On-Chip Fenotipizzazione Endothelial infiammatoria
21 luglio 2012
Camere di flusso Microfluidic incisi da fotolitografia e fabbricati da PDMS sono applicate per sondare gli esiti funzionali associati alla disfunzione CE e l'infiammazione. In un esperimento rappresentativo, la capacità di sforzo di taglio differenziale di modulare l'adesione cellulare monocitica di citochina attivato CE monostrati è dimostrata.
L'obiettivo di questo video è quello di dimostrare una tecnica lab on a chip per caratterizzare lo stato infiammatorio delle cellule endoteliali. Per iniziare, le cellule endoteliali aortiche umane vengono coltivate fino alla confluenza su un substrato di coltura tissutale e quindi inserite in un dispositivo di taglio della piastra di Conan. Le cellule vengono trattate con la citochina pro-infiammatoria, TNF alfa, e contemporaneamente esposte a condizioni di stress di taglio differenziale per quattro ore controllando con precisione la rotazione del cono sopra il substrato lo stress di taglio modula una risposta infiammatoria ben caratterizzata alla citochina.
Ciò include la sovraregolazione di molecole di adesione come VCA one e ICAM one. Il substrato viene trasferito in uno stadio di microscopio dove il dispositivo microfluidico A-P-D-M-S viene sigillato sottovuoto direttamente sul monostrato creando canali di flusso. Monocitiche attivate, le cellule THP 1 vengono fatte volare sopra l'hs precondizionato, dove si legano in proporzione al livello di adesione cellulare di espressione della molecola.
Lo stato infiammatorio dell'endotelio è determinato quantificando il numero totale di cellule THP 1 che sono fermamente arrestate. Ciao, mi chiamo lei D Diverse e sono Greg Foster. E io sono Keith Bailey.
Siamo nei laboratori dei professori, del pastore e di Simon nel Dipartimento di Ingegneria Biomedica dell'Università della California a Davis. Oggi descriveremo l'uso di un approccio basato su chip per esaminare quantitativamente la disfunzione endoteliale e l'infiammazione. Questi strumenti ci forniscono una piattaforma per condurre studi relativi alla sovrapposizione dello stress metabolico con fattori idrodinamici e alla regolazione del fenotipo infiammatorio endoteliale e della suscettibilità all'aterosclerosi.
Per questo motivo ci riferiamo ai nostri dispositivi come camere mimetiche vascolari, microfluidiche o vmmc. Questi dispositivi ci consentono di quantificare gli esiti infiammatori nelle cellule endoteliali e nei monociti in condizioni che imitano quelli nei vasi aterogeni. La VMMC facilita l'uso di piccole quantità di reagenti o materiali che possono essere in quantità limitata.
Possono anche essere costruiti in una serie di layout e geometrie personalizzabili, rendendoli molto adatti per una vasta gamma di applicazioni. Oggi dimostreremo un esperimento rappresentativo utilizzando il nostro approccio lab on a chip. I monostrati endoteliali umani saranno esposti all'attivazione delle citochine in condizioni di stress di taglio ben definite.
Dimostreremo l'uso della VMC per quantificare il reclutamento di cellule monocitiche umane nel monostrato in tempo reale come lettura funzionale dell'attivazione endoteliale utilizzando un tornio: substrati circolari da tre pollici vengono fresati da piastre di coltura tissutale da 100 millimetri. I substrati da tre pollici vengono lavati con acqua distillata, quindi sterilizzati immergendoli in etanolo al 70%. I substrati sterili vengono posti in piastre di Petri da 100 millimetri e lasciati asciugare.
Vengono quindi incubati con collagene di tipo uno a una concentrazione di 100 microgrammi per millilitro per un'ora a temperatura ambiente e lavati con PBS. Le cellule endoteliali aortiche umane o HA sono sospese a una concentrazione di 650.000 cellule per millilitro. Un millilitro di sospensione cellulare viene posto in goccioline su un substrato rivestito di collagene essiccato e distribuito in una sospensione uniforme.
I substrati seduti vengono quindi posti in un incubatore a 37 gradi al 5% di CO2 e possono attaccarsi alla superficie del substrato. Dopo un'ora nove millilitri di E GM a due crescite, viene aggiunto il terreno e le cellule vengono lasciate crescere in monostrati a circa il 90% di fluenza di Co I monostrati sono pronti per essere utilizzati per successivi esperimenti puri. Le camere microfluidiche vascolari mimetiche sono costruite versando lo stampo A-P-D-M-S su una forma master comprendente il canale desiderato. Geometria.
