Name: Facilitare Drug Discovery: un sistema automatico di alta Tenore infiammazione in Zebrafish (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-07-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 50 s
Description: Scopri un metodo automatizzato di screening ad alto contenuto per identificare composti immunomodulatori usando larve di zebrafish. Questa tecnica consente l'analisi in tempo reale delle risposte infiammatorie.

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<p class="jove_content"&gt; Ringraziamo Nadiesda Wolf, Nadine Eschen e Susanne Delong per l&#39;allevamento degli animali eccellente. CW è stato sostenuto da una borsa di studio di dottorato dal programma Helmholtz &#39;<em&gt; BioInterfaces</em&gt; Internazionale di diploma di scuola &#39;(BIFIGS). Ulteriore supporto è stato fornito da un KIT-RISC e da una borsa Marie Curie Internazionale reinserimento sovvenzione nell&#39;ambito del 7 ° programma quadro della Comunità europea (PIRG07-GA-2010-267552) al CG. AHS è stata sostenuta da BOLD (Biologia del fegato e dello sviluppo del pancreas e malattie) - Network Marie Curie Initial Training (238.821). UL è stata sostenuta da Dopaminet 7 ° PQ (Settimo Programma Quadro) (223.744).</p&gt;

1. Animal Handling Per il saggio Chin uso 3 larve dpf derivante da accoppiamenti di gruppo tra omozigote doppio transgenico cldnB :: GFP / lysC :: DsRED2 e AB (wild-type) i pesci. Raccogliere embrioni di riproduzione naturale e sollevarle a 29 ° C in terreno E3 (5 mM NaCl, 0,17 mM KCl, 0,33 mM CaCl 2, 0,33 mM MgSO 4, 0,1% e blu di metilene, equilibrata a pH 7,0) in piastre di Petri. È essenziale mantenere una densità di embrioni non superiore a 50-70 per piastra. 2. Larva Ordinamento Controllare tutte le larve sotto uno stereoscopio a fluorescenza per l&#39;espressione reporter fluorescente, infiammazione spontanea e lo sviluppo appropriato all&#39;età correlati. 3. Screening Preparazione Medium (Preparare sempre fresco) Preparare un mezzo E3 senza il blu di metilene integrato con DMSO (1% finale) e MS222 (0,05 g / l). 4. CuSO4Preparazione (Preparare sempre fresco) Prima pesare CuSO 4 (M r = 159,6 g / mol) e preparare una soluzione stock 20 mM in dH 2 O. Preparare 120 pM CuSO 4 soluzione di lavoro (da 20 mM soluzione stock) in E3/DMSO (1%) / MS-222. Proteggere CuSO 4 soluzione dalla luce. 5. 384 ben Preparazione Plate (Greiner 384 Well Microplate) Pre-aggiungono 20 pl di E3/DMSO (1%) / MS-222 ad ogni pozzetto con una pipetta inversa. Un aumento della punta di pipetta foro è necessario per gestire gli embrioni con cura senza infliggere alcun ferimento, questo viene fatto tagliando la punta ad un foro mm 2. Trasferimento larva singolo in 74 microlitri di terreno ad ogni pozzetto (84 microlitri per controllo non trattato). Se necessario, larve orientare in una posizione laterale all&#39;interno del pozzetto usando un flessibile Eppendorf Microloader punta di pipetta (Eppendorf, 5242 956,003). Condurre tutte le seguenti fasi di manipolazione dei liquidi con un liquido robotgestione workstation per garantire un trattamento simultaneo di tutte le larve. 6. Drug Treatment Mescolare composti in lamiera di droga magazzino 5 volte pipettando su e giù. Aggiungere 16 microlitri di piastra 7.5x magazzino della droga in ciascun pozzetto e mescolare 5 volte. Regolare la posizione della punta all&#39;interno dei pozzetti per evitare lesioni delle larve ed erogare il mezzo a 10 pl / s. Mescolare mezzo in pozzetti 4 volte per garantire una distribuzione omogenea del farmaco all&#39;interno del pozzo. 