Elaborazione Postproduzione di fibre elettrofilate per l'ingegneria tissutale

L'obiettivo di questa procedura è produrre scaffold biodegradabili elettrofilati che possano essere sterilizzati e realizzati con uno spessore sufficiente e una resistenza meccanica adeguata per l'ingegneria tissutale clinica. Ciò si ottiene innanzitutto elettrofilando polimeri biodegradabili in architetture primarie, disposte in modo casuale oppure allineate e orientate, o stratificate in successione. Il secondo passaggio consiste nell'applicare modifiche post-filatura agli scaffold unendo diversi strati e procedendo alla loro sterilizzazione.

Successivamente, le cellule vengono introdotte negli scaffold e la loro performance durante e dopo la coltura viene valutata. L'ultimo passaggio consiste nell'esporre le cellule a un regime di esercizio, al fine di simulare lo stress fisiologico che le cellule incontreranno nell'organismo, preparandole così per il trapianto. Infine, è possibile valutare la risposta delle cellule all'esercizio misurando la matrice extracellulare da loro prodotta in risposta alla tensione dinamica.

Questa tecnica è versatile e flessibile, consentendo la realizzazione di una vasta gamma di impalcature con proprietà specificamente modificate per l'applicazione richiesta. Ad esempio, le impalcature possono essere progettate per trattare condizioni difficili in cui è necessario un ripristino dei tessuti, come la sostituzione di estese perdite di cute in pazienti gravemente ustionati o la riparazione della mucosa orale danneggiata a seguito di cancro o trauma. Sebbene questo video mostri la produzione prolungata di cellule come indicatore di stress dinamico, si potrebbero prendere in considerazione anche diverse proteine della matrice extracellulare e valutare molti altri aspetti della biologia cellulare utilizzando cellule sottoposte a esercizio o non sottoposte a esercizio.

Generalmente, le persone nuove rispetto a questo metodo incontreranno difficoltà nel produrre scaffold riproducibili poiché il processo di elettrofilatura è influenzato da molte variabili. La dimostrazione visiva delle operazioni successive all'elettrofilatura degli scaffold è importante. Tuttavia, viene raramente discussa.

È necessaria una conoscenza del processo affinché la tecnica possa essere applicata con successo in ambito clinico. Iniziare rivestendo un collettore a mandrino rotante con della carta d'alluminio, con il lato lucido rivolto verso l'esterno. Quindi posizionare quattro siringhe da cinque millilitri cariche ciascuna con cinque millilitri del polimero di interesse.

Qui l'acido polilattico viene utilizzato in una pompa per siringa. Impostare la portata a 40 microlitri al minuto per siringa e la distanza operativa a 17 centimetri tra la punta dell'ago e il mandrino. Successivamente, caricare gli aghi delle siringhe a +17.000 volt ed eseguire l'elettrofilatura alla distanza appropriata sul mandrino rivestito di foglio di alluminio per ottenere fibre allineate.

Ruotare il mandrino a 1000 giri al minuto per ottenere fibre casuali. Ruotare il mandrino a 200 giri al minuto. I supporti elettrofilati possono essere conservati sulla carta d'alluminio in un contenitore sigillato a quattro gradi Celsius in presenza di un disidratante per almeno quattro mesi dopo l'elettrofilatura del secondo polimero PHBV Lotus.

Di nuovo qui. Il PLA ha mostrato la formazione di strati sopra il PHBV, utilizzando poi i parametri e le condizioni normali per la spinatura di quel polimero. Ancora una volta, questo processo additivo consente di ottenere un doppio strato di impalcatura, producendo un bilayer per generare un'impalcatura multistrato mediante riscaldamento.

Posizionare quattro fogli di PLGA uno sopra l'altro in posizione inginocchiata e quindi riscaldare i fogli a 60 gradi Celsius per tre ore al fine di produrre un impalcatura multistrato mediante ingegnocchiamento a vapore. Versare 10 millilitri di metano DILU o DCM in un contenitore di dimensioni adeguate. Successivamente, posizionare quattro fogli di PLGA uno sopra l'altro e sospenderli a due centimetri sopra il DCM.

Infine, sigillare il contenitore per un'ora a temperatura ambiente per ottenere la produzione asettica di scaffold mediante elettrofilatura, sciogliere i polimeri di grado medico sterilizzati mediante incubazione in DCM e quindi sottoporre a elettrofilatura la soluzione polimerica su un foglio sterile avvolto attorno a un mandrino sterilizzato. Successivamente, in un'appaio laminare sterile, incubare lo scaffold in un mezzo di crescita privo di antibiotici per il periodo appropriato al fine di verificare la sterilità dei campioni secondo la disinfezione sperimentale con etanolo.

Posizionare gli scaffold in una soluzione di etanolo e acqua distillata per 15 minuti. Per la sterilizzazione con acido peracetico. Immergere gli scaffold in una soluzione di acido peracetico e soluzione salina tamponata al fosfato (PBS) per tre ore.

