Name: Un Toolkit per permettere la conversione di idrocarburi in ambienti acquosi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-10-02T13:00:00.000+00:00
Duration: 20 min 28 s
Description: Scopri un sistema batterico auto-regolante per la bioremediazione dell'inquinamento da idrocarburi utilizzando E. coli ingegnerizzati con BioBricks. Questo metodo offre una soluzione sostenibile per degradare gli alcani in ambienti acquosi tossici.

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Gli esperimenti condotti in questo video-articolo sono stati sviluppati per il concorso internazionale macchina Genetically Engineered 9. Gli autori desiderano ringraziare i membri del team iGEM Luca Bergwerff, Pieter van TM Boheemen, Jelmer Cnossen, Hugo F. Cueto Rojas e Ramon van der Valk per l&#39;assistenza nella ricerca. Ringraziamo Han de Winde, Stefan de Kok e Esengül Yıldırım per le discussioni utili e che ospitano questa ricerca. Questo lavoro è stato sostenuto dal TU Delft University Dipartimento di Biotecnologie, Il laboratorio di Bioinformatica Delft, TU Delft Dipartimento di Bionanoscience, Oil Sands Leadership Initiative (OSLI), Stud studentenuitzendbureau, Paesi Bassi Genomics Initiative, Kluyver Centro, Nederlandse Vereniging Biotechnologische (Stichting Biotecnologie Nederland) , DSM, Geneart, Greiner Bio-One e Genencor.

1. BioBrick Assemblea <ol><li> BioBricks della cancelleria di parti standard biologici sono forniti dalla sede centrale iGEM. Per costruire un nuovo BioBrick BioBricks esistenti, digerire il donatore BioBrick (fino a 1,0 mg) con gli enzimi EcoRI e SpeI di posizionamento dei donatori valle parte della parte accettore. Digerire con XbaI e PstI per posizionare la parte donatore monte della parte accettore. Aggiungi un enzima di restrizione terzo opportuno che interviene la spina dorsale del donatore. Eseguire le digestioni in un volume totale di 20-25 ml con il tampone appropriato, secondo il fornitore (concentrazione finale 1x). Utilizzare 5 unità / mg di DNA per gli enzimi di restrizione. </li><li> Digerire l&#39;accettore BioBrick sia con EcoRI e XbaI o SpeI e PstI. </li><li> Incubare le digestioni per (almeno) uno hr a 37 ° C. Inattivare le endonucleasi di restrizione da calore, incubazione a 80 ° C per 10 min e centrifugare brevemente. </li><li> Legare il BioBrick digeritoparti (donatore e accettore) insieme. Poiché XbaI e SpeI generare estremità DNA compatibili, un sito misto viene creato che non può essere tagliato con qualsiasi enzima di restrizione risultante in una nuova BioBrick &#39;combinato&#39; che affiancano i quattro siti di restrizione standard. Nella miscela di ligazione del DNA concentrazione finale è preferibilmente ~ 100 ng / pl. Effettuare la reazione di ligazione in un volume totale di 10-15 ml con il tampone di ligazione T4 (concentrazione finale 1x) e ligasi T4 (1 unità / mg di DNA). </li><li> Incubare la miscela di ligazione a 16 ° C per almeno 3 ore. </li><li> Eseguire la reazione di trasformazione con la metà circa del mix legatura. </li><li> Confermare la BioBrick corrette in sequenza. </li><li> Per costruire un BioBrick nuovo DNA sintetizzato, modificare i geni per la sintesi per l&#39;espressione ottimale in E. coli mediante lo strumento sito jcat ( <a href="http://www.jcat.de/" target="_blank">http://www.jcat.de/</a> ). Apportare ulteriori modifiche in conformità con i requisiti del B<html> ioBrick standard. Questa standardizzazione implica che ogni BioBrick è composto da una sequenza di DNA di interesse preceduto da un prefisso e seguito da un suffisso. Il prefisso e suffisso sono sequenze che contengono siti di restrizione predefiniti, che sono assenti nella sequenza rimanente plasmide. Questi siti di restrizione standard, rendono possibile intercambiare ed estendere gli inserti BioBrick flessibile 9. Il prefisso e suffisso sono le seguenti sequenze: </li></ol><table border="1"><tbody><tr><td> Nome </td><td> Sequenza </td><td> Commento </td></tr><tr><td> Prefisso </td><td> 5 &#39;GAATTCGCGGCCGCTTCTAG3&#39; </td><td></td></tr><tr><td></td><td> 