Ingegneria batteri aderenti mediante la creazione di un unico sintetico curli Operon

L'obiettivo generale del seguente esperimento è quello di conferire proprietà aderenti ai batteri al fine di facilitare la loro separazione dai mezzi liquidi. Ciò si ottiene progettando prima un ricciolo sintetico per aggirare la complessa regolazione genetica e consentire una produzione facile e massiccia di polimeri appiccicosi. In una seconda fase, i batteri aderenti vengono visualizzati e quantificati su polistirene, il che consente una rapida stima dell'efficienza del dispositivo sintetico.

Successivamente, i batteri aderenti vengono visualizzati su vetro mediante microscopia confocale. Al fine di osservare direttamente il biofilm e di ottenere informazioni sulla sua struttura, si ottengono risultati che mostrano un aumento significativo dell'aderenza nel ceppo che ospita il dispositivo sintetico sulla base sia dell'aderenza, della misurazione percentuale e delle osservazioni microscopiche. Il vantaggio principale dell'approccio della biologia sintetica rispetto ai metodi esistenti come la clonazione convenzionale, è che il costrutto che ospita solo i geni assolutamente chiari richiesti con segnali appropriati può essere ottenuto molto rapidamente.

Questo metodo può aiutare a rispondere a una domanda chiave nel campo del biorisanamento, come affrontare la sfida di rimuovere i batteri carichi di metalli dai rifiuti radioattivi. In generale, gli individui che non conoscono questo metodo hanno difficoltà perché sono richieste conoscenze di base sui segnali di regolazione genetica e sulla gestione dei database. La dimostrazione visiva si concentrerà sulla quantificazione e la visualizzazione di biofilm perché questi due passaggi sono molto difficili da apprendere a causa della fragilità dei bioframe.

Il primo passo per progettare la carogna sintetica è determinare l'organizzazione genetica dei geni ricci e localizzare i loro segnali endogeni, trascrizionali e traduzionali. Ciò si ottiene utilizzando database specializzati come REON DB o eco gene. Il passo successivo è quello di selezionare i cinque geni assolutamente necessari per la sintesi dei ricci, CSGB e CSGA e codificare i monomeri di fibra e C-S-G-E-C-S-G-F e CSGG codificare il complesso di secrezione curling, estrarre le sequenze scelte dal database in formato più veloce gestione dei dati e in silico la pre-analisi verrà eseguita con il software di gestione dei cloni poiché il cluster C-S-G-G-F-E è antisenso nel genoma di e coli.

Questa sequenza deve essere convertita nella sua controparte in complemento inverso. Usa gli strumenti del gestore dei cloni, le operazioni, il processo della molecola, l'inversione della molecola, incolla la sequenza C-S-G-E-F-G dietro C-S-G-B-A utilizzando la funzione ligate. Quindi, aggiungere il promotore PRCN appropriato davanti alla sequenza C-S-G-B-A-E-F-G iCal.

Il locus RCN codifica per una pompa FLX RCNA, responsabile della detossificazione del nichel e del cobalto, e per il suo affine, il regolatore di metalli RCNR. In assenza di cobalto o nichel, il repressore RCNR si lega alla scatola RCNR sul DNA e impedisce la completa attivazione della trascrizione dei geni a valle. Se la concentrazione intracellulare di cobalto o nichel aumenta, il legame del cobalto o del nichel alla proteina RCNR impedisce la fissazione del repressore al promotore e l'attività trascrizionale di P-R-C-N-A aumenta ponendo i cinque geni ricci selezionati sotto il controllo del promotore.

Si prevede che i PRCN ricci siano sovraprodotti in presenza di cobalto e nichel. Successivamente ottimizzare i segnali trascrizionali aggiungendo un sito di legame ribosomiale perfetto o RBS davanti al primo A TG del CS gba, sequenza di DNA e un secondo RBS perfetto davanti alla sequenza C-S-G-E-F-G. Per adattarsi agli standard I GM, il dispositivo deve essere affiancato da un prefisso standard bio brick contenente i siti di restrizione per ECO R one e X-bar one e un suffisso contenente i siti di restrizione per SPE one e PST one per facilitare l'ulteriore assemblaggio.

