On-Chip Fenotipizzazione Endothelial infiammatoria

L'obiettivo di questo video è dimostrare una tecnica di laboratorio su un chip per caratterizzare lo stato infiammatorio delle cellule endoteliali. Per iniziare, le cellule endoteliali aortiche umane vengono coltivate fino a confluenza su un substrato per colture cellulari, quindi inserite in un dispositivo di taglio a piastra Conan. Le cellule vengono trattate con la citochina pro-infiammatoria, TNF alpha, ed esposte contemporaneamente a condizioni di stress da taglio differenziale per quattro ore, controllando con precisione la rotazione del cono sopra il substrato. Lo stress da taglio modula una risposta infiammatoria ben caratterizzata alla citochina.

Ciò include l'upregolazione di molecole di adesione come VCA-1 e ICAM-1. Il substrato viene trasferito sul palchetto del microscopio, dove un dispositivo microfluidico A-P-D-M-S viene sigillato sotto vuoto direttamente al monolayer, creando canali di flusso. Cellule monocitiche attivate, linee cellulari THP-1, vengono fatte fluire sopra l'hs precondizionato, dove si legano in proporzione al livello di espressione delle molecole di adesione cellulare.

Lo stato infiammatorio dell'endotelio viene determinato quantificando il numero totale di cellule THP-1 che sono fermamente arrestate. Ciao, mi chiamo She D Diverse e sono Greg Foster. E io sono Keith Bailey.

Siamo nei laboratori dei professori Pastor e Simon del Dipartimento di Ingegneria Biomedica dell'Università della California a Davis. Oggi descriveremo l'utilizzo di un approccio basato su un laboratorio su un chip per esaminare quantitativamente la disfunzione endoteliale e l'infiammazione. Questi strumenti forniscono una piattaforma che ci permette di condurre studi relativi alla sovrapposizione dello stress metabolico con fattori idrodinamici e alla regolazione del fenotipo infiammatorio endoteliale e della suscettibilità all'aterosclerosi.

Pertanto, facciamo riferimento ai nostri dispositivi come camere microfluidiche mimetiche vascolari, o VMMC. Questi dispositivi ci permettono di quantificare gli esiti infiammatori in cellule endoteliali e monociti in condizioni che simulano quelle presenti nei vasi aterogenici. La VMMC consente l'uso di piccole quantità di reagenti o materiali che potrebbero essere disponibili in quantità limitata.

Possono inoltre essere realizzati in un'ampia varietà di configurazioni e geometrie personalizzabili, rendendoli molto adatti per un'ampia gamma di applicazioni. Oggi illustreremo un esperimento rappresentativo utilizzando il nostro approccio di laboratorio su un chip. I monolayer endoteliali umani saranno esposti all'attivazione da citochine sotto stress di taglio ben definiti.

Dimostreremo l'uso della VMC per quantificare in tempo reale il reclutamento di cellule monocitiche umane sul monocstrato come lettura funzionale dell'attivazione endoteliale, utilizzando substrati circolari di tre pollici ricavati da piastre per colture cellulari di 100 millimetri. I substrati di tre pollici vengono lavati con acqua distillata, quindi sterilizzati immergendoli in etanolo al 70%. I substrati sterili vengono posizionati in piastre di Petri da 100 millimetri e lasciati asciugare.

Successivamente, vengono incubate con collagene di tipo I a una concentrazione di 100 microgrammi per millilitro per un'ora a temperatura ambiente e lavate con PBS. Le cellule endoteliali aortiche umane o HA vengono sospese a una concentrazione di 650.000 cellule per millilitro. Un millilitro di sospensione cellulare viene depositato in gocce su un substrato rivestito con collagene essiccato e distribuito in una sospensione uniforme.

I substrati con cellule sono quindi posizionati in un incubatore a 37 gradi con 5% di CO₂ e lasciati aderire alla superficie del substrato. Dopo un'ora, vengono aggiunti nove millilitri di mezzo di crescita EGM-2 e le cellule vengono fatte crescere fino a formare monocapati con una confluenza di circa il 90%. I monocapati sono pronti per essere utilizzati nei successivi esperimenti di shear. Le camere microfluidiche di tipo vascolare sono costruite versando del PDMS su un modello maestro che comprende la geometria del canale desiderata.

La base di silicone viene versata in una barca di plastica, seguita dall'agente indurente per silicone in un rapporto di 10 a 1 in peso. Il gel di PDMS viene quindi mescolato accuratamente, avendo cura di non raschiare i lati della barca di plastica per evitare di introdurre frammenti di plastica nella miscela. I master di photoresist vengono puliti con esano e preparati per la stampatura del VMMC.

La miscela di PDMS viene quindi versata sopra la forma maestra, poi posta all'interno di una camera a vuoto. All'interno della camera, l'aria viene rimossa dalla miscela di PDMS e risale alla superficie dopo 15 minuti.

Il modello viene rimosso dalla camera e l'aria viene soffiata delicatamente sulla superficie del PDMS per eliminare le bolle d'aria residue dal modello. Il modello viene quindi coperto e collocato in un forno a 37 gradi per un'ora, durante la quale il PMS viene lasciato polimerizzare. Rimuovere il gel di PDMS solidificato dal forno ed effettuare incisioni circolari intorno alla camera utilizzando un piccolo bisturi.

È fondamentale eseguire questa operazione gradualmente per evitare il contatto con il materiale photoresist, poiché ciò danneggerebbe lo stampo master. Escidere la camera microfluidica dallo stampo praticando fori per l'ingresso e l'uscita di ogni canale mediante un ago lure lock da 19 gauge. Inoltre, praticare fori per i tubi del vuoto in posizioni distanti dai canali.

