Name: Ingegneria batteri aderenti mediante la creazione di un unico sintetico curli Operon (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-11-16T12:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 28 s
Description: Scopri come ingegnerizzare batteri aderenti mediante la creazione di un operone sintetico per curli in E. coli. Questo metodo consente di visualizzare e quantificare la formazione di biofilm su superfici di polistirene.

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Ringraziamo gli altri membri della squadra di INSA-ENS iGEM Lione (Viviane Chansavang, Mathilde Dumond, Alexandre Duprey, Mélanie Geffroy, Clémence Gonthier, Margaux Jaulin, Aurélie Haag, Ly Goki, Thomas Poinsot, Béryl Royer-Bertrand, Julie Soula, Michael Vonzy , Pierre Yves Zundel, Soufiane Bouhmadi, Olivier Brette, Gaël Chambonnier, Laura Izard, Aurianne Kroiss, Philippe Lejeune, Agnès Rodrigue, Arnaud Rondelet, Sylvie Reverchon e Valérie Desjardin), i nostri sponsor per il loro sostegno finanziario (bioMérieux, Assystem, EDF, Fondation INSA, ENS-Lione e il Dipartimento di Bioscienze INSA-Lyon), F. Wisniewski-Dyé per la lettura critica di questo manoscritto e il dottor Sze CC per il regalo ceppo. Drogue B. riceve un dottorato di ricerca borsa di studio Région Rhône-Alpes.

1. Biobrick Progettazione e Sintesi del Operon curli <ol><li> Determinare l&#39;organizzazione genetica e localizzare i segnali endogeni trascrizionale e traduzionale dei geni curli. Queste informazioni sono raccolte in banche dati specializzate come RegulonDB a o b EcoGene e completato da una lettura attenta delle pubblicazioni pertinenti. Gestione dei dati e in silico preanalysis sono state effettuate con il software c Clone Manager. </li><li> Selezionare le sequenze codificanti pertinenti. Un insieme di cinque geni assolutamente necessari per curli sintesi (CSGB e csgA monomeri fibra di codifica) e l&#39;esportazione (csgE csgF e csgG, che codifica il complesso secrezione Curlin) sono stati selezionati per costruire l&#39;operone sintetico. Estrarre le sequenze scelte dalla base dati in formato FASTA. Come cluster csgGFE è antisenso in E. coli genoma, convertire questa sequenza nel suo counterp complemento inversoarte utilizzando gli strumenti di Gestione dei Cloni Operations&gt; molecola di processo&gt; Inverti molecola. Incollare la sequenza csgEFG dietro csgBA utilizzando la funzione di &quot;legare&quot; (Clone&gt; legare). </li><li> Aggiungere il promotore appropriato. Ponendo le cinque geni selezionati curli sotto il controllo del promotore RCN P, curli si prevede essere sovra-prodotta in presenza di cobalto e nichel. Il locus RCN codifica una pompa di efflusso responsabile per la disintossicazione Ni e Co (rcnA) e la sua affine metallo-regolatore (rcnR). RcnR controlla l&#39;espressione del gene e la sua rcnA proprio in risposta a Ni e Co 19. La sequenza RCN comprendente CDS rcnR, l&#39;intera regione intergenica RCN più i 41 nucleotidi del primo rcnA era placedin anteriore della sequenza csgBAEFG chimerica (figura 1, la sequenza del intero costrutto viene fornito come dati supplementari). </li><li> Ottimizzare la trascrizionalesegnali. Un perfetto sito di legame ribosomiale (o perfetta RBS = AAGGAGGTATATA) è stato aggiunto davanti al primo ATG della sequenza di DNA csgBA. Un secondo RBS perfetto stato aggiunto davanti alla sequenza csgEFG. RBS endogena per la CSGB e geni csgF e csgG sono stati conservati. </li><li> Per il montaggio standard iGEM, il dispositivo deve essere affiancato da un prefisso standard BioBrick e suffisso, contenenti siti di restrizione per Eco RI, Pst I (prefisso) e Spe I e Xba I (suffisso). Incollare le sequenze corrispondenti a ciascuna estremità del dispositivo d. </li><li> Eliminare eventuali Eco RI, Pst I, Spe I e Xba sito di riconoscimento ho nel dispositivo. Per facilitare il processo di ulteriore montaggio, la