La parte in mattoncino biologico non può contenere alcun sito di riconoscimento ECO R, PST e SPE e X-bar R. Quindi, questi siti sono stati eliminati da cambiamenti di mutazione silente nell'analisi della restrizione del silico del dispositivo ha rivelato un PST, un sito nella sequenza CSGA, un PST, un sito nella sequenza RCNR e uno ECO R nel gene CSGE. Questi siti sono stati modificati da mutazioni silenti.

Una volta completata la progettazione dell'operazione sintetica, eseguire una simulazione di traduzione utilizzando il software di gestione dei cloni. Utilizzare il programma di allineamento della sequenza blast per verificare la perfetta omologia tra le proteine ricci di tipo selvatico e le proteine codificate dal sintetico per iniziare questa procedura per ogni pozzetto di una piastra di polistirene a 24 pozzetti con due millilitri di M 63, terreno minimo con 0,2% di glucosio inoculato ogni pozzetto con 10-sei cellule di una coltura batterica notturna. Far crescere i batteri a 30 gradi Celsius per 18-48 ore senza agitare ogni colonna della piastra a 24 pozzetti rappresenta una modalità.

La giusta quantità di cobalto e antibiotico viene aggiunta quando necessario. Le prime tre file vengono utilizzate per quantificare i batteri aderenti all'A facendo la media delle tre ripetizioni. L'ultima fila rimasta viene utilizzata per visualizzare il biofilm mediante colorazione con cristallovioletto dopo 18-48 ore, recuperare il supinato contenente le cellule planctoniche da ciascun pozzetto dalle prime tre file della piastra a 24 pozzetti e trasferire il supinato in una provetta per emolisi.

Sciacquare accuratamente ogni pozzetto con un millilitro di terreno M 63 e tirare il lavaggio nel tubo di emolisi con la supinata iniziale. Questa piscina è indicata come celle di nuoto denominate S.Il fondo dei pozzetti nella micropiastra è coperto da celle di aderenza. Per recuperare il biofilm, aggiungere un millilitro di M 63 in ciascuno.

Raschiare bene con la punta della pipetta, quindi pipettare su e giù e trasferire la frazione di biofilm in una nuova provetta per emolisi. Agitare il tubo per 15 secondi. Raccogliere la frazione di biofilm in provette per emolisi.

Questo pool rappresenta le cellule attaccate alla superficie denominate B che trasferiscono 200 microlitri di frazione di supinato e biofilm dalle provette per emolisi a una piastra a 96 pozzetti. Stimare il numero di batteri attaccati alla superficie e che nuotano dalla densità ottica a 600 nanometri. La percentuale di aderenza per ciascuna modalità è calcolata utilizzando la formula B per 100 diviso per tre volte S più B.To visualizzare il biofilm solo per l'ultima riga dei 24, la piastra dei pozzetti scarta le cellule di plancton da quei pozzetti.

Aggiungere un millilitro di M 63 a ciascun pozzetto per risciacquare il biofilm che si è sviluppato sul fondo della piastra. Asciugare la piastra scoperta per un'ora a 80 gradi Celsius dopo un'ora, aggiungere 100 microlitri di cristallovioletto al 20% per due a ciascun pozzetto seguito da ampi lavaggi con acqua. Per questo protocollo è necessario uno chassis fluorescente.

Un ospite adatto per il plasmide che porta il riccio sintetico è il ceppo di e coli SCC uno, che esprime costitutivamente la proteina fluorescente verde senza alcuna differenza osservabile dal ceppo genitore MG 1 16 55. Trasformare il ceppo ospite con un plasmide puck 57 recante il curli sintetico per ottenere il ceppo S 23. Trasformare il ceppo ospite con un disco plasmidico di controllo 18 per ottenere il ceppo di controllo.

S 24 cresce durante la notte in pre-colture dei ceppi S 23 e S 24 a 30 gradi Celsius. Nel terreno M 63 integrato con glucosio e ampicillina il giorno successivo, aggiungere 20 millilitri di terreno M 63 a una piastra di Petri e quindi inoculare 15 millilitri di M 63 in piastre di Petri con 100 microlitri di pre-colture. Aggiungi la concentrazione appropriata di cobalto e non dimenticare il controllo negativo senza cobalto.

Introdurre tre vetrini di vetro rettangolari in ogni capsula di Petri. Incubare le piastre per una notte a 30 gradi Celsius senza agitare. I batteri possono essere visualizzati direttamente sotto il microscopio a fluorescenza nei giorni successivi.

