB non deve essere posizionata all'estremità dei cinque numeri principali. Sei carbossi-fluoresceina o sei fam devono essere coniugati all'estremità a cinque primi e le tre estremità prime devono essere modificate con dab sil. Questo sarà il substrato per le proteine di riparazione del DNA per assicurare il legame e l'attività dei rilasci di glicosilico.

La posizione della lesione è stata scelta in modo da fornire spazio sufficiente dalla struttura a forcina e dall'estremità del DNA. La lunghezza del gambo o del duplex a forcina dovrebbe essere di almeno 15 coppie di basi. La lunghezza consigliata dell'anello è di 13 basi.

Il beacon molecolare di controllo deve essere identico al beacon molecolare sperimentale, tranne per il fatto che non contiene una lesione del DNA. Non dovrebbe quindi essere riconosciuto dagli enzimi di riparazione del DNA. Una volta che i beacon molecolari sono in mano, è necessario eseguire una valutazione della qualità per garantire che i beacon non emettano fluorescenza fino a quando non vengono riscaldati.

E per determinare la temperatura di fusione ottimale, tutti i passaggi durante la procedura di estrazione devono essere eseguiti su ghiaccio o a quattro gradi Celsius. Per garantire la stabilità delle proteine, prepararsi per l'esperimento mediante pre-raffreddamento. Due becher da un litro per campione, camere tampone per dialisi, microcentrifuga, provette, siringhe e aghi.

Etichettare i tubi conici da 15 millilitri e metterli sul ghiaccio. Aspirare il terreno di coltura dalle cellule e poi lavarle due volte con 7,5 millilitri di PBS freddo Dopo il secondo lavaggio. Aggiungi cinque millilitri di PBS freddo a ogni piatto e usa un sollevatore di cellule per raschiare le cellule dalla piastra.

Trasferire le celle in una provetta conica da 15 millilitri raffreddata, quindi centrifugare a 500 volte G a quattro gradi Celsius per cinque minuti. Dopo la centrifuga, rimuovere il surnatante e stimare il volume delle cellule impaccate confrontandolo con i volumi noti di liquido in provette simili. Centrifugare le provette per un altro minuto e poi rimuovere il PBS rimanente con una pipetta resus.

Sospendere il pellet cellulare in 150 microlitri di reagente per l'estrazione di nuke buster, uno per ogni 50 microlitri di volume di cellule impacchettate. Quindi trasferire le celle risospese in un tubo pre-raffreddato da 1,5 millilitri e agitare per 15 secondi ad alta velocità. Dopo il vortex, incubare la provetta sul ghiaccio per cinque minuti, quindi agitare per altri 15 secondi e centrifugare a 13.000 volte G per cinque minuti a quattro gradi Celsius.

Dopo la centrifuga, rimuovere e scartare il surnatante, che contiene la frazione citoplasmatica. Resus sospendere il pellet in una miscela di un microlitro di resus sospeso 100 cocktail di inibitori della proteasi, un microlitro di DTT da 100 millimolari e 75 microlitri di estrazione nuke buster. Reagente due per 50 microlitri di volume di cellule impaccate.

Celle di Vortex per 15 secondi ad alta velocità. Incubare su ghiaccio per cinque minuti e di nuovo vorticare per 15 secondi con centrifuga ad alta velocità a 13.000 volte G per cinque minuti a quattro gradi Celsius. Dopo la centrifuga, si utilizza una siringa per trasferire il surnatante, che contiene le proteine nucleari, in una cassetta per dialisi a vetrino con un cutoff di 7.000 pesi molecolari.

Successivamente, aggiungere 500 microlitri di DTT molare a 500 millilitri di tampone di dialisi pre-raffreddato e dializzare il lisato per 90 minuti a quattro gradi Celsius mescolando delicatamente. Dopo 90 minuti, trasferire la cassetta per dialisi in un secondo becher contenente 0,5 litri di tampone per dialisi pre-raffreddato con DTT e dializzare. Il lisato per 90 minuti a quattro gradi Celsius con una leggera agitazione dopo la dialisi, l'estratto potrebbe essersi cristallizzato a causa delle alte concentrazioni proteiche.

Successivamente, inserire una nuova siringa in una porta diversa da quella utilizzata per iniettare la cassetta e raccogliere la soluzione proteica nucleare dializzata dalla cassetta di dialisi. Cerca di includere cristalli dall'aspetto torbido quando rimuovi la soluzione proteica nucleare dializzata. Aliquotare il campione in provette da microcentrifuga da 20 microlitri ciascuna, congelare rapidamente su ghiaccio secco e quindi conservarlo a meno 80 gradi Celsius fino al momento del bisogno.

Determinare la concentrazione di proteine ed eseguire il controllo di qualità come descritto nel documento di accompagnamento. Per eseguire il test del beacon molecolare, scongelare e diluire i lisati cellulari a due microgrammi per microlitro di proteina con un tampone di reazione di riparazione della cisione basica contenente un millimolare di DTT, diluire i beacon molecolari a 200 micromolari con un tampone di reazione di riparazione per escissione basica. Poiché la macchina per PCR quantitativa in tempo reale in genere non viene utilizzata come fluorimetro, modificare il metodo di esecuzione sulla macchina per PCR quantitativa in tempo reale per raccogliere dati ogni 20 secondi a 37 gradi Celsius per almeno 180 cicli.