parte BioBrick stessa non può contenere uno di questi siti di restrizione. In analisi di restrizione in silico del dispositivo rivelato un Pst I sito nella sequenza csgA, un Pst sito che ho nella sequenza rcnRe un sito Eco RI nel gene csgE. Questi siti sono rispettivamente situati in posizione 80 (Mut1), 1340 (Mut2) e 1830 (Mut3) della sequenza dispositivo (dati complementari) e sono stati modificati come segue da mutazioni silenti. Mut1 Pst sito ho CTGCAG cambiato CGTCTG Mut2 Pst sito ho CTGCAG cambiato CAGCAG Mut3 Eco sito GAATTC RI cambiato GAATT </li><li> Corri attraverso la simulazione di traduzione utilizzando il software di gestione Clone (Funzionamento&gt; molecole di processo&gt; molecole Translate). Utilizzare l&#39;allineamento BLAST sequenza di programma per verificare la perfetta omologia tra la proteina wild type curli e le proteine ​​codificate dal operone sintetico. </li><li> Ordinare il operone sintetico. Servizi commerciali di sintesi del gene sono disponibili presso numerose aziende di tutto il mondo, il nostro partner è stato Genecust (Lussemburgo). 4 microgrammi dell&#39;operone artificiale (3165 bp) sono stati ricevuti qualche settimana dopo e inserite in pUC57 (pIG2). </li></ol>2. Visualizzare e quantificare i batteri aderenti sul polistirolo <ol><li> Riempire ogni pozzetto di una piastra a 24 pozzetti in polistirene con 2 ml di terreno minimo M63 (glucosio 0,2%) e inoculare ogni pozzetto con 106 cellule di una coltura durante la notte. Crescere i batteri a 30 ° C per 18-48 ore senza agitare. Ogni colonna (4 pozzetti) rappresenta una modalità. Aggiungere la giusta quantità di cobalto (25 a 100 mm) e antibiotici (ampicillina 100 μg.L -1) quando necessario. Le prime tre righe della 24-pozzetti vengono utilizzati per quantificare i batteri aderenti facendo la media delle tre ripetizioni, l&#39;ultima fila di sinistra è utilizzato per visualizzare il biofilm. </li><li> Per le 3 prime file a 24 pozzetti: per ogni bene, recuperare il surnatante contenente le cellule planctoniche. </li><li> Sciacquare accuratamente ogni pozzetto con 1 ml di M63 e la piscina il 1 lavaggio ml con il supernatante iniziale ottenuto in 2.2). Questa piscina è denominato cellule nuoto (= S). </li><li> Recuperare il biofilm in 1 ml of M63 raschiando e pipettando su e giù (= B). Vortex 15 sec. Stimare il numero di batteri in superficie allegate e bagno alla densità ottica a 600 nm (OD600) per dare la percentuale aderenza corrispondente a ciascuna modalità. </li><li> La percentuale di adesione è calcolata utilizzando la formula: BX100 / (3xs + B). </li><li> Solo per l&#39;ultima riga dei 24 pozzetti: eliminare le cellule planctoniche. </li><li> Risciacquo con 1 ml di M63 del biofilm che aveva sviluppato sul fondo della piastra. </li><li> Essiccare la piastra aperta per 1 ora a 80 ° C. </li><li> Aggiungere 100 ml di cristalvioletto 20% per 2 min in ciascun pozzetto seguito da lavaggi con acqua estese per visualizzare le superficie-attached batteri. Tre saggi indipendenti (piastre) devono essere eseguite per garantire la riproducibilità. </li></ol> 3. Visualizza batteri aderenti su vetro di Microscopia <ol><li> Prendi un telaio fluorescente. La E. coli SCC1 ceppo e che constitutively esprime la proteina fluorescente verde (GFP), con nessuna differenza osservabile dal ceppo MG1655 20 è un ospite adatto per il cuscinetto plasmide sintetico curli operone. </li><li> Trasformare SCC1 con il plasmide pIG2 (= sintetico curli operone inserita alla Eco RI / Pst I sito del plasmide pUC57) per ottenere il ceppo S23. Trasformare SCC1 con un plasmide di controllo (pUC18) per ottenere il ceppo di controllo S24 21. </li><li> Crescere precultures overnight della S23 e del controllo (S24) ceppi a 30 ° C in terreno M63 integrato con glucosio (0,2%) e ampicillina (100 μg.L -1). </li><li> Inoculare 15 ml dello stesso terreno in piastre di