A temperatura ambiente per la sterilizzazione gamma, irradiare gli scaffold con una dose di tre chilo gray utilizzando prima una sorgente al cesio, quindi tagliare gli scaffold in rettangoli di cinque millimetri per 20 millimetri. Successivamente, utilizzare un micrometro per misurare lo spessore dello scaffold. Poi posizionare i rettangoli in uno strumento Bose Electro Force 3,100.

Calcolare il modulo di Young e l'elasticità a partire dal carico in funzione dello spostamento come curva sforzo-deformazione tracciata dallo strumento. Iniziare etichettando le cellule con un colorante fluorescente prima di seminare le cellule. Quindi incubare le fibroblasti dermiche umane confluenti in tripsina ed EDTA per cinque minuti a 37 gradi Celsius.

Quindi, centrifugare le cellule staccate per 10 minuti a 150 ×g a temperatura ambiente e risospendere il pellet in cinque millilitri di DMEM. Dopo il conteggio, aggiustare la concentrazione cellulare per la semina e seminare le cellule sui scaffold. A questo punto, acquisire un'immagine della superficie degli scaffold marcati mediante microscopio fluorescente per analizzare la penetrazione delle cellule più in profondità negli scaffold; a tale scopo, può essere utilizzato un microscopio confocale a multiphoton.

Questo può garantire una penetrazione di circa 200 micron nella maggior parte degli scaffold, con o senza cellule. Dopo la coltura degli scaffold seminati, fissare i campioni in un millilitro di formaldeide in PBS per 20 minuti a 37 gradi Celsius. Dopo la fissazione, lavare i campioni tre volte con un millilitro di PBS, quindi incubare ciascun campione in 200 microlitri di anticorpi primari per l'elastina per 30 minuti a 37 gradi Celsius.

Lavare i campioni altre tre volte in un millilitro di PBS, quindi incubare i campioni in una soluzione di anticorpo secondario in PBS contenente DPI per 30 minuti. Infine, dopo aver lavato i campioni un'ultima volta in PBS, acquisire le immagini dei campioni al microscopio a fluorescenza utilizzando un'illuminazione a 365 nanometri e una riemissione a 460 nanometri per il DPI e un'illuminazione a 480 nanometri e una riemissione a 533 nanometri per l'anticorpo secondario. Prima di tutto, sterilizzare in autoclave l'apparato di regolazione del flusso e il palloncino, quindi, in una stanza pulita, rimuovere l'apparato da imballaggio sotto cappa a flusso laminare in posizione per l'elettrofilatura.

Successivamente, collegare una siringa da 50 millilitri riempita con PBS al tubo laterale di un rubinetto a tre vie e gonfiare il palloncino con il PBS fino a quando non diventa turgido. A questo punto, elettrofilare il polimero desiderato sul palloncino. Utilizzando le normali condizioni di filatura e una distanza operativa di 10 centimetri, le fibre umide sono sufficientemente appiccicose da aderire alla superficie del palloncino senza staccarsi successivamente.

Dopo che l'impalcatura si è asciugata, inserire il palloncino in un contenitore sterile e quindi trasportare il contenitore in una cappa a flusso laminare adatta alla coltura cellulare. Coltivare le cellule su un'impalcatura posta su un palloncino disteso, al fine di sottoporre le cellule a un condizionamento biomeccanico, è la parte più delicata di questa procedura. È essenziale applicare più volte la soluzione cellulare sul palloncino per fissare il maggior numero possibile di cellule sull'impalcatura.

Abbiamo riscontrato che questa procedura richiede circa 20 minuti. In cappa, rimuovere il palloncino dal contenitore e appoggiarlo su una superficie sterile, come la piastra di Petri utilizzata in questo caso, quindi pipettare la sospensione cellulare sul palloncino rivestito ogni 20 secondi per un periodo di 20 minuti, cercando di distribuire le cellule in modo uniforme sulla superficie del palloncino. Successivamente, riposizionare il palloncino all'interno del contenitore di coltura e aggiungere il mezzo pre-riscaldato appropriato per il tipo cellulare.

Infine, collegare l'apparecchio di gonfiaggio a una pompa per siringa ed eseguire il gonfiaggio e lo sgonfiaggio del palloncino secondo necessità per ottenere una distensione biaxiale. Una pompa per siringa controllata da computer può essere utilizzata per ottenere un regime di distensione più complesso. L'elettrofilatura può essere impiegata per creare impalcature con architetture ordinate e casuali.

Questo processo è ripetibile e le fibre sono uniformi. Ad esempio, fibre perpendicolari possono essere create mediante elettrofilatura di un insieme di fibre allineate su un foglio di alluminio ruotando il foglio di 90 gradi, quindi effettuando immediatamente un secondo ciclo di elettrofilatura per depositare un secondo strato di fibre allineate sopra le prime. Molti tipi di polimeri possono essere elettrofilati con caratteristiche che possono variare notevolmente, come mostrato qui per P-L-A-P-H-B-V-P-C-L e PLGA; si noti che P-L-A-P-C-L e PLGA sono tutti scaffold microfibrillari uniformi.

