Name: Un test Galvanotaxis Analisi della Cinetica precursori neurali migrazione cellulare in un campo applicato esternamente diretto Corrente elettrica (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-10-13T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min
Description: Scopri la galvanotassi dei precursori neurali derivati dal cervello adulto utilizzando campi elettrici diretti e imaging time-lapse. Questo metodo permette di studiare la migrazione cellulare per applicazioni in neuro-riparazione.

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Questo lavoro è finanziato dalla scienze naturali e ingegneria Research Council del Canada (sovvenzione # 249669, # 482986 e) e Heart and Stroke Foundation of Canada (sovvenzione # 485508). Gli autori ringraziano Youssef El-Hayek e il dottor Qi Wan per la loro assistenza nello sviluppo dei protocolli sperimentali.

Tutte le procedure che comportano il trattamento degli animali sono state approvate dal Comitato Università di Toronto Animal Care in conformità con le linee guida istituzionali (protocollo n. 20009387). I metodi seguenti devono essere effettuate utilizzando strumenti sterili e tecniche, in una cappa a flusso laminare dove applicabile. Nel testo del protocollo sottostante, la frase &quot;EFH-SFM&quot; si riferisce a mezzi di informazione liberi siero integrato con il fattore di crescita epidermico, fondamentale fattore di crescita dei fibroblasti e eparina. EFH-SFM viene utilizzato quando studiando la galvanotaxis di NPCs indifferenziate perché questi mitogeni mantenere NPC nel loro stato indifferenziato 4. Quando si verifica il galvanotaxis di NPC indotte a differenziarsi in tipi di cellule mature, &quot;FBS-SFM&quot; si riferisce a mezzi di informazione liberi siero addizionato con 1% di siero fetale bovino. FBS promuove la differenziazione dei PNG in mature fenotipi neurali 5. 1. Isolamento e la coltura dei precursori neurali (nonmostrato nel video) <ol><li> Anestetizzare un topo CD1 (6-8 settimane) con isofluorano e sacrificio tramite dislocazione cervicale. </li><li> Spegnere la testa in etanolo al 70% e decapitare l&#39;animale con le forbici affilate dissezione. </li><li> Mentre si tiene la testa con una pinza chirurgica, togliere la pelle sulla superficie dorsale per esporre il cranio. </li><li> Utilizzando un bisturi e non. 11 lame, segnare il cranio al seno frontale lungo l&#39;asse medio-laterale, e anche lungo la sutura sagittale in direzione rostrocaudale. </li><li> Sbucciare le ossa parietali di distanza dalla testa senza. 7 pinze curve, facendo attenzione a non perforare il tessuto cerebrale. </li><li> Inserire una spatola sottile sotto il cervello a partire da sotto il cervelletto e avanzando verso i bulbi olfattivi. Tenendo il cranio in posizione con le pinze, tirare delicatamente il cervello dal cranio e subito mettere in ghiaccio freddo liquido cerebrospinale artificiale (vedi le ricette sotto). </li><li> Sotto un microscopio di dissezione, utilizzando steriledissezione forbici e pinze tagliare il cervello a metà lungo la linea mediana. Ruotare ciascun emisfero in modo che il mediale (taglio) di superficie rivolta verso l&#39;alto. </li><li> Selezionare un emisfero, e con la superficie mediale rivolta verso l&#39;alto, individuare il splenio del corpo calloso (regione posteriore del corpo calloso). </li><li> Effettuare un&#39;incisione dalla superficie della corteccia alla splenio del corpo calloso lungo l&#39;asse dorsoventrale. </li><li> Sbucciare la corteccia incisa verso il bulbo olfattivo per esporre le pareti mediale e laterale del ventricolo laterale. </li><li> Ruotare l&#39;emisfero in modo che la superficie dorsale rivolta verso l&#39;alto, e usare microforbici curve per tagliare e raccogliere le pareti esposte mediale e laterale, che contengono la regione periventricolare dove PNG risiedono 6. </li><li> Ripetere i passaggi 1,8-1,11 