Petri con 100 microlitri della precultures. Aggiungere la giusta concentrazione di cobalto (cioè 25 pM) e non dimenticare il controllo negativo senza cobalto. Introdurre 3 coprioggetto rettangolare in vetro in ogni piastra di Petri. Incubare per una notte a 30 ° C senza agitazione. </li><li> Rimuovere il coprioggetto from la piastra di Petri e con attenzione lo scarico. Pulire accuratamente la faccia inferiore con una roba di cotone piccolo impregnato con etanolo al 70 ° con l&#39;annientamento di sconto su ogni residuo batterica. Per l&#39;osservazione confocale, pulire entrambe le estremità superiori di qualche millimetro per consentire la fissazione ulteriore coprioggetto. </li><li> Batteri aderenti possono essere visualizzati direttamente ma rapidamente sotto microscopio a fluorescenza, ma accuratamente evitare l&#39;essiccazione del campione. </li><li> Per l&#39;osservazione confocale, depositare il coprioggetto su un vetrino di vetro con la faccia superiore ricoperta dal biofilm disposta a faccia. Il biofilm viene poi coperto con un vetrino coprioggetto più grande, che è fissato al vetrino con vernice. Invertire l&#39;impostazione in modo che il biofilm sarà ora sulla faccia inferiore. </li><li> Posizionare la configurazione al microscopio laser confocale. Un diritto Axioplan2 LSM510 (Zeiss) microscopio laser confocale è stato utilizzato al f piattaforma Platim. </li><li> Impostazione. GFP Excite a 488 nm, e raccogliere la fluorescenza batterica nell&#39;intervallo 500-600 nm<html> . Utilizzare 40x obiettivo ad immersione in olio per l&#39;acquisizione di immagini in modalità a scansione laser confocale. Scansionare i complessivi strutture tridimensionali dei biofilm dalla superficie solida per l&#39;interfaccia con il mezzo di crescita, utilizzando un passo di 1 um. </li><li> Eseguire proiezioni tridimensionali con Imaris software (Bitplane, Zurigo, Svizzera). Determinare lo spessore del biofilm dall&#39;analisi del valore medio z lungo statistici sezioni longitudinali. Quantificazione di biovolumes biofilm può essere estratto da confocale z-stacks come descritto altrove 22. </li></ol> un RegulonDB fornisce informazioni sui meccanismi sull&#39;organizzazione dell&#39;operone e la loro scomposizione in unità di trascrizione, promotori e il loro tipo sigma, geni e dei loro siti di legame ribosomiale, terminatori, siti di legame di specifici regolatori trascrizionali, così come la loro organizzazione in frasi di regolamentazione.et = &quot;_blank&quot;&gt; http://regulondb.cs.purdue.edu/index.jsp b Il database EcoGene contiene informazioni aggiornate sulla E. coli K-12 sequenze del genoma e proteoma, tra cui ampie bibliografie gene. Un obiettivo EcoGene importante è stata la rivalutazione dei siti di inizio di traduzione. <a href="http://ecogene.org/" target="_blank">http://ecogene.org/</a> c <a href="http://www.scied.com/dl_cmp9d.htm" target="_blank">http://www.scied.com/dl_cmp9d.htm</a> d <a href="http://partsregistry.org/wiki/index.php?title=Help:BioBrick_Prefix_and_Suffix" target="_blank">http://partsregistry.org/wiki/index.php?title=Help:BioBrick_Prefix_and_Suffix</a> Dono e di Chun Chau Sze, Nan Yang Technical University, Singapore. f Platim microscopica piattaforma UMS3444 BioSciences Gerland - Lione Sud.

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Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Passaggi critici La fase più critica in questo approccio biologia sintetica è la progettazione gene. Disegno gene sintetico deve essere meticolosa per garantire un sistema di produzione efficiente. Due geni codificanti i monomeri fibra e tre geni codificanti per proteine ​​coinvolte nel loro sistema di secrezione sono stati montati con un promotore forte e metallo-inducibile per creare una nuova unità funzionale per una nuova applicazione: il bio-decontaminazione di effluente nucleare. Come pre...