La base in silicone viene versata in una barca di plastica, seguita dall'agente indurente siliconico con un rapporto di 10 a uno in peso. Il gel PDMS viene quindi ben miscelato, facendo attenzione a non raschiare i lati della barca di rotta e quindi introducendo trucioli di plastica nella miscela. I master Photoresist vengono puliti con esano e preparati per modellare la VMMC.
La miscela PDMS viene quindi versata sulla forma master, quindi posta in una camera a vuoto. Nella camera. L'aria viene rimossa dalla miscela PDMS e sale in superficie dopo 15 minuti.
Lo stampo viene rimosso dalla camera e l'aria viene soffiata delicatamente sulla superficie PDMS per eliminare le bolle d'aria rimanenti dallo stampo. Lo stampo viene quindi coperto e posto in un forno a 37 gradi per un'ora dove la PMS viene lasciata indurire. Togliete il gel PDMS solidificato dal forno e praticate delle incisioni circolari intorno alla camera con un piccolo bisturi.
È fondamentale farlo gradualmente per evitare il contatto con il materiale fotoresist in quanto ciò danneggerebbe lo stampo master. Accisare la camera microfluidica dalle porte di ingresso e uscita del punzone dello stampo per ciascun canale utilizzando un ago di blocco dell'esca calibro 19. Inoltre, praticare dei fori per i tubi a vuoto lontano dai canali.
La preparazione per la VMMC è ora completa. Pipettare la citochina pro-infiammatoria TNF alfa in sei millilitri di terreno L 15 per ottenere una concentrazione finale di 0,5 nanogrammi per millilitro. Il terreno L 15 viene utilizzato qui come fluido di taglio grazie alla sua capacità tampone del pH in assenza del 5% di CO2.
Il terreno viene quindi aspirato in una siringa sterile da 10 millilitri, che viene utilizzata per caricare il dispositivo di taglio. Il monostrato Confluent viene quindi trasferito al dispositivo di taglio delle cellule, che è stato sterilizzato con etanolo livellato ed è stata impostata l'altezza della fessura del cono. Il substrato viene rimosso dalla piastra di Petri e posizionato sul blocchetto di riferimento di vetro centrato e inserito con cura nella parte inferiore della camera di alloggiamento, in modo che il cono si trovi direttamente sopra le celle.
Il substrato è fissato serrando uniformemente le viti in acciaio inossidabile attorno al blocco di riscontro. Il mezzo di taglio viene quindi caricato nella camera, facendo attenzione a non introdurre bolle d'aria. Successivamente, viene utilizzato un computer per inserire il programma di sollecitazione di taglio desiderato e viene acceso il micro motore separato.
Qui utilizziamo un taglio oscillatorio di zero più o meno cinque dine per centimetro quadrato. Dopo quattro ore, il programma di tosatura viene interrotto. Il blocco di riscontro viene rimosso e il substrato viene riposizionato con cura nella piastra di Petri.
Le cellule sono ora pronte per il saggio di adesione dei monociti. Subito dopo la tranciatura, i monostrati di HA vengono trasportati alla stazione di microscopio per l'assemblaggio della VMMC. La VMMC è collegata al tubo di aspirazione e immersa in acqua deionizzata per rimuovere eventuali bolle d'aria intrappolate all'interno dei canali.
Con la valvola del vuoto inizialmente spenta, la camera viene premuta con cautela sopra il monostrato e la valvola del vuoto viene attivata. È fondamentale assicurarsi che nessuna bolla d'aria sia rimasta intrappolata all'interno dei canali della camera. Ora, 80 microlitri di HBSS con calcio e magnesio vengono pipettati in un serbatoio ricavato dal taglio della punta di un'esca calibro 19 Il fluido dell'ago di blocco viene spinto fuori dalla punta premendo con decisione la parte superiore del serbatoio, che viene quindi inserito nella porta di ingresso del VMMC.