5 &#39;GAATTCGCGGCCGCTTCTAGAG 3&#39; </td><td> Se la parte che segue è una sequenza codificante o qualsiasi parte che inizia con &quot;ATG&quot; </td></tr><tr><td> Suffisso </td><td> 5 &#39;TACTAGTAGCGGCCGCTGCAG 3&#39; </td><td></td></tr></tbody></table>ove_title &quot;&gt; 2. Alkane Conversione riposo Assay cellulare, In Vivo Questo saggio è stato eseguito secondo il metodo descritto da Fujii et al. (2004). <ol><li> Cultura E. coli che esprimono il sistema Alkane idrossilasi ( <a href="http://partsregistry.org/Part:BBa_K398014" target="_blank">BBa_K398014</a> ) e cellule portando un vettore vuoto ( <a href="http://partsregistry.org/Part:BBa_J13002" target="_blank">BBa_J13002</a> ) in 5 ml di terreno LB con antibiotici appropriati overnight. </li><li> Trasferire 500 microlitri della coltura durante la notte in 50 ml di LB fresco (con antibiotico) e incubare fino alla torbidità cella raggiunta una DO (densità ottica) di 0,3 a 600 nm. </li><li> Centrifugare per 10 min a 4000 rpm e risospendere il pellet in 5 ml di tampone fosfato 0,1 M (pH 7,4). </li><li> Centrifugare nuovamente per 10 min a 4000 rpm e risospendere il pellet in 5 ml di tampone fosfato 0,1 M contenente sali ora E2 e 0,66% v / v glicerolo (azoto-deficienzet media). </li><li> Misurare la torbidità cella (OD 600). </li><li> Preparare cellule miscela aliquote da 6 ml in 25 ml chiusi con tappo a palloni di vetro e non a cellule di controllo (sali E2 + 0,66% v / v glicerolo). </li><li> Aggiungere 100 nmol di alcano a ciascun contenitore. </li><li> Incubare le miscele a 37 ° C per 24 ore (quando accorciare tassi più elevati sono ottenuti). </li><li> Misurare la OD 600 dopo l&#39;incubazione. </li><li> Estrarre gli idrocarburi nei terreni di coltura da acetato di etile e determinare la concentrazione di idrocarburi nella coltura cellulare mediante gascromatografia (vedi protocollo 3). </li><li> Calcolare la degradazione per unità di biomassa dividendo la quantità totale di alcano convertito dalla biomassa totale presente in ciascuna beuta (convertire OD 600 al peso secco). Dividendo il risultato per la durata sperimentale produce l&#39;attività di degradazione per unità di biomassa per unità di tempo. La media è tratto da tre singole corse. </li></ol> 3. Alkane conversione saggio enzimatico, inVitro Questo saggio è stato eseguito essenzialmente secondo il metodo descritto da Li et al. (2008). <ol><li> Cultura E. coli che esprimono il gene Lada ( <a href="http://partsregistry.org/Part:BBa_K398017" target="_blank">BBa_K398017</a> ) e le cellule che trasportano un vettore vuoto ( <a href="http://partsregistry.org/Part:BBa_J13002" target="_blank">BBa_J13002</a> ) in 50 ml di terreno LB con antibiotici appropriati durante la notte. </li><li> Trasferire 500 microlitri della coltura durante la notte in 50 ml di LB fresco (con antibiotico) e incubare fino alla torbidità cella raggiunta una densità ottica di 0,6 a 600 nm. </li><li> Centrifugare 10 min a 4000 rpm (4 ° C) e risospendere il pellet in 5 ml di 50 mM di tampone Tris. </li><li> Ultrasuoni (Cella disgregatore, LA Biosystems) le cellule a duty cycle del 40% con un controllo di uscita 4, mantenere la soluzione in ghiaccio per tutta la durata. </li><li> Centrifugare la miscela risultante per 5 min a 4000 rpm a 4 &amp; deg; C per rimuovere i detriti cellulari. Trasferire il surnatante in un flacone fresco. </li><li> Determinare la concentrazione di proteine ​​totali degli estratti di cellule mediante saggio Bradford. Nota: utilizzare fiale di vetro per prevenire l&#39;aumento di sfondo e / o perdita di proteine. </li><li> Preparare una miscela di 100 ml contenente 0,1% v / v alcano e 50 mM Tris-HCl. </li><li> Scaldare la miscela a 100 ° C per 5 min. Nota: Eseguire questo passaggio solo per i medio-lungo alcani a catena ad alto punto di ebollizione. (Ad esempio C 16: 287 ° C). </li><li> Per ottenere una solubilità ottimale del alcano, ultrasuoni per 1 min mentre è ancora caldo fino a omogenea, miscela viscosa si ottiene. </li><li> Aggiungere 