L&#39;adesione batterica al supporto abiotico svolge un ruolo importante nelle celle a combustibile biorisanamento, biocatalisi o microbica. Processi di biorisanamento utilizzare le capacità dei microrganismi di degradare sostanze organiche, o per modificare la distribuzione del metallo (immobilizzazione, volatilizzazione) o speciazione. Queste attività benefiche sono osservati negli ecosistemi acquatici e terrestri, ma anche nei sistemi artificiali sviluppati per il trattamento di acque inquinate di rifiuti industriali e domestici. L&#39;intensità e la qualità dell&#39;attività microbica dipendono fattori fisico-chimici, ma anche sullo stile di vita dei microrganismi (free-floating o incorporato in biofilm). La formazione di biofilm è associato un metabolismo promuovere resistenza ai biocidi da meccanismi diversi. Questo fenomeno sarà dunque incoraggiata maggior parte dei processi di biorisanamento. Inoltre, ingegneria cellule di Escherichia coli per controllare la formazione di biofilm è stato applicato con successoimmobilizzare cellule intere sensori su biochip 2-3. Adattamento dei microrganismi a concentrazione di metalli avviene attraverso diversi meccanismi quali adsorbimento a componenti della matrice extracellulare, attivazione della pompa di efflusso o di vettori specifici in grado di concentrare il metallo nella cella. Incrementare queste attività batteriche tramite ingegneria genetica consente trattamento efficiente ed economico di inquinamento da metalli in scala di laboratorio, in particolare nel caso di metalli altamente tossici in quantità debole come descritto da Raghu et al. 2008 4. Bonifica batterica rappresenta in questo caso un metodo di risparmio e costo competitivo rispetto ai processi chimici classici con resine a scambio ionico. Gli autori hanno descritto un E. telaio coli geneticamente modificati per l&#39;assorbimento e la ritenzione cobalto prima battendo l&#39;efflusso pompa gene che codifica rcnA, e poi la trasformazione con una copia più plasmide sovrapproduzione permettendo di untrasportatore con captazione preferenziale per il cobalto. Tale ceppo appare come una valida alternativa alle resine a scambio ionico per il trattamento di effluenti radioattivi, ma una questione chiave irrisolta è il recupero di batteri contaminate al termine del processo 4. L&#39;obiettivo del nostro lavoro è stato quindi di progettare una custom-designed ceppo in grado di attenersi ai supporti abiotici quali il vetro o plastica. Tra l&#39;insieme delle adesine e fimbrie aderente identificati batteri Gram-, abbiamo scelto di progettare un sistema che consenta di produzione curli. Curli sono fibre amiloidi sottili (2-5 nm di diametro) e altamente aggregativa che sporgono dalla E. coli e Salmonella superficie come matrice non cristallino e insolubile 5-7. Curli sono anche coinvolti nella colonizzazione delle superfici abiotiche e lo sviluppo di biofilm 8. Curli sono stati recentemente dimostrato di legare ioni di mercurio 9. Amiloidi sono infatti noti per possedere elevataaffinità per ioni di metalli come Cu 2 +, Zn 2 + e Fe 3 + 10. Questa proprietà potrebbe migliorare ulteriormente la decontaminazione di metallo effluenti inquinati. Il cluster CSG è responsabile per la produzione di fibre curli ed è costituito da due operoni trascritti divergentemente (Figura 1). L&#39;, CSGB csgA e geni csgC costituiscono l&#39;operone senso, codifica le due subunità curli, CsgA e CSGB. CsgC sembra essere coinvolto in attività redox all&#39;interno del sistema biogenesi curli e di influenzare il comportamento dei pori CsgG 11. Tuttavia, l&#39;assenza di csgC nella maggior parte dei batteri produttori curli indica che la proteina corrispondente fornisce solo un livello secondario di controllo sulla biogenesi curli. Per semplificare il sistema, abbiamo scelto di lavorare con il minimo numero di geni. Il csgDEFG operonencodes proteine ​​essenziali nella regolazione e trasportodi CsgA e CSGB alla superficie cellulare. CsgD è un attivatore trascrizionale dell&#39;operone csgBAC e svolge un ruolo chiave nel controllo della formazione di biofilm controllando la produzione delle fimbrie curli e altri componenti biofilm come cellulosa 12 e inibendo la produzione flagellum 13. CsgE, CsgF e CsgG costituiscono una curli-specifico apparato secretorio nella membrana esterna attraverso cui viene secreto principali curli subunità proteica CsgA come proteina solubile. La polimerizzazione di CsgA dipende in vivo sulla membrana legata nucleator proteina CSGB (recensione in 14). Complessi percorsi regolatori coinvolgono diversi sistemi a due componenti hanno dimostrato di controllare l&#39;espressione del gene curli 15-16. Questi regolamenti complessi permettere ai batteri di formare biofilm di spessore attraverso la produzione curli in risposta a stimoli ambientali, ma sono difficili da controllare per