per l&#39;altro emisfero. </li><li> Pipettare il tessuto isolato in 7 ml di soluzione di tripsina (vedi ricetta sotto) in un tubo da 15 cc, e posizionare il tubo su un agitatore a 37 ° Cincubatore per 25 min. </li><li> Centrifugare la provetta a 1500 rpm per 5 minuti, aspirare il surnatante, risospendere il tessuto e in 2 ml di soluzione di tripsina (vedi ricetta sotto). </li><li> Triturare delicatamente il tessuto con un piccolo pozzo pipetta Pasteur 30-50 volte con attenzione per evitare bolle d&#39;aria. </li><li> Centrifugare la provetta a 1500 rpm per 5 minuti, aspirare il supernatante, e risospendere in 1-2 ml di SFM (vedi ricetta sotto) triturando il pellet 3-5 volte. </li><li> Centrifugare la provetta a 1.500 rpm per 3 minuti, aspirare il surnatante e risospendere in 1 ml di SFM + EFH. </li><li> Contare vivere densità delle cellule con un emocitometro e piastra le cellule in una beuta T25 coltura ad una densità di 10 cellule per microlitri di SFM + EFH. </li><li> Lasciare che la cultura di crescere per 7 giorni per ottenere indisturbati neurosfere primarie liberamente fluttuanti composti da NPC. </li></ol> 2. Galvanotaxis camera di preparazione <ol><li> Mettere 3 vetro quadrato no. 1 vetrini coprioggetto (22 x 22 x 0.17 mm) ina bottiglia di acido cloridrico 6N overnight. </li><li> Il giorno successivo, utilizzare una punta di diamante di vetro taglierina per tagliare sei strisce rettangolari (22 x 5 x 0.17 mm) di vetro da nessuna piazza. 1 coperchio scivola. </li><li> Trasferire i tagliandi quadrati lavata con acido e marze rettangolari in una cappa a flusso laminare. Lavare le strisce rettangolari e quadrate prima con etanolo al 70%, poi con coltura tissutale acqua di grado autoclavato, e lasciare asciugare su un Kim Wipe (per sterilità aggiunto, il vetro può essere consentito di aria secca). </li><li> Applicare grasso per vuoto al perimetro di una superficie dei vetrini quadrati, e sigillare a base di piatti di plastica 60 millimetri Petri. </li><li> Applicare grasso per vuoto lungo l&#39;asse di una superficie delle strisce rettangolari di vetro, e sigillare a bordi opposti dei vetrini quadrati (in modo che siano paralleli tra loro) in modo da creare una depressione centrale. </li><li> UV-sterilizzare le camere per almeno 15 min in cappa a flusso laminare. </li><li> Pipettare 250-300 microlitri di poli-L-lizzane sul canale centrale delle camere e incubare a temperatura ambiente per 2 h. </li><li> Circa 15 minuti prima della fine del periodo di incubazione, preparare la soluzione Matrigel (vedi ricetta sotto). </li><li> Aspirare il poli-L-lisina, lavare gli avvallamenti centrali con 1 ml di acqua autoclavato, e pipetta 250-300 microlitri di soluzione di Matrigel sulle depressioni centrali. </li><li> Incubare le camere a 37 ° C per 1 ora. </li><li> Aspirare la soluzione Matrigel e lavare delicatamente i trogoli centrali con 1-2 ml di SFM. </li><li> Pipettare 100 ul di EFH-SFM o FBS-SFM sulle depressioni centrali e trasferire le camere galvanotaxis sul palco di un microscopio di conteggio. </li><li> Pipetta 3-4 ml di neurosfere contenente coltura in piastre da 60 mm Petri e trasferire il piatto Petri alla fase del microscopio conteggio. </li><li> Ad un obiettivo di visualizzazione 5x, utilizzare una pipetta P10 trasferire 5-8 neurosfere interi (fino a quattro alla volta) sul canale centrale di ogni galvanotaxiscamera senza dissociare, e con cura diffondere le neurosfere di tutto il canale centrale, senza interrompere il substrato Matrigel. </li><li> Aggiungi un ulteriore 150-200 ml di EFH-SFM o FBS-SFM sulle depressioni centrali. </li><li> Trasferire le camere galvanotaxis in un 37 ° C, 5% di CO 2, 100% incubatore umidificato per 17-20 hr (se analizzando NPCs indifferenziate) per consentire la neurosfere di aderire al substrato Matrigel e dissociarsi in singole cellule, come mostrato in Figura 1 . Se l&#39;analisi di NPC