L'intero gruppo viene posizionato sul tavolino del microscopio e la telecamera del microscopio e il monitor video vengono accesi. Una siringa di vetro da 10 millilitri viene caricata sulla pompa a siringa. Successivamente, il tubo della siringa viene collegato alla porta di uscita della VMMC.
La portata è impostata per indurre uno stress puro di un pasto per centimetro quadrato all'interno del canale, quindi eseguire in modalità di ricarica in modo tale che la siringa estragga il fluido dal serbatoio attraverso il canale. Le cellule P 1 stimolate con SDF one sono sospese a una concentrazione di 2 milioni di cellule per millilitro. Entro due minuti dall'attivazione del flusso, 50 microlitri di sospensione cellulare vengono aggiunti al serbatoio.
Ancora una volta, facendo attenzione a non introdurre bolle d'aria quando il flusso si sviluppa completamente. Il video viene catturato a tre fotogrammi al secondo e i dati vengono enumerati utilizzando il software Image J. Aderente. Le celle THP 1 sono definite come il movimento di non più di un diametro di mezza cella in 10 secondi.
Qui dimostriamo i dati che descrivono l'adesione di THP uno a monostrati di ha stimolati con TNF alfa e condizionati sotto uno sforzo di taglio costante di 15 dines per centimetro quadrato o uno stress di taglio oscillatorio di zero più o meno cinque dines per centimetro quadrato, i monostrati di ha condizionati con stress di taglio oscillatorio hanno mostrato un reclutamento di una cella TP tre volte maggiore rispetto ai monostrati che hanno subito un elevato stress di taglio. Oggi dimostriamo l'uso di tecniche in vitro personalizzabili che possono essere combinate per fornire importanti informazioni sugli eventi infiammatori precoci alla base dell'aterosclerosi. In particolare, quantifichiamo gli esiti associati alla disfunzione endoteliale e alle cellule esposte a stimoli infiammatori in condizioni idrodinamiche ben definite.
L'uso di VMM CS ci permette di esaminare meccanismi specifici alla base delle interazioni di adesione endoteliale e leucocitaria. Questi dispositivi hanno anche il vantaggio di essere flessibili ed economici e facilitano l'uso di materiali che possono essere limitati nella fornitura, come i componenti derivati dal siero da soggetti umani. I nostri studi che applicano questi dispositivi hanno incluso indagini sull'infiammazione indotta da citochine, lipidi e rabbia nelle cellule endoteliali.
Abbiamo anche sviluppato saggi su chip che esaminano i meccanismi di adesione in diversi tipi di leucociti e nel sangue intero. In definitiva, immaginiamo che questa tecnologia porterà ad approcci ex vivo per valutare il rischio di un individuo di malattia cardiovascolare mediata da infiammazione
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Panoramica
Questo articolo dimostra una tecnica di laboratorio-su-chip per caratterizzare lo stato infiammatorio delle cellule endoteliali (CE) utilizzando camere di flusso microfluidiche. Lo studio investiga come lo stress da taglio differenziale influenzi l'adesione delle cellule monocitarie ai monostrati di CE attivate da citochine.
Componenti chiave dello studio
Area della scienza
- Neuroscienza
- Biologia cellulare
- Microfluidica
Sfondo
- Le cellule endoteliali svolgono un ruolo cruciale nell'infiammazione e nella salute vascolare.
- Lo stress da taglio è noto per influenzare le risposte cellulari nel sistema vascolare.
- Comprendere la disfunzione delle CE può fornire informazioni su varie malattie cardiovascolari.
- I dispositivi microfluidici permettono un controllo preciso delle condizioni sperimentali.
Obiettivo dello studio
- Caratterizzare la risposta infiammatoria delle cellule endoteliali aortiche umane.
- Esaminare gli effetti dello stress da taglio sull'adesione delle cellule monocitarie.
- Utilizzare un approccio microfluidico per un controllo sperimentale migliorato.
Metodi utilizzati
- Le cellule endoteliali aortiche umane sono state coltivate fino alla confluenza.
- Le cellule sono state trattate con TNF alfa per indurre l'infiammazione.
- È stato applicato uno stress da taglio differenziale utilizzando un dispositivo di taglio cono-piastra.
- Sono state introdotte cellule THP-1 monocitarie per valutare i livelli di adesione.
Principali risultati
- Lo stress da taglio ha modulato l'espressione di molecole di adesione come VCAM-1 e ICAM-1.