7. Incubazione Incubare la piastra di screening per 1 ora a 29 ° C coperto con un foglio di alluminio per proteggere i composti così come CuSO 4 dalla luce. 8. Chemical Ferimento Aggiungere 10 pl di 120 pM CuSO 4 soluzione di lavoro a ciascun pozzetto tranne controlli negativi, mix 4 volte e incubare ancora per 1 ora a 29 ° C. 9. Lavaggio Rimuovere e scambiare 80 microlitri di me<html> dium da ogni ben due volte (con incrementi di 20 pl) per rimuovere i composti e CuSO 4. 10. Acquisizione di immagini Avviare l&#39;acquisizione delle immagini su un microscopio invertito automatico (ad esempio: Olympus scan ^ R) 90 minuti dopo il trattamento iniziale di rame. Set iniziale di z-livello in modo che neuromasti da destra e sinistra la linea laterale posteriore sono visibili. Immagine ciascun bene una volta ogni ora nella brightfield canali, Cy3 e GFP in 4 piani focali (distanza di 50 micron) con un obiettivo 4x (NA = 0,13). Ulteriori informazioni su elaborazione di immagini e dati sono disponibili su richiesta. 11. Image Processing 1. Ordinamento dei dati Le immagini Raw vengono elaborate con il nostro script personalizzato software LabView. La prima operazione della pipeline di elaborazione dell&#39;immagine è l&#39;ordinamento di immagini crude dalla cartella microscopio generato dal canale dati, e ben time-point informazioni. ove_step &quot;&gt; 2. messa a fuoco estesa Successivamente, il software crea immagini sfuocate estesa da 4 piani focali per ciascuno dei canali. 3. RGB-overlay In un ultima fase di messa a fuoco delle immagini estese dai 3 canali sono uniti per portare in una finale RGB-sovrapposizione di immagini. 4. Neuromast rilevamento automatico Uno strumento di pattern recognition (LabView IA strumento di prototipazione rapida) identifica neuromasti all&#39;interno delle immagini sovrapposte degli RGB e crea un&#39;area empiricamente definito di interesse intorno alle neuromasti. 5. Quantificazione All&#39;interno dell&#39;area empiricamente definito di interesse che circonda neuromasti feriti rosse fluorescenti (leucociti riflessa come pixel rossi) sono segnati con un conseguente lettura primaria di p ercent uno o ragione ccupied da eukocytes l (Paol). In media 95,27 ± 2,11% (FDA1) e di 95,12 ±1,56% (FDA2) di pozzetti (larve) sono stati rilevati correttamente e sono stati successivamente sottoposti a ulteriore elaborazione dei dati. L&#39;uscita dei dati grezzi (Paol per ogni neuromast rilevato) è memorizzato in un file txt e serve come ingresso dati per gli script MATLAB che elaborano i dati grezzi ulteriormente. 12. Elaborazione dei dati 1. Imaps Valutare il successo di esperimenti individuali attraverso la visualizzazione grafica del greggio Paol dati in uscita un codice di colore può essere realizzato con le cosiddette carte infiammazione (imaps) (Figura 2). Verde brillante riflette un alto indice infiammatoria iniziale, nero indica l&#39;assenza di infiammazione. Questa breve panoramica permette l&#39;identificazione rapida di esperimenti falliti, che possono poi essere esclusi da ulteriori analisi dei dati. 2. Media dei controlli Ogni piastra sperimentale contiene 320 composti che riflettono unadati singoli composti e punto per punto temporale nonché 32 controlli positivi e negativi, rispettivamente. Il controllo 32 replica viene calcolata la media e la deviazione standard viene calcolata. Per i controlli solo i punti dati entro 2 deviazioni standard sono inclusi. 3. Normalizzazione La normalizzazione viene effettuata per analisi foglio di calcolo. Il valore medio di DMSO, essendo il controllo negativo, è impostato a 0 e la massima Paol mediata per il controllo rame è impostato su 1, in modo che la differenza massima tra il controllo positivo e negativo è impostato su 1. Paol Ogni mescola è interpolati o estrapolati linearmente ai rispettivi controlli sulla piastra sperimentale. 