differenziati, il periodo di incubazione dovrebbe essere esteso per 69-72 ore per permettere la differenziazione delle cellule. </li></ol> 3. Live cellulare Time-Lapse Imaging <ol><li> Permettono il sistema live cell imaging equilibrare a 37 ° C, 5% di CO 2 per un minimo di 30 minuti prima dell&#39;inizio del time-lapse. </li><li> Tagliate due 12 pezzi cm di 1 mm di diametro del filo d&#39;argento, l&#39;avvolgimento di bobine da un capo, e metterli in Clorox blisciviazione per 20 minuti per formare Ag / AgCl elettrodi. </li><li> Trasferire le camere galvanotaxis sul palco di un microscopio di conteggio e scegliere quale camera sarà utilizzato per live-cella di analisi di immagini di migrazione sulla base dei seguenti criteri: i) le neurosfere dovrebbe essere quasi completamente dissociato in singole cellule e ii) le cellule devono possedere morfologie rotondi con piccole-to-nessun processo si estende dai corpi cellulari. </li><li> Trasferire la camera selezionata galvanotaxis in una cappa a flusso laminare, con un no quadrato separato. 1 coperchio in vetro antiscivolo e grasso per vuoto. </li><li> Lavare il coperchio scivolare prima con etanolo 70%, poi con acqua autoclavata, e applicare una striscia di grasso per vuoto su due bordi paralleli del vetrino. </li><li> Aspirare il mezzo di coltura dalla vasca centrale della camera, quindi rapidamente posizionare il vetrino (grasso lato rivolto verso il basso) sulla camera di modo che il resto del grasso strisce sulle due strisce parallele rettangolari di vetro, creando un tettoalla camera. </li><li> Pipettare 100 ul di fresco EFH-SFM o FBS-SFM nella vasca centrale tramite azione capillare. </li><li> Utilizzare grasso per vuoto per creare bordi per piscine di terreni di coltura su ciascuna estremità del canale centrale, come mostrato in Figura 2. </li><li> Tagliate due 15 pezzi cm di tubo in PVC, e utilizzare una siringa da 10 cc con un ago da 18 gauge per iniettare con attenzione la soluzione di agarosio nel tubo, assicurando che nessun bolle si formano nei tubi, e permettere al gel di solidificare per 5 minuti. </li><li> Trasferire la camera galvanotaxis al sistema live imaging cellulare, insieme al gel di agarosio tubi, Ag / AgCl elettrodi, e un paio di piatti vuoti 60 millimetri Petri che verranno utilizzati come mezzi di coltura serbatoi e conterrà il Ag / AgCl elettrodi. Lasciare la camera galvanotaxis ad arrestarsi entro i 37 ° C, 5% di CO 2 ambiente per 20-30 min. </li><li> Durante questo tempo, preparare i coperchi dei 2 piatti vuoti Petri e il coperchio della scatola di Petri della camera galvanotaxis da parte di foriin loro con un utensile Dremel o simile come mostrato in Figura 3. </li><li> Pipettare 1-1,5 ml di EFH-SFM o FBS-SFM su entrambi i lati del canale centrale, e 7-8 ml di SFM in ciascuna piastra di Petri vuota. Mettere una piastra di Petri su ciascun lato del canale centrale della camera galvanotaxis e mettere un Ag / AgCl in ogni piatto. Colmano il divario tra la camera galvanotaxis e le piastre di Petri di stabilire una continuità elettrica con i ponti gel agarosio, come mostrato in Figura 4. </li><li> Collegare le Ag / AgCl elettrodi a un alimentatore esterno, con un amperometro in serie per misurare la corrente elettrica, e accendere l&#39;alimentazione. Utilizzare un voltmetro per misurare la forza del campo elettrico direttamente attraverso il trogolo centrale, e regolare l&#39;uscita dell&#39;alimentatore finché la forza desiderata campo elettrico viene ottenuto (i saggi effettuati in questo laboratorio utilizzano una forza dcEF di 250 mV / mm con corrente elettrica tra 1 e 1,5 mA). </li><li> Iniziativate il time-lapse modulo sul sistema live imaging cellulare, e che l&#39;esperimento possa funzionare per il tempo desiderato. Dopo il completamento del test, fissare le cellule in paraformaldeide al 4% per l&#39;analisi immunoistochimica standard. </li></ol>