È importante evitare l'essiccazione del campione, quindi i passaggi successivi devono essere eseguiti con attenzione ma rapidamente. Rimuovere ogni vetrino coprioggetto dalle piastre di Petri e scolarlo accuratamente. Pulire accuratamente la parte inferiore del viso con un piccolo batuffolo di cotone imbevuto di etanolo al 70% per rimuovere tutti i residui batterici per l'osservazione confocale.

Depositare il vetrino su un vetrino con la faccia superiore coperta dal biofilm posizionato a faccia in su. Il biofilm viene quindi coperto con un vetrino coprioggetto più grande, che viene fissato al vetro. Scivolo con vernice.

Invertire la configurazione in modo che il biofilm si trovi ora sulla faccia inferiore. In questo esperimento, posizionare la configurazione sotto il microscopio laser confocale. All'interno della piattaforma micro CT viene utilizzato un microscopio laser metaconfocale Zeiss LSM five 10.

Selezionare l'obiettivo a immersione in olio 40 volte. Utilizzare le seguenti impostazioni, eccitare la GFP a 4 88 nanometri e raccogliere la fluorescenza batterica nell'intervallo da 500 a 600 nanometri. Utilizzare l'obiettivo a immersione in olio 40 volte per acquisire le immagini.

Nella modalità confocale a scansione laser. Scansiona le strutture tridimensionali complessive dei biofilm dalla superficie solida all'interfaccia con il terreno di coltura. Utilizzando un passo di un micron.

Eseguire proiezioni tridimensionali con un software maus, determinare lo spessore del biofilm mediante l'analisi del valore medio di C lungo sezioni longitudinali statistiche. Quantificazione del biofilm, i volumi biologici possono essere estratti da pile Z confocali. Le capacità di aderenza dell'E coli ingegnerizzato per produrre in eccesso il riccio in risposta al metallo possono essere valutate con metodi semplici.

Ad esempio, la colorazione cristallovioletta su 24 piastre Irene ben lucidate consente una rapida visualizzazione della formazione di biofilm sul fondo di ciascun pozzetto, come dimostrato dalla differenza nell'intensità del colore viola. Sembra che il ceppo wild type sia meno aderente rispetto al ceppo ingegnerizzato. Un metodo quantitativo consiste nel misurare le percentuali di aderenza sul polistirene di tipo selvatico e sui ceppi ingegnerizzati con varie concentrazioni di cobalto.

I risultati presentati in questo grafico rivelano che la percentuale di aderenza del ceppo ingegnerizzato è 1,5 volte superiore a quella del ceppo wild type in assenza di cobalto. Inoltre, è stato osservato un significativo rafforzamento dell'aderenza in presenza di concentrazioni crescenti di cobalto in terreni con concentrazioni di cobalto di 25 micromolari o 50 micromolari percentuali di aderenza, le cellule ingegnerizzate raggiungono rispettivamente il 30% e il 40%. Le capacità di aderenza possono anche essere confrontate al microscopio con batteri marcati GFP cresciuti su vetrini, le osservazioni al microscopio a epifluorescenza di batteri verdi su sfondo nero rivelano che il ceppo ingegnerizzato forma un biofilm, mentre il ceppo selvatico trippe forma solo micro colonie indicate dalle frecce.

L'analisi al microscopio confocale fornisce una visione d'insieme della struttura tridimensionale del biofilm. Le ricostruzioni della vista dall'alto sono mostrate nei pannelli A e le ricostruzioni della vista laterale sono mostrate nei pannelli B. I risultati confermano che il ceppo ingegnerizzato è più aderente e forma un biofilm più denso e più spesso rispetto al tipo selvatico. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricontrollare la progettazione dell'operazione, ad esempio per esplorare il potenziale di biomediazione di e coli modificati o occupanti nel contesto delle acque reflue radioattive.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come progettare un open sintetico utilizzando il software di gestione dei cloni e come quantificare rapidamente l'emissione di ceppi batterici. Non dimenticare che lavorare con geni sintetici e organismi geneticamente modificati può essere estremamente pericoloso. Devono essere sottoposti a norme vigenti e durante l'esecuzione di questa procedura devono essere sempre prese precauzioni come l'autoclavaggio dei batteri trasformati.