4. Finale read-out: indice infiammatorio Dopo gli esperimenti replicati sufficienti (cioè 15) sono stati condotti, normalizzati i dati grezzi provenienti da esperimenti replicati viene calcolata la media, risultando in un finale di read-out - il infiammatoriaindice. L&#39;indice iniziale infiammatoria del controllo rame inizia al 100% per tempo-punto zero e correlato al tempo di inizio acquisizione di immagini (90 minuti dopo il trattamento iniziale di rame). 5. Monotona raccordo regressione esponenziale A causa di risoluzione della risposta infiammatoria nel corso del tempo si esegue una monotona raccordo esponenziale di regressione lineare verso l&#39;infiammazione iniziale utilizzando <img src="/files/ftp_upload/4203/4203eq1.jpg" alt="Equazione 1" /> - Uno 0 è una misura per la risposta iniziale all&#39;istante t = 0, a 1 è legato alla pendenza della grandezza nel tempo. 6. 2-D spazio grafico funzione (figura 4) Per generare lo spazio funzionalità, non-regressione lineare viene applicato a grappolo analisi divide lo spazio in funzione regioni caratteristici, consentendo così l&#39;identificazione automatizzata di candidati interessanti da diversi immuno-modulatori categorie (anti-inflammatORY, anti-risoluzione, pro-infiammatori, pro-risoluzione). Tutti i composti sono visualizzati in 2-D trama in base ai parametri a 0 e 1. 13. Gestione dei dati e archiviazione I nostri dati routine di gestione creare pagine web di visualizzare e rappresentare tali schermi di droga che forniscono una rapida panoramica dell&#39;immagine e di elaborazione dei dati dei risultati passi &#39;, così come una visione dettagliata, quando richiesto dall&#39;utente 10. Soft link ad altri pertinenti basi di dati eterogenee biologici e chimici sono integrati, nonché per fornire una preziosa risorsa per gli studi comparativi e romanzo 11. Con queste routine, adeguati standard di dati e metainformazione sono fissati per la conservazione a lungo termine di questi dati. 14. Risultati rappresentativi In uno schermo pilota abbiamo analizzato una libreria composta da 640 approvati dalla FDA noti composti bioattivi per gli effetti sui inizio, la progressione o la risoluzione di Granulocytic risposta infiammatoria. Sulla base degli effetti osservati abbiamo classificato 4 tipi di fenotipi modulatori del sistema immunitario che possono essere indicativi di diversi modi di azione: anti-infiammatori (1), anti-risoluzione (2), pro-infiammatorie (3) e pro-risoluzione (4) , che può essere descritto con i parametri di uno 0 e un 1, che derivano da un monotona non lineare raccordo regressione (AO e + ALX -) verso l&#39;infiammazione iniziale. A 0 rappresenta la grandezza della risposta infiammatoria, mentre un 1 caratterizza la pendenza della curva e quindi descrive risoluzione infiammazione. Visualizzazione tutti i composti in un 2-D plot funzione spazio (a 1 vs uno 0) permette l&#39;identificazione automatica di candidati colpiti dalle diverse categorie modulatori del sistema immunitario (Figura 3). 45 su 640 composti esercitata significativo effetto anti-infiammatorio, riducendo l&#39;indice infiammatoria iniziale al 50% o meno. All&#39;interno di this categoria abbiamo trovato 6 composti appartenenti alla classe farmacologica della non-steroidei anti-infiammatori non steroidei (FANS), confermando la validità del nostro approccio. Tuttavia, i FANS non classificato tra i più potenti farmaci anti-infiammatori. Oltre ai FANS abbiamo trovato diverse classi farmacologiche farmaci aggiuntivi come ad esempio bloccanti del recettore dell&#39;angiotensina (ARB), antibiotici e inibitori della pompa protonica. 7 composti soddisfatto i criteri di soglia definiti empiricamente per potenziali farmaci pro-risoluzione. 