Un test Galvanotaxis Analisi della Cinetica precursori neurali migrazione cellulare in un campo applicato esternamente diretto Corrente elettrica

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di visualizzare la migrazione di cellule precursori neurali adulte derivate in presenza di un campo elettrico a corrente continua. Ciò si ottiene isolando e coltivando prima le cellule precursori neurali subependimali dal topo adulto. Il passo successivo consiste nel preparare le camere Galvan Axxis e trasferire le cellule precursori neurali sulle camere.

Il passo finale consiste nell'applicare un campo elettrico in corrente continua attraverso la camera Galvan Axxis ed eseguire l'imaging time-lapse per osservare la migrazione dei neuroprecursori. In definitiva, la microscopia di imaging time-lapse cattura le proprietà tattiche di Galvan dei precursori neuro nei loro stati differenziati e indifferenziati. Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sull'oasi galvana delle cellule neuroprecursori, può essere applicato anche ad altri sistemi, come un modello di ictus murino per il reclutamento di precursori neuro nei siti delle lesioni per migliorare la riparazione neuronale.

A dimostrare la procedura sarà Rob Pilley Post, uno studente laureato del mio laboratorio. Quando iniziano questa procedura, le NPC devono essere state in coltura per sette giorni, in modo che le neurosfere primarie fluttuanti siano pronte per il raccolto. Quando necessario, iniziare a preparare tre camere Galvan Axxis posizionando tre bicchieri quadrati.

Numero uno, vetrini coprioggetti in una bottiglia di acido cloridrico normale durante la notte. Il giorno successivo, all'inizio del giorno successivo, prepara il gel matra a scongelare lentamente con ghiaccio. Dopo quattro ore, sarà pronto per l'uso per costruire la camera.

Per prima cosa, usa un tagliavetro a punta di diamante per tagliare sei strisce rettangolari di vetro da un nuovo quadrato. Numero uno, i vetrini di copertura. Trasferire le barbottine quadrate e rettangolari lavate con acido in una cappa a flusso laminare.

Lavare le strisce di vetro con etanolo al 70% seguito da acqua per autoclave per colture tissutali. Lasciarli asciugare all'aria o asciugarli su carta priva di lanugine. Quindi, applicare il grasso sottovuoto sul perimetro di una superficie di ogni vetrino quadrato e sigillarli alla base di plastica da 60 millimetri.

Piastre di Petri. Applicare il grasso sottovuoto su un lato delle strisce di vetro rettangolari e sigillarle ai bordi opposti del quadrato. Scivoli in vetro per creare dei quadrati con una mangiatoia centrale al centro di ogni piatto.

Sterilizzare UV questi quadrati o camere di vetro modificati per almeno 15 minuti in una cappa. Quindi pipettare da 250 a 300 microlitri di poliolo lisina sul trogolo centrale delle camere. Quindi incubare le camere a temperatura ambiente per due ore, circa 15 minuti prima della fine dell'incubazione.

Preparare la soluzione di matri gel dopo due ore, aspirare la poliolidi lisina e lavare le vasche centrali con un millilitro di acqua in autoclave. Quindi pipettare da 250 a 300 microlitri di soluzione di gel Matri sulle depressioni centrali e incubare le camere a 37 gradi Celsius per un'ora. Dopo l'incubazione, aspirare la soluzione di matrigel.

Quindi lavare delicatamente le vasche centrali con uno o due millilitri di SFM. Pipettare ora 100 microlitri di E-F-H-S-F-M o F-B-S-S-F-M sui canali centrali in preparazione per le cellule in coltura. Quindi, pipettare da quattro a cinque millilitri della sfera neuros contenente la coltura in una nuova capsula di Petri da 60 millimetri.

Quindi posizionare la capsula di Petri sul tavolino del microscopio di conteggio sotto l'obiettivo di visualizzazione cinque x. Utilizzare una pipetta P 10 per trasferire delicatamente da cinque a otto neurosfere intere sulla depressione centrale di ciascuna camera. Fino a quattro.

Le neurosfere possono essere trasferite immediatamente, ma non le dissociano con le neurosfere nelle depressioni centrali. Distribuirli con cura senza interrompere il substrato matrigel. Quindi aggiungere altri 150 microlitri di E-F-H-S-F-M o F-B-S-S-F-M sulle vasche centrali.

Ora la coltura, le cellule in un incubatore umidificato. Dopo 17-20 ore di cultura, gli NPC indifferenziati saranno disponibili dopo 69-72 ore. Nella cultura, saranno disponibili PNG differenziati.