1 mM di NADH, 1 mM FMN, 1 mM MgSO 4 e 0,01 v / v Triton X-100. </li><li> Preparare 6 aliquote ml in 25 ml chiuso con tappo a fiaschi. </li><li> Aggiungi adeguate quantità di estratto cellulare (dipende dal test Bradford, la concentrazione finale di 5 mg di proteina / l). Preparare un no-proteina di controllo. </li><li> Incubare a 60 ° C (per l&#39;e ottimalenzymatic attività) per 24 ore. </li><li> Estrarre gli idrocarburi nei terreni di coltura da acetato di etile e determinare la concentrazione di idrocarburi nella coltura cellulare mediante gascromatografia (vedi protocollo 3). </li><li> Calcolare la degradazione per unità di biomassa dividendo la quantità totale di alcano convertito proteina totale aggiunto a ciascun contenitore (Bradford dalla curva di calibrazione). Dividere ulteriormente per durata dell&#39;esperimento produce l&#39;attività di degradazione per unità di proteina cellulare per unità di tempo. La media è tratto da tre singole corse. </li></ol> 4. Etile acetato e di estrazione di idrocarburi misure di concentrazione <ol><li> Alcani sono estratte dalla soluzione acquosa mediante aggiunta di 2,5 ml di acetato di etile (apolare solvant) a 6 ml soluzione sperimentale. Uno standard interno viene aggiunto al solvente ad una concentrazione di 0,1% (v / v). Lo standard (ad esempio ciclo-decano) varia a seconda del range atteso dei picchi di interesse. </li><li> Opzionale: Aggiungi TritonX-100 alla miscela acquosa e centrifugare i campioni per 10 min a 4000 rpm per ottenere un adeguato sistema bifasico. </li><li> Agitare la miscela per 5 sec (1500 rpm) e incubare a temperatura ambiente fino a quando le due fasi separate. </li><li> Rimuovere una quantità massima dello strato organico (in alto) e asciugare il solvente utilizzando solfato di magnesio anidro. </li><li> Rimuovere MgSO4 per filtrazione (0,2 micron) e trasferire il filtrato in fiale di gas cromatografo per misure, o conservare a -20 ° C. </li><li> Determinare la concentrazione mediante gascromatografia usando una colonna CP-SIL 5CB (lunghezza = 5 m). Iniettare 10 ml di campione in modalità split (1:10, 230 ° C). Impostare il flusso di gas a colonna 1 ml / min (elio). Il seguente programma di temperatura del forno viene utilizzato: <table border="1"><tbody><tr><td> Tasso </td><td> Temperatura [° C] </td><td> Tempo [min] </td></tr><tr><td> 0 </td><td> 50 </td><td> 7,5 </td></tr><tr><td> 50 </td><td> 90 </td><td> 1,0 </td></tr><tr><td> 50 </td><td> 110 </td><td> 2,0 </td></tr><tr><td> 50 </td><td> 130 </td><td> 2,0 </td></tr><tr><td> 50 </td><td> 145 </td><td> 2,0 </td></tr><tr><td> 50 </td><td> 160 </td><td> 2,0 </td></tr><tr><td> 50 </td><td> 170 </td><td> 2,0 </td></tr><tr><td> 50 </td><td> 185 </td><td> 2,0 </td></tr><tr><td> 50 </td><td> 210 </td><td> 2,0 </td></tr><tr><td> 50 </td><td> 250 </td><td> 2,0 </td></tr><tr><td> 50 </td><td> 320 </td><td> 2,0 </td></tr></tbody></table></li><li> Integrare picchi e correggere le concentrazioni rispetto allo standard interno. </li></ol> 5. L&#39;alcol / aldeide deidrogenasi saggio di attività Questo saggio è stato eseguito essenzialmente secondo il metodo descritto da Kato et al.(2010). <ol><li> Cultura E. coli che esprimono l&#39;ADH ( <a href="http://partsregistry.org/Part:BBa_K398018" target="_blank">BBa_K398018</a> ) o ALDH ( <a href="http://partsregistry.org/Part:BBa_K398030" target="_blank">BBa_K398030</a> ) gene e le cellule che trasportano un vettore vuoto ( <a href="http://partsregistry.org/Part:BBa_J13002" target="_blank">BBa_J13002</a> ) in 50 ml di terreno LB con antibiotici appropriati durante la notte. </li><li> Trasferire 500 microlitri della coltura durante la notte in 50 ml di LB fresco (con antibiotico) e incubare fino alla torbidità cella raggiunta una densità ottica di 0,6 a 600 nm. </li><li> Centrifugare 10 min a 4000 rpm a 4 ° C e risospendere il pellet in 5 ml di tampone Tris 50 mM. </li><li> Sonicare la soluzione cellulare a duty cycle del 40%, con un controllo di uscita di 4 (conservare la soluzione in ghiaccio durante la