applicazioni industriali. Per facilitare il recupero della metal-farcito batteri durante un processo industriale, fissazione batterica ad un supporto solido deve effettivamente essere controllato dal parametro ben definito (s). Le proprietà di aderenza di curli sono legati alla loro natura amiloide 17 e potrebbe essere utilizzata per migliorare i processi di biorisanamento, ma un dispositivo semplice e facilmente controllato deve essere creato. Tra questi 7 geni 18, una serie di cinque geni assolutamente necessaria per curli sintesi (CSGB e csgA monomeri fibra codifica) e l&#39;esportazione (csgE csgF e csgG, che codifica il complesso secrezione curli) sono stati selezionati per costruire l&#39;operone sintetico. Per sfuggire alla regolazione &quot;naturale&quot; di curli, un operone sintetico composto da questi 5 geni CSG sotto il controllo di un promotore forte e cobalto-overinducible (Figura 2) è stato progettato e sintetizzato. Il passo-passo analisi della curli-regione codificante e la procedura di progettazione di un funzionale synsintetico dell&#39;operone sono descritti. Due metodi per visualizzare e quantificare l&#39;adesione batterica al polistirolo e vetro sono spiegato.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome del reagente </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td><td> Commenti (opzionale) </td></tr><tr><td> pIG2 </td><td></td><td></td><td> pUC57 (pMB1 ori, 2710 bp) con un bp 3165 EcoRI / PstI frammento contenente il sintetico P RCN - csgBAEFG operone; Amp r </td></tr><tr><td> pUC18 </td><td></td><td></td><td> Multicopia plasmide (pMB1 ori, 2686 bp), Amp r </td></tr><tr><td> S23 </td><td></td><td></td><td> SSC1 (= GFP-tagged MG1655, dono di CC Sze) / pIG2 </td></tr><tr><td> S24 </td><td></td><td></td><td> SSC1/pUC18 </td></tr><tr><td> CoCl 2 </td><td> Sigma </td><td></td><td> 0,1 M soluzione madre conservato a temperatura ambiente </td></tr><tr><td> M63 </td><td></td><td></td><td> 29 </td&gt; </tr><tr><td> 24-pozzetti </td><td> Nunc </td><td> 55429 </td><td> Polistirene piastre da 24 pozzetti </td></tr></tbody></table>

ingegneria batteri aderenti mediante la creazione di un unico sintetico curli operon

Engineering Adherent Bacteria by Creating a Single Synthetic Curli Operon

Il metodo qui descritto consiste nel ridisegnare E. aderenza proprietà coli assemblando il numero minimo di curli geni sotto il controllo di un promotore forte e metallo-overinducible, e nella visualizzazione e quantificare il guadagno risultante di adesione batterica. Questo metodo si applica principi di ingegneria appropriati di astrazione e la normalizzazione della biologia sintetica, e risultati in Biobrick BBa_K540000 (Miglior dispositivo Biobrick nuovo, progettato, iGEM 2011). La prima fase consiste nella progettazione dell&#39;operone sintetico dedicato sovrapproduzione curli in risposta al metallo, e quindi ad aumentare le capacità di aderenza del ceppo di tipo selvatico. L&#39;originale curli operone è stato modificato in silico al fine di ottimizzare i segnali trascrizionali e traslazionali e sfuggire alla regolazione &quot;naturale&quot; di curli. Questo approccio ha permesso di testare con successo la nostra attuale comprensione della produzione curli. Moreover, semplificando la regolazione curli commutando il promotore endogeno complesso (più di 10 regolatori trascrizionali identificati) per un semplice metallo promotore regolato rende aderenza molto più facile da controllare. La seconda fase prevede la valutazione qualitativa e quantitativa delle capacità di adesione mediante applicazione di metodi semplici. Questi metodi sono applicabili ad una vasta gamma di batteri aderenti indipendentemente strutture biologiche coinvolte nella formazione di biofilm. Prova di aderenza in piastre da 24 pozzetti in polistirene fornisce una visualizzazione rapida preliminare del biofilm batterico dopo colorazione violetto cristallo. Questo test qualitativo può essere affilata per la quantificazione della percentuale di adesione. Tale metodo è molto semplice ma più accurato solo colorazione viola cristallo come descritto in precedenza con 1 sia una buona ripetibilità e riproducibilità. Visualizzazione di batteri GFP-tagged su vetrini con la fluorescenza o conf lasermicroscopia Ocal permette di rafforzare i risultati ottenuti con il 24 pozzetti piastra prova mediante osservazione diretta del fenomeno.

In annotazione silico della sequenza selvatico CSG tipo di E. coli K12 associato con l&#39;ottimizzazione dei segnali trascrizionale e traduzionale ha permesso di progettare il singolo sintetico curli operone P RCN-csg mostrato in Figura 3 (sequenza completa in dati supplementari). Protocollo 2 e del protocollo 3 sono stati utilizzati per visualizzare e quantificare l&#39;aderenza associato alla produzione curli. Usando colorazione viola cristallo su piastre ...