Al microscopio contabile, selezionare la camera con le migliori cellule per l'analisi della migrazione dell'imaging di cellule vive. Le cellule dovrebbero essere rotonde, quasi completamente dissociate dalle loro neurosfere e non hanno ancora, o hanno appena iniziato, a formare processi in un cappuccio. Preparare un coperchio della camera.

Lavare un vetrino quadrato con etanolo al 70%, quindi con acqua autoclavata e applicare una striscia di grasso sottovuoto su due bordi paralleli. Ora copri la camera. Per prima cosa, aspirare il terreno di coltura dalla vasca centrale, quindi sigillare rapidamente il coperchio, infilarlo sulle pareti rettangolari come un tetto.

Quindi, utilizzando l'azione capillare, caricare 100 microlitri di terreno fresco nella vasca centrale. Ora usa il grasso sottovuoto per creare bordi per pool di terreni di coltura. Su ciascuna estremità della depressione centrale del sistema di imaging delle cellule vive, sono state preparate provette di gel agros, elettrodi di argento, cloruro d'argento e due piastre di Petri da 60 millimetri da utilizzare.

Come serbatoi di terreno di coltura, lasciare riposare le camere all'interno dell'ambiente a 37 gradi Celsius al 5% di anidride carbonica per 20-30 minuti. Durante questo periodo, preparare i coperchi delle due piastre di Petri vuote e il coperchio della capsula di Petri Galvan Axxis chambers praticando dei fori con un Dremel o una pipetta per attrezzi, da 1,5 a due millilitri di terreno su entrambi i lati della vasca centrale e aggiungere da sette a otto millilitri di SFM in ciascuna piastra di Petri vuota. Posizionare una capsula di Petri su ciascun lato del canale centrale della camera e posizionare un elettrodo in ciascuna piastra.

Colma lo spazio tra la camera e le piastre di Petri per stabilire la continuità elettrica. Con i ponti in gel Agros, collegare gli elettrodi a un'alimentazione esterna con un misuratore M in serie per misurare la corrente elettrica e accendere l'alimentazione. Utilizzare un volumemetro per misurare l'intensità del campo elettrico direttamente attraverso il trogolo centrale.

Regolare l'uscita dell'alimentatore secondo necessità. Avviare ora il modulo time-lapse sul sistema di imaging. Nel software di visione Axio selezionare l'acquisizione multidimensionale e fare clic su visualizza.

Per i canali, selezionare il canale sei, fare clic su T per time lapse. Impostare le impostazioni dell'intervallo time-lapse su un minuto, impostare la durata su otto ore nelle impostazioni prima, dopo i campi del punto temporale, selezionare il punto temporale prima e dopo. Ora fai clic su Avvia e consenti l'esecuzione dell'esperimento per il periodo di tempo desiderato dopo il completamento del saggio, continua con l'analisi IHC.

L'analisi cinematica ha rivelato che in presenza di un DCEF indifferenziato di 250 millivolt per millimetro le NPC esibiscono, axxis galvarie altamente dirette e rapide verso il catodo a questa intensità di campo, oltre il 98% delle NPC indifferenziate migrate per tutte le sei-otto ore per le quali sono state riprese. In assenza di A-D-C-E-F. È stato osservato un movimento casuale delle cellule.

Poiché le cellule morte non migrano, ciò suggerisce che rimangono vitali durante questo periodo. In assenza o presenza di A-D-C-E-F, i fenotipi differenziati hanno subito una migrazione trascurabile, sia in presenza che in assenza di sottogruppi di cellule differenziate A-D-C-E-F. Processi estesi che tendevano ad allinearsi perpendicolarmente alla direzione del DCEF, ma non è stata osservata alcuna traslocazione evidente del corpo cellulare.

L'immunocolorazione ha verificato che le NPC mantenevano un'espressione positiva del nido del marcatore precursore neurale dopo sei ore di esposizione a DC EF. Nei saggi che coinvolgono NPC indotte a differenziarsi in fenotipi maturi, la maggior parte delle cellule esprime il marcatore astrocitario maturo proteina acida fibrillare gliale o GFAP dopo sei ore di esposizione al DCEF. Seguendo questa procedura, è possibile acquisire informazioni sui meccanismi cellulari coinvolti nella trasduzione del campo elettrico in corrente continua in motilità cellulare utilizzando modelli genetici knockout.

O signore, ad esempio.