sonicazione). </li><li> Centrifugare la miscela risultante per 5 min a 4000 rpm a 4 ° C per rimuovere i detriti cellulari. </li><li> Determinare la dila concentrazione di proteine ​​Tal degli estratti cellulari da Bradford assay (Nota: utilizzare un flacone di vetro per evitare legame con le proteine). </li><li> Caricare una piastra a 96 pozzetti con 180 microlitri 57 mM tampone glicina contenente NAD (concentrazione finale 1 mM, pH 9,5) in ciascun pozzetto. </li><li> Aggiungere 5 l di alcool (aldeide) da testare ai pozzetti. Nota: alcoli a catena lunga di calore prima dell&#39;inizio del saggio per avere un liquido. Per ciascun alcole (aldeide) un controllo senza substrato dovrebbe essere aggiunto (controllo negativo). Inoltre, preparare un bianco contenente una miscela di tampone e il substrato senza estratto cellulare. </li><li> Preriscaldare il piatto del lettore di piastre (Tecan Magellan v7.0) per 15 min a 37 ° C per raggiungere l&#39;equilibrio del sistema. </li><li> Aggiungi adeguate quantità di estratto cellulare (dipende dal test Bradford, la concentrazione finale di 5 mg di proteina / l). Preparare un no-proteina di controllo. </li><li> Misurare la produzione di NADH mediante uno spettrofotometro a una lunghezza d&#39;onda di 340 nm ogni 2-3 min per 1 ora a 37 ° C. &lt;/ Li&gt; <li> Calcolare il tasso di produzione di NADH dal versante del OD (340 nm). Prendere in considerazione la lunghezza del percorso di luce e il coefficiente di estinzione del NADH di 6220 M -1 cm -1. Dividere il tasso di produzione di NADH dalla quantità totale di proteine ​​aggiunte per esprimere l&#39;attività della reazione deidrogenasi nel estratto cellulare (U / mg di proteina cellula intera). Calcolare la media e la deviazione standard di tre prove indipendenti. </li></ol> 6. pCaiF Caratterizzazione <ol><li> Cultura E. coli che esprimono il pCaiF-GFP costrutto ( <a href="http://partsregistry.org/Part:BBa_K398331" target="_blank">BBa_K398331</a> ) e le cellule che trasportano il promotore da solo ( <a href="http://partsregistry.org/Part:BBa_K398326" target="_blank">BBa_K398326</a> ) durante la notte in 5 ml di terreno LB gli antibiotici appropriati durante la notte. </li><li> Inoculare 5 ml M9 contenente 10 g / l di glucosio e antibiotici con 50 microlitri della coltura durante la notte e crescere durante la notte. </li&gt; <li> Subculture 50 microlitri della outgrowth overnight in 5 ml di fresca M9 con 10 g / l ed incubare fino alla torbidità cella raggiunta una densità ottica di 0,2 a 600 nm. </li><li> Caricare una piastra a 96 pozzetti con 100 pl di mezzo fresco M9 contenente la quantità desiderata di fonte di carbonio per la prova in ciascun pozzetto. Effettuare esperimenti in triplo di valutazione statistica e aggiungere i rispettivi controlli negativi (wild-type E. coli K12). </li><li> Aggiungere 5 l di cultura overnight ai pozzetti contenenti medi. </li><li> Misurare la curva di crescita (OD 600) e GFP fluorescenza (eccitazione 485 nm e 520 di emissione) utilizzando un lettore di piastra ogni 10 min per 18 ore a 37 ° C con agitazione costante. </li><li> Calcolare il tasso di crescita e il contenuto GFP specifico dalle rispettive misurazioni e confrontare al controllo. Calcolare la media e la deviazione standard di almeno tre esperimenti indipendenti. </li></ol> 7. Tolleranza Assay <ol><li> CulturaE. coli gene che esprime PhPFDα e β ( <a href="http://partsregistry.org/Part:BBa_K398406" target="_blank">BBa_K398406</a> ) durante la notte in 5 ml di terreno LB e gli antibiotici appropriati. E. coli che esprimono LADA gene ( <a href="http://partsregistry.org/Part:BBa_K398017" target="_blank">BBa_K398017</a> ) viene usato come controllo negativo. </li><li> Subculture 10 microlitri della outgrowth overnight in fresco 5 ml di LB (con antibiotico) e incubare fino alla torbidità cella raggiunta una densità ottica da 0,3 a 0,4 a 600 nm. </li><li> Diluire le culture con terreno fresco fino a quando un OD 600 di 0,1 è stato raggiunto. </li><li> Caricare una piastra a 96 pozzetti con 180 microlitri