Quindi ogni 20 secondi per 15 cicli alla massima fluorescenza del faro molecolare per ottenere dati per la normalizzazione. Impostare il volume di reazione su 25 microlitri. Quindi impostare il design della piastra sullo strumento utilizzando il software di biosistema applicato con la curva standard selezionata come tipo di esperimento, completare il layout della piastra.

In questa tabella è riportato un esempio, che si trova anche nel documento allegato. Non aggiungere nulla al pozzetto selezionato come curva standard. Posizionare il tampone di reazione di riparazione dell'escissione di base DTT lisato cellulare a una concentrazione di due microgrammi per microlitro e tutti i fari molecolari utilizzati nell'esperimento su ghiaccio.

Quindi aggiungere il DTT al tampone di reazione di riparazione per escissione di base fino a una concentrazione finale di una pipetta millimolare. 15 microlitri di tampone di reazione di riparazione per escissione di base con DTT in ciascun pozzetto di una piastra ottica Q-R-T-P-C-R compatibile su ghiaccio. Quindi, seguendo la disposizione della piastra, pipettare i fari nei pozzetti appropriati.

Ogni combinazione di lisato e beacon molecolare o controllo deve essere dosata in triplicato. Infine, pipettare cinque microlitri per pozzetto del lisato nucleare diluito negli appositi pozzetti. È importante ricordarsi di mantenere freddi tutti i reagenti beacon molecolari e di pipettare i lisati nella piastra come ultimo passaggio.

Ricorda, i lisati contengono proteine attive e inizieranno a riparare i fari molecolari non appena vengono pipettati nella miscela di reazione. Pertanto, è molto importante mantenere freddi tutti i reagenti per ridurre al minimo la quantità di riparazione dei beacon che si verifica prima di iniziare a effettuare le misurazioni. Una volta aggiunto il tutto, sigillare la lastra con pellicola adesiva ottica e mescolare picchiettando delicatamente la piastra.

Quindi eseguire una rapida centrifuga di dieci secondi con una centrifuga per raccogliere le soluzioni sul fondo delle provette o della piastra dopo la centrifuga, inserire la piastra nella macchina per PCR quantitativa in tempo reale e iniziare il test dopo il completamento, esportare i dati grezzi preferibilmente in formato Excel e seguire le istruzioni nel documento di accompagnamento per analizzare i dati una volta effettuati i calcoli necessari. Tracciare i dati di fluorescenza normalizzati come percentuale di fam libera rispetto al tempo in secondi in un grafico a dispersione con errori corrispondenti per valutare l'attività di riparazione del DNA e la qualità degli estratti nucleari dalle cellule LN 4 28 e da una linea cellulare di sovraespressione MPG designata come LN 4 28 MPG. Il test descritto in questo video è stato eseguito utilizzando un beacon molecolare contenente la tetra furina APE a un substrato come controllo positivo.

Come mostrato in questa figura, entrambe le linee cellulari hanno una robusta attività APE uno, come indicato dalla forte pendenza, attività del DNA glicosato specifica per la rimozione del substrato MPG. L'ipo ipoxantina, indicata come HX, è stata misurata nei lisati nucleari di entrambe le linee cellulari. Ogni lisato è stato analizzato utilizzando un beacon molecolare di controllo per la riparazione dell'escissione di base o un beacon molecolare HX per la riparazione dell'escissione di base per il beacon di controllo LN 4 28 è mostrato in verde e LN 4 28 MPG è mostrato in viola per l'hypo beacon.

LN 4 28 è mostrato in blu e LN 4 28 MPG è mostrato in arancione. I risultati sono riportati come A, le unità di fluorescenza medie e B, la fluorescenza normalizzata. In ogni cellula si è verificato un aumento della fluorescenza dipendente dal tempo, indicativo della riparazione dell'HX.

Il lisato è stato incubato con il beacon molecolare HX come previsto. La linea cellulare LN 4 28 MPG indicata dalla traccia arancione aveva un tasso di riparazione molto più elevato, come indicato dall'accumulo più rapido di fluorescenza rispetto alla linea cellulare parentale LN 4 28, che ha una proteina MPG minima. Pertanto, il tasso di riparazione per specifiche lesioni del DNA da parte di specifiche proteine di riparazione può essere misurato da estratti cellulari in tempo reale con livelli minimi di fondo di scissione del DNA non specifica.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come progettare i tuoi beacon molecolari e misurare i tassi di riparazione del DNA in tempo reale utilizzando proteine purificate o lisati cellulari. Per quanto riguarda l'analisi, è essenziale valutare la gamma dinamica e i valori di fondo includendo reazioni di controllo come con o senza i beacon di controllo positivi e negativi. Considerando la variabilità da pozzo a pozzo, è utile normalizzare i dati nei singoli pozzetti ai valori di input.

Questi sono determinati dal passaggio più fine alla temperatura di fusione. Questo e l'inclusione di altri coloranti come un dado di roccia spiegheranno la variabilità inerente agli errori di pipettaggio o alle differenze in un rivelatore. Questa tecnica ci ha permesso di chiarire l'influenza dei singoli componenti di riparazione per escissione sull'attività e la capacità di riparazione complessive.

È abbastanza sensibile da smascherare piccoli cambiamenti che non sarebbero stati rilevabili con i metodi convenzionali.