Name: Elettricità-Free, Nucleic Acid sequenziale e isolamento delle proteine (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-05-15T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 52 s
Description: Scopri un metodo senza elettricità per isolare sequenzialmente acidi nucleici pronti per PCR e proteine immunoreattive utilizzando estrazione in fase solida con guanidina tiocianato. Ideale per campi con risorse limitate.

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Finanziamenti per lo sviluppo della pipetta di estrazione è stata fornita in parte da una ricerca interna e Grant lo sviluppo assegnato a DRP.

1. Esempio di Lysis <ol><li> I campioni dovrebbero essere in forma liquida. Se il campione è solido, ad esempio per il cibo o su uno sgabello, il campione dovrebbe essere sospeso in un mezzo liquido come l&#39;acqua o tampone fosfato (PBS). </li><li> Miscelare 500 microlitri del campione con 500 microlitri di 6M guanidina tiocianato (pH 6,5) in una provetta da 1,5 ml. </li><li> Premere il bulbo di una pipetta di estrazione, espellendo l&#39;aria ambiente. </li><li> Tirare l&#39;intero 1 mL di campione nella pipetta di estrazione, il materiale assorbente, consentendo la lampadina di espandersi lentamente. </li><li> Capovolgere lo strumento di estrazione in modo tale che le perline assorbenti e scarico del campione nel bulbo. </li><li> Macinare le perline sorbente con il campione nel bulbo facendo attenzione a non espellere il campione dalla pipetta estrazione. </li></ol> 2. Acido nucleico di estrazione (figura 1, pannello A) <ol><li> Invertire la pipetta di estrazione (apertura verso il basso) ed espellere il campione nel tubo originale 1,5 mL. </li> &lt;li&gt; l&#39;intera Tirare 1 mL di campione nella pipetta di estrazione, passando sopra il sorbente, ad una velocità moderata, prestando attenzione a mantenere l&#39;assorbente nel collo della pipetta estrazione. </li><li> Espellere l&#39;intero campione nella provetta 1,5 ml premendo il bulbo. </li><li> Ripetere i punti 2.2 e 2.3, passando per il campione nel corso degli assorbenti quattro volte per un totale di 5 passaggi. </li><li> Dopo il quinto passaggio sopra l&#39;assorbente, espellere l&#39;intera 1 ml di campione in 4 ml di tampone di estrazione delle proteine ​​(in una provetta da 15 ml), chiudere il tubo, e mettere da parte per un uso successivo. </li><li> Lavare gli acidi nucleici isolati passando 1 mL di etanolo al 95% negli assorbenti tre volte, restituendo il etanolo al tubo originale sopra il passaggio finale. </li><li> Ripetere il passaggio 2,6 utilizzando un secondo 1 mL, lavaggio con etanolo al 95%. </li><li> Premere e rilasciare la lampadina per 5 minuti, passare aria ambiente per tutta la pipetta di estrazione per asciugare gli acidi nucleici / letto assorbente. Pulire l&#39;etanolo residuo dalla punta della pipetta di estrazione ucantare una Kimwipe. </li><li> Recuperare gli acidi nucleici passando 250 pl di 10 mM Tris (pH 6,8) negli assorbenti cinque volte. Il tampone Tris può essere sostituita da qualsiasi altra soluzione appropriata acquoso come PBS. La soluzione risultante contiene gli acidi nucleici estratti. </li></ol> 3. Protein Extraction (Figura 1, Panel B) <ol><li> Mescolare il campione e l&#39;estrazione del tubo tampone proteica a partire dal punto 2,5 per inversione e passare circa due o tre millilitri di questo campione 5 mL oltre l&#39;assorbente di una pipetta nuova estrazione. </li><li> Espellere l&#39;intero campione nello stesso tubo conico 15mL prestando attenzione a mantenere l&#39;assorbente nel collo della pipetta estrazione. </li><li> Ripetere i punti 3.1 e 3.2, passando per il campione nel corso degli assorbenti 15 volte. </li><li> Lavare il sorbente e la proteina legata passando 1 mL di etanolo al 95% sopra il letto sorbente tre volte, espellendo l&#39;etanolo in esso il tubo originale. </li><li> Ripetere il passaggio 3,4 utilizzando un secondo 1 mL, lavaggio con etanolo al 95%. </li><html><li> Premere e rilasciare la lampadina per 5 minuti, passare aria ambiente per tutta la pipetta di estrazione per asciugare la proteina / letto sorbente. Pulire etanolo residuo dalla punta della pipetta estrazione utilizzando un Kimwipe. </li><li> Recuperare la proteina passando 250 microlitri di PBS nel corso degli assorbenti cinque volte. Il tampone PBS può essere sostituita da qualsiasi altra soluzione appropriata acquoso come 10 mM Tris (pH 6,8). La soluzione risultante contiene il contenuto proteico del campione. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/4202/4202fig1.jpg" alt="Figura 1A" /> Figura 1. <img src="/files/ftp_upload/4202/4202fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. <img src="/files/ftp_upload/4202/4202fig3.jpg" alt="Figura 3" /> Figura 3. <img src="/files/ftp_upload/4202/4202fig4.jpg" alt="Figura 4" /> Figura 4. contenuto &quot;&gt; <img src="/files/ftp_upload/4202/4202fig5.jpg" alt="Figura 5" /> Figura 5.