mezzo M9 contenente antibiotici appropriati e la corretta concentrazione finale del composto tossico (per esempio 0, 4, 8, 10% di n-esano) in triplicato. Poiché alcano miscela acqua-potrebbe portare a due sistemi trifase è essenziale avere controlli appropriati sulla piastra (ad esempio dceppi ifferent e gli esperimenti relativi bianco). </li><li> Aggiungere 20 microlitri della coltura (controllo) nei pozzetti. </li><li> Misurare la concentrazione della biomassa (OD 600) utilizzando un lettore di piastra ogni 10 min per 24 ore a 37 ° C con agitazione costante. </li><li> Calcolare i tassi di crescita delle rispettive misurazioni per le diverse concentrazioni di agente e confrontare con il controllo negativo. Calcolare la media e la deviazione standard di almeno tre prove indipendenti. </li></ol> 8. Omologo Interazione Mapping <ol><li> L&#39;HIM applicazione è stata sviluppata per eseguire query di proteine ​​su un server PostgreSQL in esecuzione il database STRING (gratuito per uso accademico) 20. L&#39;interazione applicazione omologo mappatura identifica le proteine ​​che interagiscono nell&#39;organismo ospite originale utilizzando il database STRING. Le sequenze dei rispettivi geni interagenti sono utilizzati in una ricerca BLAST per trovare geni omologhi nell&#39;organismo bersaglio. Cytoscape 4 </sup&gt; è usato per visualizzare il risultato della mappatura. L&#39;HIM strumento software può essere scaricato al seguente indirizzo: <a href="https://github.com/jcnossen/InteractionHomologMapping" target="_blank">https://github.com/jcnossen/InteractionHomologMapping.</a> </li><li> Per eseguire una mappatura, (1) inserire l&#39;ID BioBrick e l&#39;applicazione scaricherà automaticamente i dati di sequenza parte dal Registro delle parti standard biologici 9, o (2) Inserire (incolla) i dati di sequenza nell&#39;applicazione. </li><li> Utilizza il sito web di database STRING per trovare l&#39;ID di proteine ​​STRING per la sequenza di entrata di amminoacidi. </li><li> Una proteina con alta omologia è determinata utilizzando BLAST. Successivamente l&#39;applicazione elenca ciascuna proteina interagente nota nell&#39;organismo di origine e cerca omologhi nell&#39;organismo ospitante (ad esempio E. coli). </li><li> Esporta elenco risultante putativo interazione al testo o Cytoscape. </li></ol>

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</ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Il principio BioBrick viene utilizzato per costruire un telaio per la degradazione di alcani e una prova di principio per i singoli componenti del toolkit è stato ottenuto. Parecchi saggi sono proposto di misurare in vivo e in vitro di alcano pathway enzimi degradativi. Il lavoro presentato dimostra con successo un certo numero di metodi che possono essere utilizzati per determinare le attività enzimatiche e espressione nell&#39;ospite microrganismo E. coli dopo l&#39;implementazione di BioBri...

L'inquinamento da petrolio è tra le cause più gravi di contaminazione ambientale e influisce notevolmente sugli ecosistemi, sulle attività commerciali e sulle comunità 3. Sono ad esempio necessarie soluzioni per contrastare l'inquinamento da petrolio continuo proveniente dalle acque di coda delle sabbie bituminose in Alberta, Canada. Durante il processo di estrazione del petrolio dalle sabbie bituminose, il bitume, una forma semisolida ossidata del petrolio, viene estratto mediante tecniche di recupero termico che consumano circa 3,1 barili di acqua per ogni singolo barile di petrolio 1. L'acqua di processo contaminata da petrolio, proveniente principalmente da un fiume locale, viene immagazzinata in bacini di coda dopo l'estrazione del bitume. È necessario un riciclo più efficace dell'acqua di processo al fine di ridurre il prelievo di acqua dolce. Per facilitare l'estrazione del bitume e garantire che i siti a valle rispettino le linee guida sulla qualità dell'acqua per la protezione degli ecosistemi acquatici, i trattamenti dell'acqua di processo stanno evolvendosi rapidamente 3.