18 farmaci esercitato un effetto pro-infiammatorio, con conseguente esagerata reclutamento dei leucociti al neuromasti feriti rispetto ai controlli positivi. Solo 2 composti impedito tempestiva risoluzione della risposta infiammatoria. L&#39;effetto anti-infiammatorio dei candidati colpito diversi (i candidati esemplari provenienti da classi di farmaci di cui sopra farmacologiche) dalla coul schermo pilotad essere confermato in un modo dipendente dalla dose in successive saggi Chin secondari (dati non mostrati). Ripetizione di 4 potenziali pro-farmaci risoluzione non ha confermato la modalità indicata di azione esercitata nella schermata principale. 2 dei farmaci hanno un leggero anti-infiammatorie a concentrazioni più elevate (20 pM). Un terzo farmaco esibito una marginale non-dose-dipendente effetto antinfiammatorio a concentrazioni comprese farmaco 5-20 pM. Il farmaco quarto aveva alcun effetto sulla risposta infiammatoria alle concentrazioni testate. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/4203/4203fig1.jpg" /> Figura 1. Workflow del saggio Chin. Individuale compound transgenico cldnB :: GFP / lysC :: DsRED2 larve (3 dpf) sono distribuite manualmente in piastre da 384 pozzetti microtiter. I farmaci sono aggiunti contemporaneamente per ogni pozzetto usando un Compact Zephyr Workstation di gestione dei liquidi. Piastre di saggio vengono poi incubate per 1 ora a 29 ° C. Il trattamento con CuSO 4 </sub&gt; - La soluzione (10 uM concentrazione finale) per 1 ora infligge il ferimento e avvia una risposta infiammatoria acuta. Infine, soluzione di rame e la droga vengono lavati via e acquisizione delle immagini automatico viene avviato (90 minuti dopo il trattamento iniziale di rame). <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/4203/4203fig2.jpg" /> Figura 2. . Panoramica foto di immagini RAW La figura mostra le immagini crude di 4 piani focali (Z = 0 - 3) a distanza di 50 pm di canali Cy3 (a sinistra) e GFP (a destra), rispettivamente. Frecce (Z = 1,2) indicano neuromasti esemplari, punte di freccia (Z = 1,2) punto a leucociti raggruppate intorno neuromasti. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/4203/4203fig3.jpg" /> Figura 3. Mappe infiammazione (imaps) Il successo degli esperimenti individuali possono essere valutati in imaps che riflettono la risposta infiammatoria (dati grezzi) in un codice colore: verde brillante riflette un iniziale elevata inflazione<html> risposta mmatory, nero indica l&#39;assenza di infiammazione imaps a timepoint 0 (a sinistra) e time-punto 5 (a destra) mostrano chiaramente se un esperimento dovrebbe essere inclusa nella ulteriore elaborazione dei dati.. Controlli di rame (riga 13 e 24) mostrano in diverse tonalità di verde, mentre DMSO pozzetti di controllo (riga 1 e 12) appaiono in verde scuro o nero. Al momento-punto 5, l&#39;infiammazione è quasi risolto nei controlli di rame, ora indicata in tonalità di verde scuro o nero. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/4203/4203fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per ingrandire la figura</a> . <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/4203/4203fig4.jpg" /> Figura 4. 2-D trama caratteristica spazio 320 di composti di uno approvato dalla FDA libreria e rispettivi controlli. Tutti i pozzetti composti possono essere visualizzati in un 2-D trama funzione spazio sulla base dei parametri di uno 0 e 1, derivanti da un non-lineare regressione raccordo (d/4203/4203eq1.jpg &quot;alt =&quot; Equazione 1 &quot;/&gt;) verso l&#39;infiammazione iniziale. Questa trama spazio caratteristica permette l&#39;identificazione automatizzata di candidati interessanti appartenenti ad uno dei seguenti 4 immuno-modulatori categorie che possono essere indicativi dei farmaci &#39;modalità d&#39;azione:. anti-infiammatorio (1), anti-risoluzione (2), pro-infiammatorie (3) e pro-risoluzione (4) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/4203/4203fig4large.jpg" target="_blank">Clicca qui per ingrandire la figura</a> .