La progettazione di un operone codifica sintetico sia l&#39;apparato secretorio ei monomeri di fibre strutturali curli è descritto. Sovrapproduzione di questi amiloidi e polimeri aderenti permette un guadagno misurabile di aderenza del<em&gt; E. coli</em&gt; Telaio<sup&gt; 1</sup&gt;. Un modo semplice per visualizzare e quantificare l&#39;aderenza sono spiegato.

Ingegneria batteri aderenti mediante la creazione di un unico sintetico curli Operon

Il metodo qui descritto consiste nel riprogettare le proprietà di aderenza di E. coli assemblando il numero minimo di geni curli sotto il controllo di un...

L'obiettivo generale del seguente esperimento è conferire proprietà aderenti ai batteri al fine di facilitarne la separazione da mezzi liquidi. Questo risultato si ottiene innanzitutto progettando una curli sintetica per aggirare la complessa regolazione genetica ed abilitare la produzione semplice e massiccia di polimeri adesivi. Come secondo passaggio, i batteri aderenti vengono visualizzati e quantificati su policarbonato, permettendo una rapida stima dell'efficienza del dispositivo sintetico.Successivamente, i batteri aderenti vengono visualizzati su vetro mediante microscopia confocale. Per osservare direttamente il biofilm e ottenere informazioni sulla sua struttura, i risultati ottenuti mostrano un aumento significativo dell'adesione nella ceppa che ospita il dispositivo sintetico, basato sia sulla misurazione percentuale dell'adesione che su osservazioni microscopiche. Il principale vantaggio dell'approccio della biologia sintetica rispetto ai metodi esistenti, come il clonaggio convenzionale, è che è possibile ottenere molto rapidamente un costrutto che contiene soltanto i geni strettamente necessari con i segnali appropriati.Questo metodo può contribuire a rispondere a una domanda fondamentale nel campo della biorisanazione, ad esempio affrontando la sfida della rimozione di batteri carichi di metalli dai rifiuti radioattivi. In generale, le persone alle prime armi con questo metodo incontrano difficoltà perché richiede conoscenze di base sui segnali genetici regolatori e sulla gestione delle banche dati. La dimostrazione visiva si concentrerà sulla quantificazione e sulla visualizzazione del biofilm, poiché questi due passaggi sono particolarmente difficili da apprendere a causa della fragilità dei biofilm.Il primo passo per progettare il carrone sintetico consiste nel determinare l'organizzazione genetica dei geni curly e nel localizzare i loro segnali endogeni di trascrizione e traduzione. Questo viene effettuato utilizzando database specializzati come REON DB o eco gene. Il passo successivo è selezionare i cinque geni assolutamente necessari per la sintesi di curly, CSGB e CSGA che codificano i monomeri della fibra, e C-S-G-E-C-S-G-F e CSGG che codificano il complesso di secrezione curly, estrarre le sequenze scelte dal database in formato fasta; la gestione dei dati e un'analisi preliminare in silico verranno eseguite con il software clone manager, poiché il cluster C-S-G-G-F-E è in senso antisenso nel genoma di e coli.Questa sequenza deve essere convertita nella sua controparte complementare inversa. Utilizzare le operazioni degli strumenti di gestione del clone: invertire la molecola, incollare la sequenza C-S-G-E-F-G dietro la sequenza C-S-G-B-A utilizzando la funzione di ligazione. Successivamente, aggiungere il promotore appropriato PRCN davanti alla sequenza iCal C-S-G-B-A-E-F-G.Il locus RCN codifica una pompa FLX, RCNA, responsabile della detossificazione del nichel e del cobalto, e il suo regolatore metallico associato RCNR. In assenza di cobalto o nichel, il repressore RCNR si lega alla sequenza RCNR sul DNA e impedisce l'attivazione completa della trascrizione dei geni a valle. Se la concentrazione intracellulare di cobalto o nichel aumenta, il legame del cobalto o del nichel alla proteina RCNR impedisce il fissarsi del repressore al promotore e l'attività trascrizionale di P-R-C-N-A aumenta, mettendo sotto controllo del promotore i cinque geni ricci selezionati.Si prevede che le PRCN ricciute siano sovraprodotte in presenza di cobalto e nichel. Successivamente, ottimizzare i segnali trascrizionali aggiungendo un sito di legame per il ribosoma perfetto, o RBS, davanti al primo ATG della sequenza di DNA CS gba e un secondo RBS perfetto davanti alla sequenza C-S-G-E-F-G. Per rispettare gli standard I GMs, il dispositivo deve essere affiancato da un prefisso bio-brick standard contenente siti