Per trattare l'inquinamento da composti organici, attualmente sono incoraggiate le tecnologie di biorisanamento che impiegano microrganismi 1. Gli alcani sono la famiglia più abbondante di idrocarburi nel petrolio greggio, contenenti da 5 a 40 atomi di carbonio per molecola 7, 21. Si conoscono molte batteri in grado di degradare alcani di diverse lunghezze mediante l'ossidazione sequenziale del gruppo metilico terminale, formando prima alcoli, poi aldeidi e infine acidi grassi 8. All'interno di questo progetto iGEM, diversi enzimi provenienti da organismi differenti sono stati espressi e caratterizzati, e resi disponibili attraverso lo standard BioBrick e il Registro delle Parti Biologiche Standard.
Il ben studiato sistema di idrossilasi degli alcani di Gordonia sp. TF6 facilita il passaggio iniziale di ossidazione degli alcani da C5 a C13, nonché quello dei cicloalcani da C5 a C8, mediante un minimo di quattro componenti: alkB2 (alcano 1-monossigenasi), rubA3, rubA4 (due rubredossine) e RubB (rubredossina riduttasi) 8, 21. Si riporta che l'ossidazione degli alcani a catena lunga (da C15 fino a C36) sia effettuata da ladA, una monossigenasi degli alcani appartenente alla classe delle flavoproteine, proveniente da Geobacillus thermodinitrificans NG-80-2 7, 15, 18, 22. LadA forma un complesso catalitico con la flavina mononucleotide (FMN) che utilizza ossigeno atomico per l'ossidazione. Ciò determina la conversione degli alcani negli alcoli primari corrispondenti. Gli alcoli vengono ulteriormente ossidati da deidrogenasi alcoliche e aldeidiche a acidi grassi, che entrano facilmente nella via della β-ossidazione 7, 21. Una deidrogenasi alcolica indipendente dallo zinco proveniente dal batterio termofilo Geobacillus thermoleovorans B23 ossida gli alcoli a catena media nei rispettivi aldanali, utilizzando NAD+ come cofattore 10. La deidrogenasi aldeidica dello stesso batterio è in grado di catalizzare l'ultimo passaggio, dipendente da NAD+, nell'ossidazione degli alcani a catena media 11.
Al fine di ridurre i costi di induzione e mantenere una proliferazione ottimale del sistema batterico, è stato caratterizzato il promotore pCaiF di E.coli. Questo promotore può regolare l'espressione dei componenti della via di degradazione degli idrocarburi ed è regolato dai livelli di cAMP-Crp, che a loro volta dipendono dalla concentrazione di glucosio 6. In presenza di alte concentrazioni extracellulari di glucosio nell'ambiente, il livello intracellulare di cAMP (adenosina monofosfato ciclico) risulta basso a causa dell'inibizione dell'adenilato ciclasi, un effetto collaterale del trasporto di glucosio mediato dal sistema PTS. Al contrario, in condizioni di carenza (basse concentrazioni di glucosio), il livello di cAMP aumenta e Crp si lega al cAMP formando il complesso cAMP-Crp, che si lega al promotore pCaiF e attiva la trascrizione dei componenti a valle 6, 14.
Il ceppo selvatico di E. coli tollera solo concentrazioni moderate di idrocarburi. Per completare il kit, è stato necessario affrontare il problema della tolleranza agli idrocarburi. È noto che diversi batteri resistenti a solventi organici sopravvivono in sistemi a due fasi acqua-solvente12. Tra i componenti molecolari noti per aumentare la tolleranza vi sono le chaperonine, che favoriscono il corretto ripiegamento delle proteine. Il sistema prefoldina da Pyrococcus horikoshii OT3, costituito dalle proteine phPFDα e phPFDβ, è stato dimostrato aumentare la tolleranza agli idrocarburi17.
Il kit per la conversione degli alcani è stato costruito seguendo il principio BioBrick, documentato presso il Registro delle Parti Biologiche Standard 9. I BioBrick sono plasmidi contenenti un inserto funzionale specifico delimitato da 4 siti di restrizione predefiniti. Gli inserti BioBrick possono essere estesi in modo flessibile, consentendo la costruzione di sistemi biologici con nuove funzioni.