<ol><li>Gupta, S. K., Keck, J., Ram, P. K., Crump, J. A., Miller, M. A., Mintz, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+data+gaps+pertaining+to+enterotoxigenic+Escherichia+coli+infections+in+low+and+medium+human+development+index+countries%2C+1984-2005%5BTitle%5D)+AND+%22Epidemiology+and+Infection%22%5BJournal%5D)">Analysis of data gaps pertaining to enterotoxigenic Escherichia coli infections in low and medium human development index countries, 1984-2005.</a> Epidemiology and Infection. 136, 721-738 (2007).</li>
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</ol>

Non ci sono conflitti di interesse dichiarati.

Gli utensili e chimiche, i protocolli descritti in questa relazione rappresentano il primo esempio noto di un senza elettricità, multi-macromolecola sistema di estrazione che può essere utilizzato in campo-based, point-of-care applicazioni. Entrambi i tipi macromolecola può essere applicato a un numero di valle dispositivi diagnostici o analitica. Ad esempio, gli acidi nucleici isolati sono di qualità PCR (Figura 2 e 3), mentre la componente proteica del campione è immunoreattiva (Figura 4). L&#39;utilizzo di questo sistema di estrazione in aree limitate austere o una risorsa del mondo, potrebbe ridurre drasticamente il peso delle malattie sulle popolazioni che vi abitano. Questo sistema di estrazione potrebbe anche aiutare a programmi di sorveglianza delle malattie in tutto il mondo, fornendo un metodo efficace ma rapido e conveniente per l&#39;elaborazione del campione in luoghi austeri o remoto. Un aspetto importante del metodo di estrazione di cui sopra è chepuò essere modificato dall&#39;utente. Ad esempio, nei casi in cui la dimensione del campione è superiore o inferiore rispetto a quello iniziale (passo 500 μLs 1,2), l&#39;utente può regolare il volume dei reagenti conseguenza. Cioè, il rapporto volumetrico dei reagenti al campione deve rimanere costante mentre i volumi assoluti può essere alterato. Inoltre, le regolazioni del numero di passaggi sulla assorbente può anche essere effettuata a discrezione dell&#39;utente. Ad esempio, se un volume di campione più grande è, passare il campione sui tempi sorbente più di passi elencati (2,4 e 3,3) aumenterà la probabilità del tipo macromolecola (acido nucleico o proteina) contattare il sorbente. L&#39;aumento passaggi dovrebbero aumentare l&#39;efficienza acquisire fino a saturazione sorbente è raggiunto. Abbiamo trovato che l&#39;utensile di estrazione e chimici associati hanno alcune limitazioni, la più importante delle quali è che la chimica di estrazione delle proteine ​​è inefficiente per il recupero di altamente glicosilataproteine. Nel caso in cui la diagnostica valle bersaglio una proteina glicosilata, questo sistema non può essere ideale per l&#39;identificazione. Inoltre, i limiti superiore e inferiore di efficienza di estrazione sia per acidi nucleici o proteine ​​sono ancora determinate, e ottimizzazione è in corso per massimizzare l&#39;efficienza di recupero. L&#39;ulteriore sviluppo dello strumento sarà superare queste lacune nelle conoscenze attuali.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome del reattivo </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td></tr><tr><td> Tiocianato di guanidina </td><td> Teknova </td><td> G4000 </td></tr><tr><td> etanolo </td><td> Pharmco-Aaper </td><td> 11ACS200 </td></tr><tr><td> 2-propanolo </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 109.827-1L </td></tr><tr><td> BSA </td><td> Sigma </td><td> A-4503 </td></tr></tbody></table>