di restrizione per ECO R uno e X-bar uno, e da un suffisso contenente siti di restrizione per SPE uno e PST uno, al fine di facilitare ulteriori assemblaggi.La parte del bio brick potrebbe non contenere alcun sito di riconoscimento per ECO R uno, PST uno, SPE uno e X-bar R uno. Pertanto, questi siti sono stati eliminati mediante mutazioni silenti; l'analisi in silico con enzimi di restrizione ha rivelato un sito PST uno nella sequenza CSGA, un sito PST uno nella sequenza RCNR e un sito ECO R uno nel gene CSGE. Questi siti sono stati modificati attraverso mutazioni silenti.Una volta completata la progettazione dell'opor sintetico, eseguire una simulazione di traduzione utilizzando il software clone manager. Utilizzare il programma di allineamento di sequenza blast per verificare l'omologia perfetta tra le proteine curly di tipo selvatico e le proteine codificate dall'on sintetico per iniziare questa procedura per ogni pozzetto di una piastra in polistirene a 24 pozzetti con due millilitri di mezzo minimo M 63 contenente glucosio 0,2%, inoculando ciascun pozzetto con 10 alla sesta cellule di una coltura batterica notturna. Far crescere i batteri a 30 gradi Celsius per 18-48 ore senza agitazione; ogni colonna della piastra a 24 pozzetti rappresenta una modalità.La quantità corretta di cobalto e antibiotico viene aggiunta secondo necessità. Le prime tre righe vengono utilizzate per quantificare i batteri aderenti A mediante la media delle tre ripetizioni. L'ultima riga rimasta viene utilizzata per visualizzare il biofilm mediante colorazione con violetto di cristallo dopo 18-48 ore; recuperare il soprannatante contenente le cellule planctoniche da ogni pozzetto delle prime tre righe della piastra a 24 pozzetti e trasferire il soprannatante in un tubo per emolisi.Risciacquare attentamente ogni pozzetto con un millilitro di mezzo M 63 ed aspirare la soluzione di lavaggio nel tubo per emolisi insieme al sopranatante iniziale. Questo pool è indicato come cellule in movimento, denominato S. Il fondo dei pozzetti nella piastra microtitolazione è ricoperto da cellule aderenti. Per recuperare il biofilm, aggiungere un millilitro di M 63 in ciascun pozzetto.Scrapiate bene con la punta della pipetta, quindi aspirate e rilasciate più volte, trasferendo la frazione di biofilm in un nuovo tubo emolitico. Vortexare il tubo per 15 secondi. Raccogliere la frazione di biofilm in tubi emolitici.Questo pool rappresenta le cellule aderenti alla superficie, denominate B. Trasferire 200 microlitri della frazione di supernatante e biofilm dai tubi di emolisi in una piastra a 96 pozzetti. Stimare il numero di batteri aderenti alla superficie e di batteri mobili a partire dalla densità ottica a 600 nanometri. La percentuale di adesione per ciascuna modalità viene calcolata utilizzando la formula B per 100 diviso tre volte S più B. Per visualizzare il biofilm, esclusivamente nell'ultima riga della piastra a 24 pozzetti, eliminare le cellule planctoniche da quei pozzetti.Aggiungere un millilitro di M 63 in ogni pozzetto per risciacquare il biofilm sviluppato sul fondo della piastra. Lasciare asciugare la piastra scoperta per un'ora a 80 gradi Celsius; dopo un'ora, aggiungere 100 microlitri di violetto di cristallo al 20% in ciascun pozzetto per due minuti, seguiti da numerosi risciacqui con acqua. Per questo protocollo è necessario un chassis fluorescente.Un ospite adatto per il plasmide portatore del gene sintetico di curli è il ceppo e coli SCC uno, che esprime costitutivamente la proteina fluorescente verde senza differenze osservabili rispetto al ceppo parentale MG 1 16 55. Trasformare il ceppo ospite con un plasmide puck 57 portatore del gene sintetico di curli per ottenere il ceppo S 23. Trasformare il ceppo ospite con un plasmide di controllo puck 18 per ottenere il ceppo di controllo.Coltivare per tutta la notte le precolture dei ceppi S 23 e S 24 a 30 gradi Celsius. Il giorno successivo, in mezzo M 63 integrato con glucosio e ampicillina, aggiungere 20 millilitri di mezzo M 63 in una piastra di Petri e quindi inoculare 15 millilitri di mezzo M 63 in piastre di Petri con 100 microlitri delle precolture. Aggiungere la concentrazione appropriata di cobalto e non dimenticare il controllo negativo senza cobalto.Inserire tre coprioggetti rettangolari in vetro in ciascuna piastra di Petri. Incubare le piastre durante la notte a 30 gradi Celsius senza agitazione. I batteri possono essere visualizzati direttamente al microscopio fluorescente nei giorni successivi.