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<li>McCaig, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlling+Cell+Behavior+Electrically%3A+Current+Views+and+Future+Potential%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Controlling Cell Behavior Electrically: Current Views and Future Potential.</a> Physiol. Rev. 85, 943-978 (2005).</li>
<li>Morshead, C. M., Benveniste, P., Iscove, N. N., vander Kooy, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hematopoietic+competence+is+a+rare+property+of+neural+stem+cells+that+may+depend+on+genetic+and+epigenetic+alterations%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med%22%5BJournal%5D)">Hematopoietic competence is a rare property of neural stem cells that may depend on genetic and epigenetic alterations.</a> Nat. Med. 8, 268-273 (2002).</li>
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</ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Questo protocollo è stato adattato da ben consolidati metodi di studi precedenti 7-9. Camere Galvanotactic può essere costruito utilizzando una varietà di tecniche diverse, compresa la costruzione di un bicchiere ben separata per il confinamento di semina cellulare, o mediante ablazione laser CO 2 per microfabbricazione del trogolo centrale 10,11. Alcune tecniche possono essere più laborioso o costose di altre. Abbiamo descritto un test semplice e conveniente per la costruzione di una ca...

<table border="1"><tbody><tr><td height="44"> Nome della voce </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td><td> Commenti </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Neural Precursore isolamento cellulare </td></tr><tr><td> 2M NaCl </td><td> Sigma </td><td> S5886 </td><td> 11,688 g sciolti in 100 ml di dH 2 O </td></tr><tr><td> KCl 1M </td><td> Sigma </td><td> P5405 </td><td> 7,456 g sciolti in 100 ml di dH 2 O </td></tr><tr><td> 1M MgCl 2 </td><td> Sigma </td><td> M2393 </td><td> 20,33 g sciolti in 100 ml di dH 2 O </td></tr><tr><td> 155 mm NaHCO 3 </td><td> Sigma </td><td> S5761 </td><td> 1,302 g sciolti in 100 ml di dH 2 O </td></tr><tr><td> Glucosio 0.5M </td><td> Sigma </td><td> G6152 </td><td> 9,01 g sciolti in 100ml di dH 2 O </td></tr><tr><td> 108 mM CaCl 2 </td><td> Sigma </td><td> C7902 </td><td> 1,59 g sciolti in 100 ml di dH 2 O </td></tr><tr><td> Penicillina-streptomicina </td><td> Gibco </td><td> 15070 </td><td></td></tr><tr><td> Pancreas tripsina bovina </td><td> Sigma </td><td> T1005 </td><td></td></tr><tr><td> Pecora testicoli ialuronidasi </td><td> Sigma </td><td> H6254 </td><td></td></tr><tr><td> Acido Kynurenic </td><td> Sigma </td><td> K3375 </td><td></td></tr><tr><td> Ovomucoid inibitore della tripsina </td><td> Worthington </td><td> LS003086 </td><td></td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Invitrogen </td><td> 12100046 </td><td></td></tr><tr><td> F12 </td><td> Invitrogen </td><td> 21700075 </td><td></td></tr><tr><td> 30% Glucosio </td><td> Sigma </td><td> G6152 </td><td></td></tr><tr><td> 7,5% NaHCO 3 </td><td> Sigma </td><td> S5761 </td><td></td></tr><tr><td> HEPES 1M </td><td> Sigma </td><td> H3375 </td><td> 23,83 g sciolti in 100 ml di dH 2 O </td></tr><tr><td> L-glutammina </td><td> Gibco </td><td> 25030 </td><td></td></tr><tr><td> FEG </td><td> Invitrogen </td><td> PMG8041 </td><td> Ricostituire in 1 ml di miscela di ormoni e aliquotare in 20 unità pl. </td></tr><tr><td> FGF </td><td> Invitrogen </td><td> PHG0226 </td><td> Ricostituire in 0,5 ml di miscela di ormoni e aliquotare in 20 unità pl. </td></tr><tr><td> Eparina </td><td> Sigma </td><td> H3149 </td><td></td></tr><tr><td> Apo-transferrina </td><td> R &amp; D Systems </td><td> 3188-A </td><td> 0,1 g sciolti in 4 ml di dH 2 0 </td></tr><tr><td> Putrescina </td><td> Sigma </td><td> P7505 </td><td> Sciogliere 9,61 mg in Apo-transferrina cosìluzione </td></tr><tr><td> Insulina </td><td> Sigma </td><td> I5500 </td><td> Sciogliere 25 mg in 0,5 ml di HCl 0,1 N e aggiungere 3,5 ml di dH 2 0 </td></tr><tr><td> Selenio </td><td> Sigma </td><td> S9133 </td><td></td></tr><tr><td> Progesterone </td><td> Sigma </td><td> P6149 </td><td></td></tr><tr><td> Strumenti di dissezione standard </td><td> Strumenti Scienza Belle </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Dissezione microscopio </td><td> Zeiss </td><td> Stemi 2000 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Galvanotaxis camera di preparazione </td></tr><tr><td> Quadrati di vetro di copertura diapositive </td><td> VWR </td><td> 16004 </td><td></td></tr><tr><td> Acido cloridrico 6N </td><td> VWR </td><td> BDH3204-1 </td><td></td></tr><tr><td> Vuoto Grasso per alte </td><td> Dow Corning </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 60 millimetri Petri piatti </td><td> Fisher Scientific </td><td> 0875713A </td><td></td></tr><tr><td> Poli-L-lisina </td><td> Sigma </td><td> P4707 </td><td></td></tr><tr><td> Matrigel </td><td> BD Biosciences </td><td> 354234 </td><td> Scongelare e aliquotare in 150 unità pl </td></tr><tr><td> FBS </td><td> Invitrogen </td><td> 10082139 </td><td> Utilizzare solo se indurre il differenziamento NPC, altrimenti utilizzare SFM + terreni di coltura EFH come sopra indicato </td></tr><tr><td> Conteggio microscopio </td><td> Olimpo </td><td> CKX41 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Live cellulare Time-Lapse Imaging </td></tr><tr><td> Filo di argento </td><td> Alfa Aesar </td><td> 11434 </td><td></td></tr><tr><td> Ultrapura agarosio </td><td> Invitrogen </td><td> 15510-027 </td><td></td></tr><tr><td> Calore Inactivated FBS </td><td> Sigma </td><td> 16140071 </td><td></td></tr><tr><td> Tubi in PVC </td><td> Fisher Scientific </td><td> 80000006 </td><td> 3/32 &quot;ID x 5/32&quot; OD </td></tr><tr><td> Candeggina </td><td> Clorox </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Siringa da 10 cc </td><td> BD </td><td> 309604 </td><td></td></tr><tr><td> 18 gauge </td><td> BD </td><td> 305195 </td><td></td></tr><tr><td> Dremel trapano </td><td> Dremel </td><td> Modello 750 </td><td></td></tr><tr><td> Microscopio invertito dotato di umidificata, camera incubata </td><td> Zeiss </td><td> Axiovert-200M </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Ricette <table border="1"><tbody><tr><td> Voce </td><td> Volume </td></tr><tr><td> 2M NaCl </td><td> 6,2 ml </td></tr><tr><td>KCl 1M </td><td> 0,5 ml </td></tr><tr><td> 1M MgCl 2 </td><td> 0,32 ml </td></tr><tr><td> 155mm NaHCO 3 </td><td> 16,9 ml </td></tr><tr><td> Glucosio 1M </td><td> 1 ml </td></tr><tr><td> 108 mM CaCl 2 </td><td> 0,09256 ml </td></tr><tr><td> Penicillina-streptomicina </td><td> 1 ml </td></tr><tr><td> Acqua autoclavata </td><td> 74 ml </td></tr></tbody></table> Artificiale liquido cerebrospinale <table border="1"><tbody><tr><td> Voce </td><td> Volume o massa </td></tr><tr><td> Artificiale liquido cerebrospinale </td><td> 30 ml </td></tr><tr><td> Pancreas tripsina bovina </td><td> 40 mg </td></tr><tr><td> Pecora testicoli ialuronidasi </td><td> 22,8 mg </td></tr><tr><td> Acido Kynurenic </td><td> 5 mg </td></tr></tbody></table> &lt;strong&gt; Tripsina Solution <table border="1"><tbody><tr><td> Voce </td><td> Volume o massa </td></tr><tr><td> SFM </td><td> 15 ml </td></tr><tr><td> Ovomucoid inibitore della tripsina </td><td> 10 mg </td></tr></tbody></table> Inibitore della tripsina Solution <table border="1"><tbody><tr><td> Voce </td><td> Volume </td></tr><tr><td> Acqua autoclavata </td><td> 37 ml </td></tr><tr><td> 10X DMEM/F12 </td><td> 10 ml </td></tr><tr><td> 30% Glucosio </td><td> 2 ml </td></tr><tr><td> 7,5% NaHCO 3 </td><td> 1,5 ml </td></tr><tr><td> HEPES 1M </td><td> 0,5 ml </td></tr><tr><td> Transferrina, putrescina soluzione </td><td> 4 ml </td></tr><tr><td> 25 mg soluzione di insulina </td><td> 4 ml </td></tr><tr><td> Selenio </td><td> 100 &amp; mu; L </td></tr><tr><td> Progesterone </td><td> 100 pl </td></tr></tbody></table> Ormone Mix (100 ml totali, conservare a -20 ° C) <table border="1"><tbody><tr><td> Voce </td><td> Volume </td></tr><tr><td> Acqua autoclavata </td><td> 37,5 ml </td></tr><tr><td> DMEM/F12 10X (3:1) </td><td> 5 ml </td></tr><tr><td> 30% Glucosio </td><td> 1 ml </td></tr><tr><td> 7,5% NaHCO 3 </td><td> 0,75 ml </td></tr><tr><td> HEPES 1M </td><td> 0,25 ml </td></tr><tr><td> Ormone mix </td><td> 5 ml </td></tr><tr><td> L-glutammina </td><td> 0,5 ml </td></tr><tr><td> Penicillina-streptomicina </td><td> 0,5 ml </td></tr></tbody></table> Siero Free Media EFH-SFM: aggiungere 10 ml di EGF, 10 pl di FGF, e 3,66 ml di eparina FBS-SFM: aggiungere 0,5 ml di FBS <tabile confine = &quot;1&quot;&gt; <tbody><tr><td> Voce </td><td> Volume </td></tr><tr><td> Matrigel </td><td> 150 pl </td></tr><tr><td> SFM </td><td> 3,6 ml </td></tr></tbody></table> Matrigel Soluzione aliquota Matrigel deve essere collocato in una scatola di ghiaccio e lasciata scongelare lentamente 4-5 ore per formare un liquido viscoso prima della miscelazione con SFM. Ciò garantirà la formazione di uno strato di substrato liscio Matrigel. Se non scongelato lentamente, il substrato risultante conterrà ciuffi di Matrigel, eventualmente ostacolare la migrazione cellulare. <table border="1"><tbody><tr><td> Voce </td><td> Volume o massa </td></tr><tr><td> Ultrapura agarosio </td><td> 300 mg in 10 ml DDH 2 0 </td></tr><tr><td> SFM Calore FBS inattivato </td><td> 8 ml 2 ml </td></tr></tbody></table> MatrigelSoluzione Mix 8 ml di SFM con 2 ml di FBS inattivato al calore in un tubo 15 cc falcon. Mix agarosio con 10 ml DDH 2 0 in un matraccio di Erlenmeyer e riscaldare in un forno a microonde per 30 sec a 10 sec-intervalli, garantendo per rimuovere la soluzione dalla microonde dopo ogni intervallo di 10 secondi e mescolare. Dopo la finale di 10 secondi periodo di forno a microonde, mescolare la soluzione di agarosio con il SFM / soluzione di FBS e conservare in un bagno d&#39;acqua ° 57 C. </td></tr></tbody></table>