elettricità-free, nucleic acid sequenziale e isolamento delle proteine

Electricity-Free, Sequential Nucleic Acid and Protein Isolation

Patogeni tradizionali ed emergenti quali l&#39;enteroemorragica Escherichia coli (EHEC), Yersinia pestis, o prioni a base di malattie sono di notevole preoccupazione per i governi, le industrie e gli operatori sanitari in tutto il mondo. Ad esempio, EHECs, combinati con Shigella, sono responsabili della morte di circa 325.000 bambini ogni anno e sono particolarmente diffusa nel mondo in via di sviluppo in cui l&#39;identificazione di laboratorio-based, comune negli Stati Uniti, non è disponibile 1. Lo sviluppo e la distribuzione di basso costo, sul campo, point-of-care alcuni strumenti per facilitare la rapida identificazione e / o la diagnosi di agenti patogeni o marker di malattia potrebbe alterare profondamente la progressione della malattia e la prognosi del paziente. Abbiamo sviluppato uno strumento per isolare gli acidi nucleici e proteine ​​da un campione di estrazione in fase solida (SPE) senza elettricità o associati attrezzature di laboratorio 2. Le macromolecole isolato può essere usato per diagnosisis sia in un laboratorio o in avanti utilizzando campo-basati point-of-care piattaforme. È importante sottolineare che questo metodo prevede il confronto diretto di acidi nucleici e proteine ​​di dati provenienti da un non-split del campione, offre una conferma di fiducia mediante analisi genomica e proteomica. Lo strumento di isolamento utilizza lo standard industriale per fase solida isolamento degli acidi nucleici, la tecnologia BOOM, che isola gli acidi nucleici da una soluzione salina caotropico, solitamente guanidina isotiocianato, attraverso il legame al particelle a base di silice o filtri 3. CUBRC proprietaria chimica in fase solida di estrazione viene usato per purificare proteine ​​da soluzioni saline caotropici, in questo caso, da rifiuti o flusso attraverso successivo isolamento di acido nucleico 4. Con imballaggio ben caratterizzato chimiche in una piccola piattaforma, poco costoso e semplice, abbiamo generato un sistema portatile per l&#39;estrazione dell&#39;acido nucleico e proteina che può essere eseguito in uno variety di condizioni. Gli acidi nucleici isolati sono stabili e possono essere trasportati in una posizione in cui l&#39;alimentazione è disponibile per l&#39;amplificazione PCR, mentre il contenuto proteico può essere immediatamente analizzati mediante mano o altri saggi basati immunologica. La rapida identificazione di marcatori di malattia nel settore potrebbe alterare sensibilmente i risultati del paziente dirigendo il corretto svolgimento del trattamento in una fase iniziale della progressione della malattia. Lo strumento e il metodo descritto sono adatti per l&#39;uso con qualsiasi agente infettivo e offrire all&#39;utente la ridondanza di multi-macromolecola analisi di tipo contemporaneamente riducendo l&#39;onere logistico.