- L'adesione delle cellule monocitarie era proporzionale al livello di espressione delle molecole di adesione.
- Il setup microfluidico ha permesso l'osservazione in tempo reale delle interazioni cellulari.
- I risultati evidenziano l'interazione tra forze meccaniche e risposte infiammatorie.
Conclusioni
- Lo studio fornisce informazioni sul ruolo dello stress da taglio nell'infiammazione delle CE.
- I dispositivi microfluidici sono strumenti efficaci per studiare le dinamiche di adesione cellulare.
- I risultati potrebbero avere implicazioni per la comprensione dei meccanismi delle malattie cardiovascolari.
Domande frequenti
Executive Industry Relevance
This lab-on-a-chip approach enables quantitative assessment of endothelial inflammatory phenotypes under controlled hemodynamic conditions, addressing a critical gap in early cardiovascular risk stratification. By linking metabolic perturbations to leukocyte adhesion dynamics in a reproducible in vitro system, the method supports mechanistic de-risking of atherogenic pathways and informs target validation strategies in cardiovascular drug discovery. The platform’s ability to model physiologically relevant shear stress and cytokine interactions provides predictive value for evaluating therapeutic candidates targeting endothelial dysfunction.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of hemodynamic regulation of inflammatory pathways in human endothelial cells under defined shear stress conditions.
- Operational Value: Provides a quantitative readout of monocyte adhesion as a functional biomarker of endothelial activation state.
- Predictive Value: Supports target validation by linking shear-modulated adhesion molecule expression (e.g., VCAM-1, ICAM-1) to leukocyte recruitment under inflammatory stimuli.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Establishes a standardized microfluidic assay for measuring real-time leukocyte-endothelial interactions under physiological flow.
- Operational Value: Permits high-resolution imaging and automated quantification of adherent cells using image analysis tools.
- Assay Readiness: Delivers reproducible, shear-dependent inflammatory phenotypes suitable for compound screening and pathway modulation studies.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Models early atherogenic events by coupling metabolic risk factors (e.g., TNF-α activation) with hemodynamic shear profiles relevant to arterial geometries.
- Translational Continuity: Bridges in vitro findings to in vivo atherosclerotic susceptibility by quantifying functional endothelial responses under clinically relevant flow conditions.
- Risk-Adjusted Decision-Making: Enables prioritization of targets based on their modulation of shear-sensitive inflammatory phenotypes in human cells.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the cardiovascular discovery continuum, supporting hypothesis testing in early target validation, enabling assay development for leukocyte recruitment, and providing quantitative analytics for mechanistic de-risking before preclinical commitment.
- Discovery Biology: Facilitates mechanistic interrogation of how hemodynamic forces modulate cytokine-induced endothelial activation and leukocyte adhesion.
- Screening: Delivers a shear-dependent, quantitative assay for evaluating compound effects on endothelial inflammatory phenotypes under controlled flow.
- Analytics: Generates real-time, image-based quantification of firmly arrested monocytes as a functional readout of endothelial activation state.
- Translational Research: Connects endothelial dysfunction metrics to atherosclerotic risk by modeling physiologic shear stress and inflammatory priming in human aortic endothelial cells.
- Enterprise Reuse: Offers a reconfigurable microfluidic platform adaptable to various leukocyte types, stimuli, and shear profiles across discovery projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity in endothelial inflammation by decoupling hemodynamic and biochemical variables in a controlled system.
- Operational Value: Ensures assay reproducibility through standardized microfluidic fabrication and precise shear stress application.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing early, human-relevant data on target modulation of endothelial-leukocyte interactions under flow.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted advancement by identifying candidates that attenuate shear-amplified inflammatory phenotypes in pathophysiologically relevant models.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microfluidic design, cell culture under shear, and leukocyte isolation or handling.
- Depends on access to soft lithography equipment, vacuum sealing systems, and inverted microscopes with environmental control.
- Necessitates cross-team standardization of shear protocols, cytokine dosing, and cell preparation for reproducible results across laboratories.
- Involves adaptation considerations when extending to different endothelial sources (e.g., coronary, microvascular) or leukocyte subtypes beyond THP-1.
- Practical limitations include device assembly complexity and the need for bubble-free microfluidic channel formation to ensure consistent shear profiles.