La preparazione per il VMMC è ora completa. Pipettare la citochina pro-infiammatoria TNF alpha in sei millilitri di mezzo L 15 per ottenere una concentrazione finale di 0,5 nanogrammi per millilitro. Il mezzo L 15 viene utilizzato in questo caso come fluido di taglio grazie alla sua capacità tamponante del pH in assenza di CO2 al 5%.

Il mezzo viene quindi aspirato in una siringa sterile da 10 millilitri, che viene utilizzata per caricare il dispositivo di taglio. Il monolayer confluito viene quindi trasferito al dispositivo di taglio cellulare, che è stato sterilizzato con etanolo, livellato e impostato con l'altezza del traferro del cono. Il substrato viene rimosso dalla piastra di Petri e posizionato sul blocco campione di vetro, centrato e inserito con attenzione nella parte inferiore della camera di alloggiamento, in modo che il cono sia direttamente sopra le cellule.

Il substrato viene fissato serrando uniformemente le viti in acciaio inox intorno al blocco di riferimento. Successivamente, il mezzo di taglio viene caricato nella camera, avendo cura di non introdurre bolle d'aria. Poi, un computer viene utilizzato per impostare il programma desiderato di tensione di taglio e il motore micro separatore viene acceso.

Qui utilizziamo una sollecitazione oscillante di zero più o meno cinque dine per centimetro quadrato. Dopo quattro ore, il programma di sollecitazione viene interrotto. Il blocco di misura viene rimosso e il substrato viene riposizionato con attenzione nella piastra di Petri.

Le cellule sono ora pronte per il saggio di adesione dei monociti. Immediatamente dopo il taglio, i monociti su strato di HA vengono trasportati alla stazione microscopica per il montaggio del VMMC. Il VMMC viene collegato al tubo del vuoto e immerso in acqua deionizzata per rimuovere eventuali bolle d'aria intrappolate nei canali.

Con la valvola del vuoto inizialmente spenta, la camera viene premuta con attenzione sulla monocoltura e la valvola del vuoto viene attivata. È fondamentale assicurarsi che non siano rimaste intrappolate bolle d'aria all'interno dei canali della camera. A questo punto, 80 microlitri di HBSS con calcio e magnesio vengono prelevati con una pipetta e inseriti in un serbatoio ottenuto tagliando la punta di un ago lure Lock da 19 Gauge; il liquido viene espulso dalla punta premendo saldamente la parte superiore del serbatoio, che viene quindi inserito nella porta di ingresso del VMMC.

L'intero apparato viene posizionato sul tavolo del microscopio e vengono accesi la fotocamera del microscopio e il monitor video. Una siringa di vetro da 10 millilitri viene inserita nella pompa per siringa. Successivamente, il tubo della siringa viene collegato al porto di uscita del VMMC.

La portata è impostata per indurre uno sforzo di taglio di una dine per centimetro quadrato all'interno del canale, quindi viene eseguita in modalità di ricarica in modo che la siringa aspiri il fluido dal serbatoio attraverso il canale. Le cellule P1 stimolate con SDF1 sono sospese a una concentrazione di 2 milioni di cellule per millilitro. Entro due minuti dall'attivazione del flusso, vengono aggiunti 50 microlitri di sospensione cellulare al serbatoio.

Anche in questo caso, facendo attenzione a non introdurre bolle d'aria una volta raggiunto un flusso completamente sviluppato. Il video viene acquisito a tre fotogrammi al secondo e i dati vengono enumerati utilizzando il software Image J. Le cellule THP-1 aderenti sono definite come quelle che si spostano di non più di metà diametro cellulare in 10 secondi.

Qui mostriamo dati che illustrano l'adesione delle cellule THP-1 a monocap strato di cellule endoteliali stimolate con TNF-alfa e condizionate con uno sforzo di taglio parietale costante e elevato di 15 dyn/cm² oppure con uno sforzo di taglio oscillatorio di 0 ± 5 dyn/cm². I monocap strato condizionati con sforzo di taglio oscillatorio hanno mostrato un reclutamento delle cellule THP-1 superiore di tre volte rispetto ai monocap strato esposti a elevato sforzo di taglio. Oggi, illustriamo l'utilizzo di tecniche personalizzabili in vitro che possono essere combinate per fornire informazioni importanti sugli eventi infiammatori iniziali alla base dell'aterosclerosi. In particolare, quantifichiamo gli esiti associati alla disfunzione endoteliale e alle cellule esposte a stimoli infiammatori in condizioni idrodinamiche ben definite.

L'utilizzo del sistema VMM CS ci consente di esaminare meccanismi specifici alla base delle interazioni di adesione tra cellule endoteliali e leucociti. Questi dispositivi presentano inoltre il vantaggio di essere flessibili ed economici, e facilitano l'uso di materiali che potrebbero essere disponibili in quantità limitata, come componenti derivati dal siero di soggetti umani. I nostri studi che impiegano questi dispositivi hanno incluso indagini sull'infiammazione indotta da citochine, lipidi e rage nelle cellule endoteliali.

Abbiamo inoltre sviluppato saggi su chip per esaminare i meccanismi di adesione in diversi tipi di leucociti nonché nel sangue intero. In definitiva, prevediamo che questa tecnologia porterà a approcci ex vivo per la valutazione del rischio individuale di malattie cardiovascolari mediata dall'infiammazione.