Isolamento degli acidi nucleici: isolati acidi nucleici sono PCR amplificabile ed esenti da contaminazione proteine. Esempio 1: Gli acidi nucleici recuperati sono adatti per l&#39;uso in applicazioni basate su PCR. Ad esempio, la Figura 2 mostra l&#39;amplificazione di geni di tossina Shiga associati enteroemorragica E. coli O157: H7 ceppo EDL-933 (ATCC # 35150) da un acido nucleico / proteina procedimento di estrazione con la pipetta di estrazione. I geni della tossina Shiga STX stx 1 e 2 sono disponibili sul temperato lambda-like batteriofago e difettoso batteriofago in questo e altri enteroemorragica E. coli sotto il controllo del promotore P R 5 6 7 8. L&#39;attivazione della risposta SOS in E. coli porta a profago induzione e / o produzione di tossina 9. Abbiamo utilizzato una versione modificata del saggio PCR multiplato da Feng et al. 11 per identificare l&#39;stx 1 e STX 2 geni in cultura e campioni delle acque reflue a spillo. Corsie A e B nella figura 2 mostrano i risultati di una amplificazione PCR di un campione di coltura non trasformato (corsia A) e un campione cultura elaborato (corsia B). Questi risultati sono praticamente identici significato vi è alcuna perdita di fedeltà negli acidi nucleici isolati o trasformati. Abbiamo poi amplificato a spillo acque reflue non trattate (corsia D) o isolati gli acidi nucleici da liquami a spillo corsie (E &amp; F). Questi dati indicano che gli acidi nucleici isolati comportato maggiore rispetto amplificazione degli acidi nucleici non-isolato da campioni spiked liquami. Abbiamo quindi concludere che sia inibitori della PCR naturalmente presenti nelle acque di scarico sono stati rimossi dopo isolamento o che gli acidi nucleici sono stati concentrati su di isolamento. Una combinazione di queste due ipotesi è anche possibile. Spettroscopia ultravioletta è stato accanto usato per dimostrare che gli acidi nucleici isolati erano relativamente liberi of proteina contaminante. Figura 3 mostra gli spettri UV di due E. coli O157: H7 estrazioni acido nucleico, isolamento con A e B isolamento, rispetto allo spettro normalizzato della coltura batterica, etichettato pre-isolamento. Gli spettri UV degli acidi nucleici isolati assomiglia spettri di pure acidi nucleici, avente un rapporto calcolato di assorbanza tra 260 nm e 280 nm avvicinano 1,8 10. Questi dati mostrano che vi è molto poco proteine ​​contaminanti nella frazione di acido nucleico recuperato usando la tecnica descritta. Isolamento delle proteine: proteine ​​recuperato dal acidi nucleici / proteine ​​esperimento di isolamento è immunoreattiva e elettroforeticamente identica alla proteina pura. Esempio 2: La frazione di proteina isolata è stata applicata alla E. RapidChek coli O157 strisce laterali di flusso saggio (SDIX, Inc.). I controlli mostrano una identificazione positiva in tutti i campioni ospitano E. coli<html> O157, con o senza induzione STX (figura 4, corsie B e C, rispettivamente). I dati in figura 4 mostrano anche risultati positivi per i campioni ospitano E. coli O157 che sono stati elaborati per acidi nucleici e proteine ​​poi con la pipetta di estrazione. Questi dati dimostrano che la proteina isolata da ogni campione è immunoreattiva innescando così una risposta positiva. Amplificazione PCR (come descritto nell&#39;Esempio 1) è stata effettuata sui campioni di proteine ​​per dimostrare che la frazione di proteina isolata era privo di contaminanti acidi nucleici. I risultati di questi esperimenti erano tutti negativi mediante elettroforesi su gel. Quindi, concludiamo che il contenuto proteico del campione è stata separata dalla contaminazione acidi nucleici. Questi risultati, preso in complesso con quelli descritti per la fase di isolamento nucleico mostra acido che gli acidi nucleici e proteine ​​contenuti sono isolati in fasi distinte di frazionamento. t &quot;&gt; Esempio 3:. La proteina isolata è adatto per elettroforesi 10 La Figura 5 illustra un coomassie macchiata gel di acrilammide 8% caricato con BSA (Figura 5, corsie A e C) e BSA isolato da 6M guanidina isotiocianato utilizzando l&#39;estrazione pipetta e associato protocollo. La mobilità elettroforetica della