È importante evitare l'essiccazione del campione, quindi i seguenti passaggi devono essere eseguiti con attenzione ma rapidamente. Rimuovere ogni coprioggetto dalle piastre di Petri e drenarlo con cura. Pulire delicatamente la faccia inferiore con un piccolo bastoncino di cotone imbevuto di etanolo al 70% per rimuovere tutti i residui batterici prima dell'osservazione al microscopio confocale.Posizionare il vetrino coprioggetto su un vetrino portaoggetto con la faccia superiore ricoperta dal biofilm disposto con la faccia verso l'alto. Il biofilm viene quindi ricoperto con un vetrino coprioggetto più grande, che viene fissato al vetrino portaoggetto con della vernice.Rovesciare l'assemblaggio in modo che il biofilm si trovi ora sulla faccia inferiore. Posizionare l'assemblaggio sotto il microscopio a laser confocale in questo esperimento. Viene utilizzato un microscopio a laser confocale Zeiss LSM five 10 meta all'interno della piattaforma CT micro.Selezionare l'obiettivo ad immersione in olio da 40 volte. Utilizzare le seguenti impostazioni: eccitare la GFP a 488 nanometri e raccogliere la fluorescenza batterica nell'intervallo compreso tra 500 e 600 nanometri. Utilizzare l'obiettivo ad immersione in olio da 40 volte per acquisire le immagini.In modalità confocale a scansione laser, acquisire le strutture tridimensionali complessive dei biofilm dalla superficie solida fino all'interfaccia con il mezzo di crescita, utilizzando un passo di un micron.Eseguire proiezioni tridimensionali con un software maus, determinare lo spessore del biofilm mediante l'analisi del valore medio di C lungo sezioni longitudinali statistiche. La quantificazione del biofilm, volumi biologici, può essere estratta da stack Z confocali. Le capacità di adesione di e coli ingegnerizzati per sovraprodurre curly in risposta a metalli possono essere valutate mediante metodi semplici.Ad esempio, la colorazione con violetto cristallino su piastre Irene lucidate da 24 pozzetti consente una rapida visualizzazione della formazione di biofilm sul fondo di ciascun pozzetto, come mostrato dalla differenza nell'intensità del colore viola. Sembra che il ceppo di tipo selvaggio sia meno aderente rispetto al ceppo ingegnerizzato. Un metodo quantitativo consiste nel misurare le percentuali di adesione su polistirene dei ceppi di tipo selvaggio e ingegnerizzati con diverse concentrazioni di cobalto.I risultati presentati in questo grafico rivelano che la percentuale di adesione del ceppo ingegnerizzato è 1,5 volte superiore rispetto a quella del ceppo di tipo selvatico in assenza di cobalto. Inoltre, è stato osservato un significativo potenziamento dell'adesione in presenza di concentrazioni crescenti di cobalto: nei mezzi con concentrazioni di cobalto di 25 micromolari o 50 micromolari, le percentuali di adesione delle cellule ingegnerizzate raggiungono rispettivamente il 30% e il 40%. Le capacità adesive possono essere confrontate anche mediante microscopia utilizzando batteri marcati con GFP coltivati su vetrini; osservazioni al microscopio a fluorescenza episcopica di batteri verdi su sfondo nero rivelano che il ceppo ingegnerizzato forma un biofilm, mentre il ceppo di tipo selvatico forma soltanto microcolonie indicate dalle frecce.L'analisi mediante microscopia confocale fornisce una visione d'insieme della struttura tridimensionale del biofilm. Le ricostruzioni della vista dall'alto sono mostrate nei pannelli A e quelle della vista laterale nei pannelli B. I risultati confermano che il ceppo ingegnerizzato è più aderente e forma un biofilm più denso e spesso rispetto al ceppo selvatico. Durante l'esecuzione di questa procedura, è importante verificare attentamente il disegno sperimentale, ad esempio per esplorare il potenziale di bioremediazione di ceppi modificati di e coli o di occus ants nel contesto di acque reflue radioattive.Dopo aver visionato questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come progettare un gene sintetico utilizzando un software di gestione del clone e di come quantificare rapidamente l'espressione di ceppi batterici. Non dimenticare che lavorare con geni sintetici e organismi geneticamente modificati può essere estremamente pericoloso. Tali attività devono essere svolte nel rispetto delle normative vigenti e precauzioni come l'autoclavaggio dei batteri trasformati devono sempre essere adottate durante l'esecuzione di questa procedura.

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