Il PHBV viene filato come una collana di perle con nanofibre che collegano perle di dimensioni comprese tra cinque e venti micron. Qui, i supporti sono stati inizialmente filati utilizzando PHBV, quindi le siringhe sono state riempite con PLA e filate sopra i supporti in PHBV. Queste immagini mostrano singoli strati rappresentativi di PHBV e PLA.

Questa immagine illustra come potrebbe apparire una sezione trasversale di un bilayer A-P-H-B-V-P-L-A con un par necklace nano-fibroso denso, uno strato di PHBV e uno strato di PLA micro-fibroso più aperto; tutti e tre i tipi di scaffold favoriscono l'adesione e la proliferazione cellulare. Se sono richiesti scaffold più spessi, si possono utilizzare il vapore e il riscaldamento per fondere insieme strati di scaffold, come dimostrato nelle prossime immagini. Gli strati di scaffold fusi non si delaminano e può risultare molto difficile individuare il giunto tra gli strati.

Questa immagine mostra una sezione di un impalcatura in PLA vaporizzato e piegato, dove impalcature fibrose iniziali di circa 150 micron sono state sovrapposte. Successivamente, è stato utilizzato il vapore di DCM per ottenere impalcature molto più spesse, fino a 500 micron. Questa immagine mostra la stessa sezione del bilayer vaporizzato a un ingrandimento di circa due volte rispetto al precedente. In questa immagine si può osservare come l'impalcatura sia costituita da strati di fibre molto più spesse alternate a strati di fibre più sottili, create riscaldando e piegando insieme strati di fibre sottili e spesse per produrre impalcature con proprietà meccaniche complesse.

Anche in questo caso, l'immagine mostra lo stesso scaffold a ginocchio riscaldato ingrandito quattro volte. La precedente magnificazione degli strati a membrane può essere realizzata con diversi tipi cellulari, ognuno coltivato su una membrana separata senza mescolarsi, come dimostrato in queste immagini di fibroblasti dermici umani colorati con due diversi coloranti fluorescenti per il tracciamento cellulare. La prima immagine mostra fibroblasti su elettrofilato di PLA.

Le cellule sono state fissate e colorate; qui i fibroblasti colorati con dappy sono stati seminati su elettrotessuto di PHBV. In questo esperimento, i fibroblasti sono stati precolorati con il colorante vitale Cell Tracker Green. Si noti che le cellule si trovano sul lato PLA del bistrato.

Questa immagine mostra una sezione rappresentativa di un bilayer con fibroblasti colorati di rosso sulla superficie inferiore di PHBV e fibroblasti colorati di verde sulla superficie superiore di PLA. In questa immagine, i fibroblasti sono stati precolorati con il tracciante cellulare rosso durante la crescita sulla superficie di A-P-H-B-V. Pertanto, l'uso di coloranti fluorescenti vitali fornisce una metodologia pratica per osservare la distribuzione delle cellule su un impalcatura mentre le cellule sono ancora in fase di crescita.

Il metodo di sterilizzazione incide sullo scaffold e sulla successiva coltura cellulare. Questo grafico a linee illustra gli effetti dell'acido paracetico, dell'irradiazione gamma e dell'etanolo sulla resistenza alla trazione e sul modulo di Young di uno scaffold in PLG.

Ciascuno dei metodi di sterilizzazione modifica la resistenza alla trazione e l'elasticità delle strutture portanti. La coltura cellulare su queste strutture riduce ulteriormente la tensione di rottura, ma aumenta l'elasticità. Questo grafico a barre illustra l'effetto del metodo di sterilizzazione sul diametro delle fibre di una singola struttura portante.

L'irradiazione gamma non ha un effetto significativo sul diametro delle fibre, mentre l'acido paracetico e l'etanolo riducono il diametro delle fibre di circa il 50%. Pertanto, il modo migliore per ottenere scaffold sterili è produrli in condizioni asettiche. Questa ultima serie di immagini dimostra che le cellule rimangono vitali durante la distensione dinamica e producono anche quantità aumentate di elastina. Si noti lo sviluppo del colore blu scuro prodotto dalle cellule in crescita, rilevato mediante un indicatore metabolico, MTT.

Qui, le cellule in blu coltivate su un palloncino e sottoposte a distensione biaxiale hanno sviluppato fibre di elastina, come indicato dalla colorazione verde. Questo risultato contrasta nettamente con l'assenza di elastina osservata quando le stesse cellule vengono mantenute in condizioni statiche su un'identica impalcatura a palloncino. Seguendo questa procedura, è possibile eseguire altri metodi, come la coltura statica e il flusso di fluido sulle cellule all'interno delle impalcature, per studiare come le cellule rispondono a diverse condizioni di coltura.

Lo sviluppo della coltura di cellule su un'impalcatura posta su un palloncino, che può essere disteso, si è rivelato molto utile perché ha aperto la strada ai ricercatori nel campo dell'ingegneria tissutale per esplorare l'effetto del condizionamento dinamico delle cellule all'interno di costrutti ingegnerizzati. Non dimenticare che lavorare con alimentatori ad alta tensione, solventi, laser e cellule umane può essere pericoloso, e pertanto è sempre necessario seguire un'adeguata formazione e adottare le opportune precauzioni durante l'esecuzione di questa procedura.