Elettricità-Free, Nucleic Acid sequenziale e isolamento delle proteine

L'obiettivo generale di questa procedura è isolare acidi nucleici pronti per la PCR e proteine immunoreattive da un campione, senza la necessità di elettricità o infrastrutture di laboratorio. L'isolamento degli acidi nucleici in proteine inizia mescolando il campione con guanidina e tiocianato per lisare il campione e facendo passare la miscela sul sorbente presente nella pipetta di estrazione. Dopo il quinto e ultimo passaggio sul sorbente, trasferire la miscela nel buffer di estrazione proteica e mettere da parte per isolare la proteina immunoreattiva.

Successivamente, il sorbente e gli acidi nucleici legati vengono lavati facendo passare etanolo al 95% sul sorbente. Numerose volte, il sorbente e gli acidi nucleici legati vengono quindi essiccati facendo passare aria ambiente sul sorbente per cinque minuti. L'ultimo passaggio per l'isolamento di acidi nucleici pronti per la PCR consiste nell'eluire gli acidi nucleici dal sorbente utilizzando 250 microlitri di tris o un'altra soluzione acquosa simile per l'isolamento della proteina immunoreattiva.

Dopo aver mescolato il campione e il buffer di estrazione delle proteine, utilizzare una seconda pipetta di estrazione e far passare la miscela sul sorbente per 15 volte. Il passaggio successivo consiste nel lavare il sorbente con la proteina legata facendo passare diverse volte etanolo al 95% sul sorbente. Successivamente, il sorbente e la proteina legata vengono essiccati facendo passare aria ambiente sul sorbente per cinque minuti.

L'ultimo passaggio del protocollo consiste nell'eluire la proteina dal sorbente. In definitiva, la pipetta di estrazione utilizzata in questa procedura consente l'isolamento, senza l'uso di elettricità, di acidi nucleici pronti per la PCR e proteine immunoreattive. Ciao, mi chiamo Dave Pawlowski.

Sono un ricercatore senior presso Kubrick Incorporated a Buffalo, nello stato di New York, e oggi impareremo una tecnica che permette di isolare contemporaneamente proteine e acidi nucleici in linea, senza la necessità di una centrifuga, di un vortex o di qualsiasi altra attrezzatura di laboratorio aggiuntiva. Prima della lisi del campione, assicurarsi che i campioni siano in forma liquida. Se il campione è solido, ad esempio cibo o feci, deve essere sospeso in un mezzo liquido come acqua o soluzione salina tamponata al fosfato.

Mescolare 500 microlitri del campione con 500 microlitri di tiocianato di guanidina sei molar in un tubo da 1,5 millilitri. Successivamente, premere la boccetta di una pipetta di estrazione, espellendo l'aria ambiente. Aspirare l'intero campione di un millilitro nella pipetta di estrazione sopra il materiale assorbente, permettendo alla boccetta di espandersi lentamente.

Rovesciare lo strumento di estrazione in modo che le perle di sorbente e il campione defluiscano nella bolla. Triturare le perle di sorbente con il campione all'interno della bolla, avendo cura di non espellere il campione dalla pipetta di estrazione.

Rovesciare la pipetta di estrazione ed espellere il campione nel tubo originale da 1,5 millilitro. Aspirare l'intero campione da un millilitro nella pipetta di estrazione, facendolo passare sul sorbente a velocità moderata. Avendo cura di mantenere il sorbente nel collo della pipetta di estrazione, espellere l'intero campione nel tubo da 1,5 millilitro premendo la boccetta di gomma.

Ripetere questo processo, passando il campione sul sorbente altre quattro volte per un totale di cinque passaggi. Dopo il quinto passaggio sul sorbente, espellere l'intero campione di un millilitro in quattro millilitri di buffer di estrazione delle proteine in un tubo conico da 15 millilitri. Mescolare il tubo capovolgendolo, quindi chiudere il tubo e metterlo da parte per un uso successivo.

Lavare gli acidi nucleici isolati facendo passare un millilitro di etanolo al 95% sul sorbente per tre volte, riportando l'etanolo nel suo tubo originale. Al termine del passaggio finale, ripetere il lavaggio per tre volte utilizzando un secondo millilitro di etanolo al 95%. Il passo successivo della procedura consiste nell'essiccare il sorbente; il recupero degli acidi nucleici è ottimale quando il sorbente è secco.