<ol><li>Peterson, R. T., Fishman, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discovery+and+use+of+small+molecules+for+probing+biological+processes+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Discovery and use of small molecules for probing biological processes in zebrafish.</a> Methods Cell Biol. 76, (2004).</li>
<li>Zon, L. I., Peterson, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+drug+discovery+in+the+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Drug.+Discov%22%5BJournal%5D)">In vivo drug discovery in the zebrafish.</a> Nat. Rev. Drug. Discov. 4, 35-44 (2005).</li>
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<li>Hall, C., Flores, M. V., Storm, T., Crosier, K., Crosier, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+zebrafish+lysozyme+C+promoter+drives+myeloid-specific+expression+in+transgenic+fish%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">The zebrafish lysozyme C promoter drives myeloid-specific expression in transgenic fish.</a> BMC Dev. Biol. 7, 42(2007).</li>
<li>Redd, M. J., Kelly, G., Dunn, G., Way, M., Martin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+macrophage+chemotaxis+in+vivo%3A+studies+of+microtubule+function+in+zebrafish+wound+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell.+Motil.+Cytoskeleton%22%5BJournal%5D)">Imaging macrophage chemotaxis in vivo: studies of microtubule function in zebrafish wound inflammation.</a> Cell. Motil. Cytoskeleton. 63, 415-422 (2006).</li>
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<li>Haas, P., Gilmour, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemokine+signaling+mediates+self-organizing+tissue+migration+in+the+zebrafish+lateral+line%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Chemokine signaling mediates self-organizing tissue migration in the zebrafish lateral line.</a> Dev Cell. 10, 673-680 (2006).</li>
<li>Luetjohann, D. S., Shah, A. H., Christen, M. P., Richter, F., Knese, K., Liebel, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sciencenet%27+-+towards+a+global+search+and+share+engine+for+all+scientific+knowledge%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Sciencenet' - towards a global search and share engine for all scientific knowledge.</a> Bioinformatics. 27, 1734-1735 (2011).</li>
<li>Liebel, U., Kindler, B., Pepperkok, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Harvester%27%3A+a+fast+meta+search+engine+of+human+protein+resources%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Harvester': a fast meta search engine of human protein resources.</a> Bioinformatics. 20, 1962-1963 (2004).</li>
</ol>

Non ci sono conflitti di interesse dichiarati.

<p class="jove_content"&gt; Qui vi presentiamo uno completamente automatizzato high-throughput strategia di screening che permettono di identificare i composti immuno-modulatori in un contesto animale intero. Così monitoraggio consentendo di una risposta infiammatoria acuta<em&gt; In vivo</em&gt; E in tempo reale.</p&gt;<p class="jove_content"&gt; Forniamo un protocollo da applicare zebrafish come organismo modello prezioso per la scoperta di farmaci o droghe Ricontestualizzazione sforzi, dal momento che gli effetti dei farmaci sul reclutamento dei leucociti alle ferite possono essere studiati con relativa facilità nel contesto di uno completamente funzionale sistema immunitario innato. L&#39;unico vantaggio del nostro approccio è il fatto che ferimento chimica rende manipolazione manuale larve obsoleto, permettendo così l&#39;automazione e screening in un formato ad alta capacità.</p&gt;<p class="jove_content"&gt; Inoltre, gli effetti avverse o tossici come pure forti effetti off-target può essere facilmente valutata con la proposta di set-up. La biblioteca FDA ha approvato però non contiene composti tossici alle concentrazioni di screening. Tuttavia, ci proponiamo per apparenti composti tossici per confrontare il set di dati disponibili (ad esempio fenotipo modulazione immunitaria, concentrazione del farmaco) tra i membri del presente stessa classe di sostanze farmacologiche nella libreria testato. Membri di una famiglia tossici sostanza, che esercita in caso contrario un fenotipo promettente modulatorio immunitario, potrebbe essere riesaminato a concentrazioni più basse, se necessario.</p&gt;<p class="jove_content"&gt; Noi abbiamo dimostrato la possibilità di classificare automaticamente i farmaci in base alla loro esercitata immuno-modulazione effetto. Farmaci appartenenti alla categoria di composti anti-infiammatori potrebbe essere convalidato in esperimenti indipendenti, la maggior parte dei composti che esercitano il loro effetto in un modo dipendente dalla dose. Quattro composti identificati come potenziali farmaci pro-risoluzione potrebbe quindi non lontano essere confermata come tale. Essa indica inoltre che questa categoria particolare modulatorio immune è difficile da descrivere, in quanto non esclusivamente farmaci che influenzano la risoluzione sono finora stati descritti in letteratura. Tuttavia, 3 dei 4 farmaci rianalizzato mostrato un anti-infiammatorio tendenza ad alte concentrazioni molari. Ottimizzazione dei criteri di soglia definiti empiricamente dovrebbe contribuire a ridurre il numero di falsi positivi.