proteina isolata è identica a quella dei campioni di controllo. Abbiamo quindi concludere che il processo di estrazione non altera la struttura covalente della proteina isolata. <img alt="Figura 1a" src="/files/ftp_upload/4202/4202fig1A.jpg" /> Figura 1, Panel A: Rappresentazione di una tipica procedura di estrazione degli acidi nucleici Il campione viene mescolato con 6M guanidina tiocianato nella provetta campione e passato sopra l&#39;assorbente cinque volte.. Dopo l&#39;ultimo passaggio, il campione viene aggiunto al tampone di estrazione delle proteine. Gli acidi nucleici adsorbimento e legato vengono lavate due volte con etanolo. Il campione è poi libero in aria dRied e eluite dalla sorbente. <img alt="Figura 1b" src="/files/ftp_upload/4202/4202fig1B.jpg" /> Figura 1, pannello B: Rappresentazione di un tipico procedimento di estrazione delle proteine ​​Il campione miscelato con tampone isolamento delle proteine ​​dal passaggio 1, Figura 1, pannello A è passato sopra la sorbente di una pipetta seconda estrazione 15 volte.. Il resto della procedura è identico a quello del protocollo di estrazione degli acidi nucleici. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/4202/4202fig2.jpg" /> Figura 2:. Immagine negativa di un macchiato etidio bromuro di gel di agarosio Un multiplex gene della tossina Shiga 1 e 2 esperimento di amplificazione è stata eseguita utilizzando campioni di cultura (corsie A e B) o dei campioni di liquami non trattati addizionati con E. coli O157: H7 (corsie D, E e F). I campioni sono stati aggiunti direttamente a un tubo di reazione di PCR (corsie A e D), oppure i campioni sono stati elaborati usando il proces isolamentos e gli acidi nucleici estratti sono stati aggiunti al tubo di reazione di PCR (campioni B, E e F). Il protocollo PCR è una modifica di quella descritta da Feng et al 11. La nostra modifica mirata solo quelli amplificata dalla stx 1 (fascia inferiore) e stx 2 (fascia superiore) coppie di primer, abbandono tutte le altre coppie di primer. Corsia C è la scala da BioRad 1Kb. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/4202/4202fig3.jpg" /> Figura 3: risultati della spettroscopia UV E. coli O157: H7 acidi nucleici isolato con la pipetta di estrazione riportato isolati Gli acidi nucleici sono etichettati isolamento a e b isolamento.. Lo spettro UV del campione è stato anche testato prima dell&#39;estrazione dell&#39;acido nucleico ed è etichettato pre-isolamento. Gli spettri sono stati ottenuti utilizzando uno spettrofotometro Hitachi U3010 e pacchetto software associato. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/4202/4202fig4.jpg" /><br/&gt;. Figura 4: Foto a colori di strisce reattive RapidChek Il contenuto proteico dei campioni utilizzati in figura 2 è stato isolato con la pipetta di estrazione e testati per immuno-reattività con test a flusso laterale. Lanes AC sono i controlli non trasformati, che è, è stato aggiunto coltura cellulare per la striscia di test senza estrazione di acidi nucleici o di proteine. Corsia A è E. coli BL21 DE3 pLysS come controllo negativo, corsie B e C mostrano E. coli O157: H7 che era non trattata (B), o trattate con mitomicina C per 4 ore (C). Lanes D attraverso H mostrano i risultati di aggiunta della proteina estratta per le strisce di prova di flusso laterali. Lanes D ed E sono stati sondati utilizzando estratti proteici da E. coli BL21 DE3 pLysS o senza (D) o trattamento con mitomicina C (E) come controlli negativi. Lanes FH mostrano i risultati quando le proteine ​​estratte da E. coli O157: H7 è stato utilizzato. La proteina è stata estratta da non trattata (F), o da 2 ore (G) o 4 ore (H) mitomicina C colture trattate.Risultati positivi producono una doppia linea rossa. <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/4202/4202fig5.jpg" /> Figura 5:. Fotografia di uno colorato con Coomassie SDS-PAGE BSA è stato isolato dalla soluzione mediante la pipetta estrazione e protocolli descritti. Corsie A e C sono corsie di controllo di 250 ug / ml e 500 pg / ml, rispettivamente. Corsie B e D rappresentano BSA recuperato da soluzioni contenenti le stesse concentrazioni rispettivi controlli.