un test galvanotaxis analisi della cinetica precursori neurali migrazione cellulare in un campo applicato esternamente diretto corrente elettrica

A Galvanotaxis Assay for Analysis of Neural Precursor Cell Migration Kinetics in an Externally Applied Direct Current Electric Field

La scoperta di staminali e cellule progenitrici (collettivamente chiamati cellule precursori neurali) (NPC) nel cervello dei mammiferi adulti ha portato ad un corpo di ricerca finalizzata ad utilizzare le proprietà multipotenti e proliferativi di queste cellule per lo sviluppo di strategie neurorigenerativo. Un punto critico per il successo di tali strategie è la mobilitazione di NPC verso un sito di lesione dopo trapianto esogena o per migliorare la risposta dei precursori endogeni che si trovano nella regione periventricolare del SNC. Di conseguenza, è essenziale per comprendere i meccanismi che promuovono, guidare, e migliorare la migrazione NPC. Il nostro lavoro si concentra su l&#39;utilizzo di campi elettrici a corrente diretta (dcEFs) per la promozione e la migrazione diretta NPC - un fenomeno noto come galvanotaxis. Campi elettrici endogeni fisiologici operato come spunti critici per la migrazione delle cellule durante il normale sviluppo e la riparazione delle ferite. Interruzione farmacologica dellatrans-neurale potenziale tubo in embrioni axolotl causa gravi malformazioni dello sviluppo 1. Nel contesto della guarigione delle ferite, il tasso di riparazione di cornea feriti è direttamente correlata con la grandezza del potenziale lesione epiteliale che sorge dopo la lesione, come mostrato dal miglioramento farmacologico o interruzione di questo dcEF 2-3. Abbiamo dimostrato che adulti NPC subependimali incontro a rapida e diretta migrazione catodiche in vitro quando esposti ad un dcEF applicata esternamente. In questo protocollo si descrivono le tecniche del nostro laboratorio per la creazione di un saggio galvanotaxis semplice ed efficace ad alta risoluzione, osservazione a lungo termine della traslocazione cellula diretto del corpo (migrazione) su una singola cellula. Questo saggio sarebbe adatto per indagare i meccanismi che regolano la trasduzione dcEF in motilità cellulare attraverso l&#39;uso di topi transgenici o knockout, brevi RNA interferenti, o agonisti dei recettori specifici / antagonisti.

Analisi cinematica rivela che in presenza di un mV / mm 250 dcEF, NPCs indifferenziate esporre galvanotaxis altamente orientati e rapido verso il catodo (figura 5A, Movie 1). In assenza di un dcEF, movimento casuale delle cellule si osserva (figura 5B, Movie 2). A questa forza di campo,&gt; 98% di NPCs indifferenziate migrare per l&#39;intero 6-8 hr per cui essi vengono esposte, e poiché le cellule morte non migrano questo suggerisce che essi rimangono vitali durante questo periodo, in ...

In questo protocollo si dimostra come costruire camere personalizzate che consentono l&#39;applicazione di un campo di corrente elettrica diretta a consentire time-lapse imaging del cervello adulto derivato neurale traslocazione cellula precursore durante galvanotaxis.

Un test Galvanotaxis Analisi della Cinetica precursori neurali migrazione cellulare in un campo applicato esternamente diretto Corrente elettrica

The discovery of neural stem and progenitor  cells (collectively termed neural precursor cells) (NPCs) in the adult  mammalian brain has led to a body of ...

L'obiettivo generale di questa procedura è visualizzare la migrazione di cellule precursori neurali derivate da adulti in presenza di un campo elettrico in corrente continua. Questo risultato si ottiene isolando e coltivando prima le cellule precursori neurali della zona subependimale del topo adulto. Il passaggio successivo consiste nel preparare le camere Galvan Axxis e trasferire le cellule precursori neurali sulle camere.L'ultimo passaggio consiste nell'applicare un campo elettrico a corrente continua attraverso la camera Galvan Axxis ed eseguire un'acquisizione con microscopia a intervalli per osservare la migrazione dei precursori neuronali. In definitiva, la microscopia a intervalli cattura le proprietà galvanotattiche dei precursori neuronali nei loro stati differenziato e indifferenziato. Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sul galvanotassi delle cellule precursori neuronali, può essere applicato anche ad altri sistemi, come un modello di ictus murino per il reclutamento dei precursori neuronali verso siti di lesione al fine di potenziare la riparazione neuronale.La procedura sarà dimostrata da Rob Pilley Post, uno studente laureato del mio laboratorio. Quando

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Abbiamo dimostrato che l'espressione dei recettori più fattore di crescita epidermico (EGFR) aumenta la motilità delle cellule staminali neurali (NSC) utilizzando un nuovo gel dispositivo basato microfluidica. Questa tecnologia può essere facilmente adattabile ad altri sistemi cellulari di mammifero, dove le fonti di cellule sono scarse, come le cellule staminali neurali, e il girarsi tempo è critico.