So che questo passaggio è noioso. Tuttavia, se completate questo passaggio nel lasso di tempo raccomandato, i vostri risultati saranno migliori. Premete e rilasciate la peretta per cinque minuti.

Fare passare aria ambiente attraverso la pipetta di estrazione per asciugare gli acidi nucleici e il letto del sorbente, quindi rimuovere l'etanolo residuo dalla punta della pipetta di estrazione. Utilizzando un fazzoletto Kim, recuperare gli acidi nucleici facendo passare 250 microlitri di triss 10 millimolare sul sorbente per cinque volte. Il buffer triss può essere sostituito con qualsiasi altra soluzione acquosa adatta, come PBS.

La soluzione risultante contiene gli acidi nucleici estratti. Per eseguire prima l'estrazione delle proteine, mescolare il campione nel buffer per l'estrazione delle proteine che era stato messo da parte, trasferendo circa due-tre millilitri di questo campione da cinque millilitri sul sorbente di una nuova estrazione. Con la pipetta, espellere l'intero campione nello stesso tubo conico da 15 millilitri, avendo cura di mantenere il sorbente nel collo della pipetta di estrazione.

Ripetere questo processo, passando il campione sul sorbente per 15 volte. Lavare il sorbente e la proteina legata passando un millilitro di etanolo al 95% sul letto di sorbente per tre volte, quindi espellere l'etanolo nel suo tubo originale e lavare altre tre volte utilizzando un secondo millilitro di etanolo al 95%.

Il passo successivo della procedura consiste nell'essiccare nuovamente il sorbente. Come per gli acidi nucleici, il recupero delle proteine avviene meglio quando il sorbente è secco. Per un periodo di tempo più lungo.

Premere e rilasciare la pompetta per cinque minuti, facendo passare aria ambiente attraverso tutta la pipetta di estrazione. Per asciugare il letto del sorbente proteico, rimuovere con un fazzoletto di carta l'etanolo residuo dalla punta della pipetta di estrazione. Utilizzando un fazzoletto Kim, recuperare la proteina facendo passare 250 microlitri di PBS sul sorbente per cinque volte.

Il buffer PBS può essere sostituito con qualsiasi altra soluzione acquosa adatta, come il tris 10 millimolare, pH 6,8. La soluzione risultante contiene il contenuto proteico del campione. I geni della tossina shiga associati al ceppo di Escherichia coli enteroemorragica O157:H7 EDL933 sono stati amplificati mediante una procedura di estrazione di acidi nucleici e proteine utilizzando la pipetta di estrazione.

I geni della tossina Shiga, tossina Shiga uno e tossina Shiga due, si trovano su fagi batterici temperati simili a lambda e su fagi batterici difettivi sotto il controllo del promotore PR. L'attivazione della risposta SOS in E. coli porta all'induzione del profago e/o alla produzione di tossina. In questo caso, si osserva un notevole aumento dell'amplificazione del gene della tossina Shiga due quando la risposta SOS viene indotta da mitomicina C, rispetto al controllo non trattato.

Questo suggerisce l'induzione di un profago e la replicazione del genoma fagico. La proteina ottenuta dagli esperimenti di isolamento di proteine acide nucleiche descritti nel video è immunoreattiva. La frazione proteica isolata è stata applicata ai test rapidi per E. coli O157 mediante strisce per saggio immunocromatografico.

I controlli mostrano un'identificazione positiva in tutti i campioni contenenti E. coli O157 con o senza induzione della tossina Shiga, come evidenziato dalla presenza di due bande rosse. I dati mostrano anche risultati positivi per quei campioni contenenti E. coli O157 che sono stati processati per acidi nucleici e proteine utilizzando la pipetta di estrazione. Questi dati indicano che la proteina isolata da ciascun campione è immunoreattiva, inducendo quindi una risposta positiva.

La proteina isolata è adatta all'elettroforesi, come mostrato qui in un gel all'8% di acrilamide colorato con kumasi, caricato con BSA isolata dal tiocianato di gudina esamolare. Utilizzando l'estrazione, la pipettatura e il protocollo associato, la mobilità elettroforetica della proteina isolata è identica a quella dei campioni di controllo. Una volta acquisita padronanza, questa tecnica può essere eseguita in meno di 20 minuti.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una chiara comprensione di come isolare proteine e acidi nucleici dal semplice dispositivo. Grazie per aver dedicato del tempo alla visione del nostro video.