Uno strumento e chimici sono descritti per isolare sequenzialmente acidi nucleici seguite da proteine ​​da un campione senza la necessità di energia elettrica. Lo strumento consiste in un assorbente tenersi entro una pipetta di trasferimento, mentre le caratteristiche chimiche di isolamento si basano su una solida fase di estrazione dei principi. Le macromolecole isolati possono essere analizzati mediante saggi immuno-based e basato su PCR.

Elettricità-Free, Nucleic Acid sequenziale e isolamento delle proteine

Patogeni tradizionali ed emergenti come l'Escherichia coli enteroemorragico (EHEC), Yersinia pestis o le malattie da prioni sono oggetto di significativa preoccupazione...

L'obiettivo generale di questa procedura è isolare acidi nucleici pronti per la PCR e proteine immunoreattive da un campione, senza la necessità di elettricità o infrastrutture di laboratorio. L'isolamento degli acidi nucleici dalle proteine inizia mescolando il campione con guanidina e tiocianato per lisare il campione e facendo passare la miscela sul sorbente presente nella pipetta di estrazione. Dopo il quinto e ultimo passaggio sul sorbente, trasferire la miscela nel buffer di estrazione proteica e metterla da parte per isolare la proteina immunoreattiva.Successivamente, il sorbente e gli acidi nucleici legati vengono lavati facendo passare etanolo al 95% sul sorbente. Numerose volte, il sorbente e gli acidi nucleici legati vengono quindi essiccati facendo passare aria ambiente sul sorbente per cinque minuti. L'ultimo passaggio per l'isolamento di acidi nucleici pronti per la PCR consiste nell'eluire gli acidi nucleici dal sorbente utilizzando 250 microlitri di tris o un'altra soluzione acquosa simile per l'isolamento della proteina immunoreattiva.Dopo aver mescolato il campione e il buffer di estrazione delle proteine, utilizzare una seconda pipetta di estrazione e far passare la miscela sul sorbente per 15 volte. Il passaggio successivo consiste nel lavare il sorbente con la proteina legata facendo passare diverse volte etanolo al 95% sul sorbente. Successivamente, il sorbente e la proteina legata vengono essiccati facendo passare aria ambiente sul sorbente per cinque minuti.L'ultimo passaggio del protocollo consiste nell'eluire la proteina dal sorbente. In definitiva, la pipetta di estrazione utilizzata in questa procedura consente l'isolamento, senza l'uso di elettricità, di acidi nucleici pronti per la PCR e di proteine immunoreattive. Ciao, mi chiamo Dave Pawlowski.Sono un ricercatore senior presso Kubrick Incorporated a Buffalo, nello stato di New York, e oggi impareremo una tecnica che permette di isolare contemporaneamente proteine e acidi nucleici in linea, senza la necessità di una centrifuga, di un vortex o di qualsiasi altra attrezzatura di laboratorio aggiuntiva. Prima della lisi del campione, assicurarsi che i campioni siano in forma liquida. Se il campione è solido, ad esempio cibo o feci, deve essere sospeso in un mezzo liquido come acqua o soluzione salina tamponata al fosfato.Mescolare 500 microlitri del campione con 500 microlitri di tiocianato di guanidina sei molar in un tubo da 1,5 millilitri. Successivamente, premere la boccetta di una pipetta di estrazione, espellendo l'aria ambiente. Aspirare l'intero campione di un millilitro nella pipetta di estrazione sopra il materiale assorbente, permettendo alla boccetta di espandersi lentamente.Rovesciare lo strumento di estrazione in modo che le perle di sorbente e il campione defluiscano nel bulbo. Triturare le perle di sorbente con il campione all'interno del bulbo, avendo cura di non espellere il campione dalla pipetta di estrazione.Rovesciare la pipetta di estrazione ed espellere il campione nel tubo originale da 1,5 millilitro. Aspirare l'intero campione da un millilitro nella pipetta di estrazione, facendolo passare sul sorbente a velocità moderata. Avendo cura di mantenere il sorbente nel collo della pipetta di estrazione, espellere l'intero campione nel tubo da 1,5 millilitro premendo la boccetta di gomma.Ripetere questo processo, passando il campione sul sorbente altre quattro volte per un totale di cinque passaggi. Dopo il quinto passaggio sul sorbente, espellere l'intero campione di un millilitro in quattro millilitri di buffer per l'estrazione delle proteine in un tubo conico da 15 millilitri. Mescolare il tubo capovolgendolo, quindi chiudere il tubo e metterlo da parte per un uso successivo.Lavare gli acidi nucleici isolati passando un millilitro di etanolo al 95% sul sorbente tre volte, riportando l'etanolo nel suo tubo originale. Dopo il passaggio finale, ripetere il lavaggio tre volte