<table><tbody><tr><td>&lt;em&gt;E. coli&lt;/em&gt; K12</td><td>New England Biolabs</td><td>C2523H</td><td></td></tr><tr><td>Ottaano</td><td>Fluka</td><td>74822</td><td></td></tr><tr><td>EsaDECANO</td><td>Fluka</td><td>52209</td><td></td></tr><tr><td>ottanolo-1</td><td>Fluka</td><td>95446</td><td></td></tr><tr><td>dodecanolo-1</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>126799</td><td></td></tr><tr><td>Esaano</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>296090</td><td></td></tr><tr><td>NADH</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N4505</td><td></td></tr><tr><td>FMN</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F2253</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>J.T. Baker Casno</td><td>7487 889</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>T4 ligasi</td><td>New England Biolabs</td><td>M0202L</td><td></td></tr><tr><td>Cromatografo a gas</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Disgregatore cellulare</td><td>LA Biosystems</td><td>CD-019</td><td></td></tr><tr><td>Spettrofotometro</td><td>Amersham Pharmacia</td><td>spec 2000</td><td></td></tr><tr><td>Lettore di piastre</td><td>Tecan Group Ltd.</td><td>Magellan v7.0</td><td></td></tr><tr><td>Incubatrice </td><td>Innova, 44</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BioBrickTM K398014: BBa_J23100-BBa_J61100-&lt;em&gt;alkB2&lt;/em&gt;-BBa_J61100-&lt;em&gt;rubA3&lt;/em&gt;-BBa_J61100-&lt;em&gt;rubA4&lt;/em&gt;- BBa_J61100-&lt;em&gt;rubB&lt;/em&gt;</td><td>Università Tecnica di Delft, dipartimento di Biotecnologia o Registro delle Parti Biologiche Standard</td><td>&lt;a href=&quot;http://partsregistry.org/Part:BBa_K398014&quot; destinazione=&quot;_blank&quot;&gt;BBa_K398014&lt;/a&gt;</td><td>Sistema idrossilasi degli alcani&lt;br/&gt; Resistenza: cloramfenicolo </td></tr><tr><td>BioBrickTM K398027: BBa_R0040-BBa_B0034-&lt;em&gt;ladA&lt;/em&gt; </td><td>Università Tecnica di Delft, dipartimento di Biotecnologia o Registro delle Parti Biologiche Standard</td><td>&lt;a href=&quot;http://partsregistry.org/Part:BBa_K398027&quot; destinazione=&quot;_blank&quot;&gt;BBa_K398027&lt;/a&gt;</td><td>Generatore di proteine ladA&lt;br/&gt; Resistenza: cloramfenicolo </td></tr><tr><td>BioBrickTM K398018: BBa_J23100-BBa_J61101-&lt;em&gt;ADH&lt;/em&gt; </td><td>Università Tecnica di Delft, dipartimento di Biotecnologia o Registro delle Parti Biologiche Standard</td><td>&lt;a href=&quot;http://partsregistry.org/Part:BBa_K398018&quot; obiettivo=&quot;_blank&quot;&gt;BBa_K398018&lt;/a&gt;</td><td>generatore di ADH&lt;br/&gt; Resistenza: cloramfenicolo </td></tr><tr><td>BioBrickTM K398030: BBa_R0040-BBa_B0034-&lt;em&gt;ALDH&lt;/em&gt; </td><td>Università Tecnica di Delft, dipartimento di Biotecnologia o Registro delle Parti Biologiche Standard</td><td>&lt;a href=&quot;http://partsregistry.org/Part:BBa_K398030&quot; obiettivo=&quot;_blank&quot;&gt;BBa_K398030&lt;/a&gt;</td><td>generatore ALDH&lt;br/&gt; Resistenza: cloramfenicolo </td></tr><tr><td>BioBrickTM K398326:&lt;em&gt; pCaiF&lt;/em&gt; </td><td>Università Tecnica di Delft, dipartimento di Biotecnologia o Registro delle Parti Biologiche Standard</td><td>&lt;a href=&quot;http://partsregistry.org/Part:BBa_K398326&quot; obiettivo=&quot;_testo vuoto_&quot;&gt;BBa_K398326&lt;/a&gt;</td><td>promotore pCaiF&lt;br/&gt; Resistenza: cloramfenicolo </td></tr><tr><td>BioBrickTM K398331:&lt;em&gt; pCaiF&lt;/em&gt;-BBa_B0032-BBa_I13401</td><td>Università Tecnica di Delft, dipartimento di Biotecnologia o Registro delle Parti Biologiche Standard</td><td>&lt;a href=&quot;http://partsregistry.org/Part:BBa_K398331&quot; destinazione=&quot;_testo vuoto_&quot;&gt;BBa_K398331&lt;/a&gt;</td><td>Dispositivo di misurazione pCaiF&lt;br/&gt; Resistenza: cloramfenicolo </td></tr><tr><td>BioBrickTM K398406: BBa_J23002-BBa_J61107-&lt;em&gt;phPFD&lt;/em&gt;&lt;em&gt;&amp;alpha;&lt;/em&gt;-BBa_J61107- </td><td>Università Tecnica di Delft, dipartimento di Biotecnologia o Registro delle Parti Biologiche Standard</td><td>&lt;a href=&quot;http://partsregistry.org/Part:BBa_K398406&quot; destinazione=&quot;_blank&quot;&gt;BBa_K398406&lt;/a&gt;</td><td>Gruppo di tolleranza ai solventi&lt;br/&gt; Resistenza: cloramfenicolo </td></tr></tbody></table>