Valutare motilità delle cellule staminali neurali L&#39;utilizzo di un gel a base di Agarose dispositivo a microfluidi

Questo protocollo vengono utilizzati dei metodi utilizzati per stabilire gli ambienti 2D e 3D in custom-designed camere electrotactic, che permette di monitorare le...

Di campo elettrico controllato migrazione diretta di cellule progenitrici neurali in ambienti 2D e 3D

I ricercatori possono innescare un movimento su richiesta in C. elegans applicando un campo elettrico che i vermi percepiscono e a cui rispondono. Questo video introduce il comportamento elettrotattico e mostra un protocollo campione che viene eseguito in un dispositivo microfluidico.

Saggio di elettrotassi: un metodo per osservare la locomozione in C. elegans

Un metodo di micro-elettro-fluidico semiautomatico per indurre on-demand locomozione...

Electrotaxis microfluidica-based per On-demand analisi quantitativa della<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; &#39;Locomotion

Migrazione neuroblasti è un evento fondamentale nella neurogenesi postnatale. Descriviamo un protocollo per l'etichettatura efficiente dei neuroblasti di elettroporazione in vivo postnatale e la successiva visualizzazione della loro migrazione utilizzando time-lapse imaging di fette di cervello acuto. Includiamo una descrizione per l'analisi quantitativa delle dinamiche neuroblasti di monitoraggio video.

In vivo postnatale elettroporazione e Time-lapse imaging di migrazione neuroblasti in mouse acuta Fette cervello

Presentiamo un metodo per applicare un campo elettrico fisiologico alle cellule prostatiche immortalizzate in migrazione in una camera di galvanotassi fatta su misura. Utilizzando questo metodo, dimostriamo che 2 linee di cellule prostatiche non tumorigeniche dimostrano diversi gradi di direzionalità della migrazione sul campo.

Utilizzando a disegno Galvanotaxis Chambers per studiare la migrazione direzionale di cellule della prostata

Molti dispositivi microfluidici sono stati sviluppati per l'uso nello studio dell'elettrotassi. Tuttavia, nessuno di questi chip consente lo studio efficiente degli effetti simultanei della chimica e del campo elettrico (EF) sulle cellule. Abbiamo sviluppato un dispositivo a base di polimetilmetacrilato che offre una stimolazione chimica e EF coesistente meglio controllata per l'uso nella ricerca sull'elettrotassi .

Electrotaxis Studi di polmone cellule tumorali usando un Multicanale Dual-campo elettrico Microfluidic Chip

Le forze meccaniche sono importanti per controllare la migrazione cellulare. Questo protocollo dimostra l'uso di idrogel elastici che possono essere deformati utilizzando una micropipetta di vetro e un micromanipolatore per stimolare le cellule con un gradiente di rigidità locale per suscitare cambiamenti nella struttura cellulare e nella migrazione.

Analisi A singola cella Durotaxis per valutare il controllo meccanico del movimento cellulare e gli eventi di segnalazione correlati

Vi presentiamo tre semplici saggi in vitro: il saggio di migrazione a lunga distanza, il saggio di co-cultura sulla migrazione e l'analisi chemio-attrazione-che valutano collettivamente le funzioni delle cellule staminali umane derivate cellule endoteliali periventricolari e le loro interazione con gli interneuroni GABAergic.

Migrazione, chemio-attrazione, e analisi co-cultura per le cellule endoteliali derivate da cellule staminali umane e neuroni GABAergic

In questo studio, presentiamo un protocollo per la differenziazione delle cellule staminali neurali e progenitrici (NPC) indotte esclusivamente dalla stimolazione dell'impulso a corrente continua (DC) in un sistema microfluidico.

Differenziazione delle cellule precursori neurali indotte dal campo elettrico nei dispositivi microfluidici

Scopri la galvanotassi dei precursori neurali derivati dal cervello adulto utilizzando campi elettrici diretti e imaging time-lapse. Questo metodo permette di studiare la migrazione cellulare per applicazioni in neuro-riparazione.

Un test Galvanotaxis Analisi della Cinetica precursori neurali migrazione cellulare in un campo applicato esternamente diretto Corrente elettrica (Video) | JoVE Journal

Un test Galvanotaxis Analisi della Cinetica precursori neurali migrazione cellulare in un campo applicato esternamente diretto Corrente elettrica

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