</p&gt;<p class="jove_content"&gt; Inoltre, la tecnica presentata offre la possibilità di essere utilizzato per l&#39;identificazione di mutazioni in geni che influenzano leucociti comportamento migratorio<sup&gt; 8</sup&gt;.</p&gt;<p class="jove_content"&gt; In conclusione, il metodo proposto può facilitare e accelerare la scoperta di nuovi farmaci o droghe repurposing sforzi da parte cedendo potenziali nuove strutture di piombo con le informazioni prontamente disponibili sulla tolleranza della droga, la tossicità, il dosaggio così come i potenziali effetti off-target. Quindi, che serve come un semplice, la strategia dei costi e risparmio di tempo nelle fasi iniziali di sviluppo del farmaco.</p

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome del reattivo </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td><td> Comments </td></tr><tr><td> Dimetilsolfossido </td><td> Carl Roth GmbH &amp; Co KG </td><td> A994.2 </td><td></td></tr><tr><td> Di rame (II) solfato anidro </td><td> Carl Roth GmbH &amp; Co KG </td><td> PO23.1 </td><td></td></tr><tr><td> FDA ha approvato libreria del medicamento </td><td> Enzo Life Sciences </td><td> BML-2841-0100 </td><td></td></tr><tr><td> 384 Piastra non vincolante, μClear </td><td> Greiner </td><td> 781906 </td><td> nero </td></tr><tr><td> Olympus scan ^ R </td><td> Olimpo </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Zephyr Compact Liquid Handling Workstation </td><td> Pinza </td><td></td><td></td></tr></tbody>
 </table>

facilitare drug discovery: un sistema automatico di alta tenore infiammazione in zebrafish

Facilitating Drug Discovery: An Automated High-content Inflammation Assay in Zebrafish

Zebrafish larve sono particolarmente suscettibili a intero animale piccola molecola 1,2 schermi a causa della loro piccola dimensione e la relativa facilità di manipolazione e di osservazione, così come il fatto che i composti possono essere semplicemente aggiunto all&#39;acqua di balneazione e sono facilmente assorbito quando somministrato in un &lt;soluzione di DMSO 1%. A causa della chiarezza ottica di larve zebrafish e la disponibilità di linee transgeniche esprimenti proteine ​​fluorescenti in leucociti, zebrafish offrono il vantaggio unico di monitoraggio una risposta infiammatoria acuta in vivo. Di conseguenza, utilizzando il pesce zebra ad alto contenuto di schermi di piccole molecole volte all&#39;individuazione di immuno-modulatori composti con alto rendimento è stato proposto 3-6, suggerendo scenari induzione infiammazione esempio scalfitture localizzate nel tessuto pinna, danni laser diretto alla superficie di tuorlo 7 embrioni o amputazione tailfin 3,5,6. Lo svantaggio principale di questi metodi, tuttavia, erail requisito di manipolazione manuale larva per indurre ferite, impedendo così elevata throughput screening. Introduzione della infiammazione indotta chimicamente (Chin) test 8 eliminati questi ostacoli. Dal momento che è ferita inflitta chimicamente il numero di embrioni che possono essere trattate allo stesso tempo è praticamente illimitata. Trattamento temporaneo di larve di zebrafish con solfato di rame induce selettivamente morte delle cellule in cellule ciliate del sistema della linea laterale e si traduce in un rapido reclutamento di granulociti neuromasti feriti. La risposta infiammatoria può essere seguita in tempo reale utilizzando composto transgenica cldnB :: GFP / lysC :: DsRED2 6,9 larve zebrafish che esprimono una proteina verde fluorescente in cellule neuromast, nonché un fluorescente rosso granulociti etichettatura proteine. Al fine di elaborare una strategia di screening che consentisse entrambe le analisi ad alta contenuti e high-throughput abbiamo introdotto robotizzato di gestione dei liquidi e MICR combinata automaticaoscopy con uno script personalizzato software sviluppato. Questo script consente una quantificazione automatica della risposta infiammatoria segnando l&#39;area occupata dalla percentuale rossi leucociti fluorescenti all&#39;interno di un&#39;area definita empiricamente circostante lese neuromasti fluorescenti verdi. Inoltre, il trattamento automatizzato dei dati, la gestione, la visualizzazione e archiviazione tutti basati su MATLAB e personalizzato sviluppato gli script Python. In breve, si introduce un sistema automatico HC / HT schermata che permette la sperimentazione di composti chimici per il loro effetto sulle inizio, la progressione o la risoluzione di una risposta infiammatoria granulocitica. Questo protocollo serve un buon punto di partenza per ulteriori analisi approfondite dei meccanismi di droga e le vie coinvolte nella orchestrazione di una risposta immunitaria innata. In futuro, possono contribuire ad identificare intollerabili effetti tossici o off-target a fasi precedenti della scoperta di nuovi farmaci e quindi ridurre i rischi ei costi procedurali per lo sviluppo di farmaci.