un toolkit per permettere la conversione di idrocarburi in ambienti acquosi

A Toolkit to Enable Hydrocarbon Conversion in Aqueous Environments

Questo lavoro propone una serie di strumenti che consente la conversione di alcani da Escherichia coli e presenta una prova di principio della sua applicabilità. Il toolkit è costituito da più parti standard intercambiabili (BioBricks) 9 riguardanti la conversione di alcani, regolazione dell&#39;espressione genica e della sopravvivenza in idrocarburi tossici ambienti ricchi. A tre fasi pathway per la degradazione alcano è stato attuato in E. coli per consentire la conversione di alcani media e lunga catena ai loro rispettivi alcanoli, alkanals e infine alcanoico-acidi. Questi ultimi sono stati metabolizzati tramite il nativo di β-ossidazione percorso. Per facilitare l&#39;ossidazione di alcani a catena media (C5-C13) e cicloalcani (C5-C8), quattro geni (alkB2, rubA3, rubA4 e Rubb) del sistema idrossilasi alcano da Gordonia sp. TF6 8,21 sono stati trasformati in E. coli. Per la conversione dialcani a catena lunga (C15-C36), il gene Lada da thermodenitrificans Geobacillus è stato attuato. Per i passaggi necessari ulteriori del processo di degradazione, ADH e ALDH (provenienti da thermodenitrificans G.) sono stati introdotti 10,11. L&#39;attività è stata misurata mediante saggi su cellule quiescenti. Per ogni passaggio ossidativo, l&#39;attività enzimatica è stata osservata. Per ottimizzare l&#39;efficienza del processo, l&#39;espressione è indotta soltanto in condizioni di glucosio basso: un substrato regolato promotore, pCaiF, è stato utilizzato. pCaiF è presente in E. coli K12 e regola l&#39;espressione dei geni coinvolti nella degradazione del glucosio non fonti di carbonio. L&#39;ultima parte del toolkit - mira sopravvivenza - è stato implementato utilizzando geni di tolleranza solventi, PhPFDα e β, sia dal Pyrococcus horikoshii OT3. Solventi organici possono indurre stress cellulare e diminuiscono la capacità di sopravvivenza di negativo affecting ripiegamento delle proteine. Come accompagnatori, PhPFDα e β migliorare il ripiegamento ad esempio processi di proteina in presenza di alcani. L&#39;espressione di questi geni ha portato ad un miglioramento della tolleranza idrocarburo mostrato da una crescita maggiore (fino al 50%) in presenze del 10% di n-esano in mezzo di coltura sono stati osservati. Riassumendo, i risultati indicano che il toolkit consente di E. coli da convertire e tollerare idrocarburi in ambienti acquosi. In quanto tale, rappresenta un primo passo verso una soluzione sostenibile per l&#39;olio-bonifica utilizzando un approccio biologia sintetica.

Conversione degli alcani
L'attività dei tre passaggi di ossidazione dall'alcano all'acido grasso corrispondente è stata valutata mediante saggi su cellule in riposo e misurazioni dell'attività enzimatica. I risultati sono presentati in base alle reazioni del percorso metabolico: (1) alcano idrossilasi, (2) alcol deidrogenasi e (3) aldeide deidrogenasi. 
Per il primo passaggio, sono stati costruiti diversi plasmidi per alcani a catena media e lunga. Il plasmide <a href="http://partsregistry.or...

Un sistema di regolazione automatica sostenibile batterica per la bonifica di inquinamenti del petrolio è stato progettato utilizzando le normali parti di DNA intercambiabili (BioBricks). L&#39;ingegneria<em&gt; E. coli</emCeppo&gt; è stato usato per degradare alcani tramite β-ossidazione tossici in ambienti acquosi. Gli enzimi rispettivi di specie diverse hanno mostrato un&#39;attività alcano degrado. Inoltre, una maggiore tolleranza<em&gt; N</em&gt;-Esano è stato ottenuto con l&#39;introduzione di geni di alcano-tolleranti batteri.

Un Toolkit per permettere la conversione di idrocarburi in ambienti acquosi

Questo lavoro propone un toolkit che consente la conversione degli alcani da parte di Escherichia coli e ne presenta una prova di principio della sua applicabilità. Il...

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