utilizzando un secondo millilitro di etanolo al 95%. Il passo successivo della procedura consiste nell'essiccare il sorbente; il recupero degli acidi nucleici è ottimale quando il sorbente è secco.So che questo passaggio è noioso. Tuttavia, se completate questo passaggio nel periodo di tempo raccomandato, i vostri risultati saranno migliori. Premete e rilasciate la lampadina per cinque minuti.Fare passare aria ambiente attraverso la pipetta di estrazione per asciugare gli acidi nucleici e il letto del sorbente, quindi rimuovere l'etanolo residuo dalla punta della pipetta di estrazione. Utilizzando un fazzoletto Kim, recuperare gli acidi nucleici facendo passare 250 microlitri di tris 10 millimolare sul sorbente per cinque volte. Il buffer tris può essere sostituito con qualsiasi altra soluzione acquosa adatta, come PBS.La soluzione risultante contiene gli acidi nucleici estratti. Per eseguire prima l'estrazione delle proteine, mescolare il campione nel buffer per l'estrazione delle proteine che era stato messo da parte, trasferendo circa due-tre millilitri di questo campione da cinque millilitri sul sorbente di una nuova estrazione. Con la pipetta, espellere l'intero campione nello stesso tubo conico da 15 millilitri, avendo cura di mantenere il sorbente nel collo della pipetta di estrazione.Ripetere questo processo, passando il campione sul sorbente per 15 volte. Lavare il sorbente e la proteina legata passando un millilitro di etanolo al 95% sul letto di sorbente per tre volte, quindi espellere l'etanolo nel suo tubo originale; effettuare altri tre lavaggi utilizzando un secondo millilitro di etanolo al 95%.Il passo successivo della procedura consiste nell'essiccare nuovamente il sorbente. Come per gli acidi nucleici, il recupero delle proteine avviene in modo ottimale quando il sorbente è essiccato. Per un periodo di tempo più lungo.Premere e rilasciare la peretta per cinque minuti, facendo passare l'aria ambiente attraverso tutta la pipetta di estrazione. Per asciugare il letto del sorbente proteico, rimuovere l'etanolo residuo dalla punta della pipetta di estrazione. Utilizzando un fazzoletto Kim, recuperare la proteina facendo passare 250 microlitri di PBS sul sorbente per cinque volte.Il tampone PBS può essere sostituito con qualsiasi altra soluzione acquosa adatta, come il tris 10 millimolare, pH 6,8. La soluzione risultante contiene il contenuto proteico del campione. I geni della tossina shiga associati al ceppo di Escherichia coli enteroemorragica O157:H7 EDL933 sono stati amplificati mediante una procedura di estrazione di acidi nucleici e proteine utilizzando la pipetta di estrazione.I geni della tossina Shiga, tossina Shiga uno e tossina Shiga due, si trovano su fagi batterici temperati simili a lambda e su fagi batterici difettivi sotto il controllo del promotore PR. L'attivazione della risposta SOS in E. coli porta all'induzione del profago e/o alla produzione di tossina. In questo caso, si osserva un notevole aumento dell'amplificazione del gene della tossina Shiga due quando la risposta SOS viene indotta da mitomicina C, rispetto al controllo non trattato.Questo suggerisce un'induzione del profago e la replicazione del genoma fagico. La proteina recuperata dagli esperimenti di isolamento di proteine acide nucleiche descritti nel video è immunoreattiva. La frazione proteica isolata è stata applicata ai test rapidi per E. coli O157 mediante strisce per saggio immunocromatografico.I controlli mostrano un'identificazione positiva in tutti i campioni contenenti E. coli O157 con o senza induzione della tossina Shiga, come evidenziato dalla presenza di due bande rosse. I dati mostrano anche risultati positivi per i campioni contenenti E. coli O157 che sono stati processati per acidi nucleici e proteine utilizzando la pipetta di estrazione. Questi dati indicano che la proteina isolata da ciascun campione è immunoreattiva, inducendo quindi una risposta positiva.La proteina isolata è adatta all'elettroforesi, come mostrato qui in un gel all'8% di acrilamide colorato con kumasi, caricato con BSA isolata dal tiocianato di gudina esamolare. Utilizzando l'estrazione, la pipettatura e il protocollo associato, la mobilità elettroforetica della proteina isolata è identica a quella dei campioni di controllo. Una volta acquisita padronanza, questa tecnica può essere eseguita in meno di 20 minuti.Dopo aver visto questo video, dovresti avere una chiara comprensione di come isolare proteine e acidi nucleici dal semplice dispositivo. Grazie per aver dedicato il tuo tempo alla visione del nostro video.

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