Qui descriviamo un romanzo ad alto contenuto di test infiammazione indotta chimicamente finalizzate alla individuazione di immuno-modulatori bioattivi. Abbiamo unito con successo la microscopia automatizzata con software sviluppati script personalizzati che consentano la quantificazione automatizzata della risposta infiammatoria, nonché ulteriore elaborazione dati, analisi, estrazione e stoccaggio.

Facilitare Drug Discovery: un sistema automatico di alta Tenore infiammazione in Zebrafish

Le larve di zebrafish sono particolarmente adatte allo screening di piccole molecole sull'intero animale1,2 a causa delle loro dimensioni ridotte e della relativa facilità di manipolazione e ...

L'obiettivo generale di questa procedura è eseguire uno screening fenotipico per identificare l'attività immunomodulatrice di composti mediante un saggio di infiammazione in vivo su pesce zebra. Questo viene realizzato innanzitutto distribuendo larve di pesce zebra in una piastra da 384 pozzetti; successivamente vengono aggiunti i composti da sottoporre a screening alle larve, consentendo la penetrazione nei tessuti.Quindi viene aggiunta una soluzione di solfato di rame per indurre danni specifici ai tessuti. Infine, i composti e il solfato di rame vengono sostituiti con mezzo fresco. In definitiva, è possibile ottenere risultati che mostrano l'entità dell'afflusso di leucociti specifico per tessuto nel tempo, attraverso l'analisi di dati di microscopia in vivo in tempo reale.Il principale vantaggio di questa tecnica è che consente l'induzione simultanea di infiammazione in centinaia di individui, permettendo così l'automazione sperimentale e analitica. A dimostrare la procedura sarà Christina Whitman, studentessa di dottorato del mio laboratorio, per il saggio del mento. Impostare accoppiamenti di gruppo tra pesci AB transgenici doppi omozigoti e selvatici, raccogliere gli embrioni mediante deposizione naturale e allevare da 50 a 70 embrioni per piastra in mezzo E3 a 29 gradi Celsius fino a tre giorni dopo la fecondazione.Esaminare tutti i larvi sotto un microscopio stereoscopico a fluorescenza per verificare l'espressione del marcatore fluorescente, l'infiammazione spontanea e lo sviluppo correlato all'età appropriato. Dopo aver preparato il mezzo di screening e averne aggiunti 20 microlitri nei pozzetti di una piastra da 384 pozzetti, trasferire un singolo larva anestetizzato in 74 microlitri di mezzo in ciascun pozzetto. Utilizzare una punta di pipetta tagliata in modo da ottenere un diametro di due millimetri, insieme a una punta microflessibile.Orientare la larva in posizione laterale all'interno della pozzetta. Eseguire tutti i successivi passaggi di manipolazione dei liquidi mediante una stazione robotizzata per la manipolazione dei liquidi, al fine di garantire un trattamento simultaneo di tutte le larve per la somministrazione del farmaco. Pipettare su e giù cinque volte per mescolare i composti in una piastra madre del farmaco. Aggiungere 16 microlitri della piastra madre del farmaco a 7,5 x nella piastra di screening e mescolare cinque volte a una velocità di 10 microlitri al secondo.Coprire la piastra di screening con della carta d'alluminio e incubarla per un'ora a 29 gradi Celsius. Per indurre un danno chimico. Aggiungere 10 microlitri di soluzione lavorativa di solfato di rame 120 micromolare a ciascuna.Aggiungere il mix dei controlli negativi quattro volte e incubare nuovamente per un'ora a 29 gradi Celsius. Lavare gli embrioni rimuovendo e sostituendo 80 microlitri di mezzo da ogni pozzetto due volte, a partire da 90 minuti. Dopo il trattamento iniziale con rame, acquisire le immagini su un microscopio automatico invertito utilizzando un obiettivo Forex.Impostare il livello Z iniziale in modo che siano visibili i neuro-massi della linea laterale posteriore destra e sinistra, e acquisire un'immagine di ogni pozzetta una volta ogni ora. Utilizzare il canale Brightfield tre e i canali GFP in quattro piani focali. Il software personalizzato di visione in laboratorio crea immagini a fuoco esteso a partire dai quattro piani focali per ciascuno dei canali.Le immagini vengono quindi unite per creare un'immagine finale sovrapposta in RGB. Uno strumento di riconoscimento dei pattern identifica i neuromi all'interno delle immagini sovrapposte in RGB e definisce empiricamente un'area di interesse attorno ai neuromi; i leucociti fluorescenti rossi che circondano i neuromi lesi vengono quantificati, fornendo come lettura primaria la percentuale di area occupata dai leucociti o dal colore pallido. In media, il 95% delle larve viene rilevato correttamente e può successivamente essere sottoposto a ulteriori elaborazioni dei dati.Il successo di singoli esperimenti viene valutato utilizzando mappe dell'infiammazione o mappe oculari. I dati pallidi sono codificati con un verde brillante, che rappresenta un elevato indice infiammatorio iniziale, mentre il nero indica l'assenza di infiammazione. Questa panoramica rapida consente l'identificazione immediata degli esperimenti falliti, che possono quindi essere esclusi da ulteriori analisi dei dati.iMaps al tempo 0,0 e al tempo 0,5 mostrano chiaramente se un esperimento debba essere incluso nell'ulteriore elaborazione dei dati. I controlli del rame appaiono in diverse sfumature di verde, mentre le pozzette di controllo con DMSO risultano verdi scuro o nere al tempo 0,5. L'infiammazione è quasi risolta nei controlli del rame, ora indicati con tonalità scure di verde o nere, da processare insieme ai controlli.I 32 replicati di controllo vengono mediati e viene calcolata la deviazione standard. Vengono inclusi solo i punti dati entro due deviazioni standard. Il valore medio del controllo negativo DMSO viene impostato a zero e il valore medio più alto di PAOL per il controllo del rame viene impostato a uno; il PAOL di ciascun composto viene interpolato o estrapolato linearmente rispetto ai controlli corrispondenti nella piastra sperimentale.I dati grezzi normalizzati provenienti da esperimenti replicati vengono mediati, producendo un valore finale di lettura: l'indice infiammatorio dovuto alla risoluzione dell'infiammazione. Nel tempo, viene effettuato un adattamento di regressione non lineare esponenziale monotona rispetto all'infiammazione iniziale. Utilizzando questa formula, in cui lo zero rappresenta la misura della risposta iniziale al tempo pari a zero e l'uno è correlato alla pendenza dell'ampiezza nel tempo per generare lo spazio delle caratteristiche, si applica una regressione non lineare e un'analisi di clustering suddivide lo spazio delle caratteristiche in regioni caratteristiche, consentendo così l'identificazione automatica di candidati interessanti appartenenti a diverse categorie di modulazione immunitaria.Tutti i parametri sono visualizzati nel grafico 2D in base ai parametri ACE di zero e ace di uno. Le procedure di gestione dei dati creano pagine web che forniscono una panoramica rapida dei risultati, oltre a una visualizzazione dettagliata richiesta dall'utente. Collegamenti simbolici ad altri database eterogenei, biologici e chimici pertinenti sono integrati anch'essi per offrire una risorsa preziosa per studi comparativi e nuovi studi da parte di queste procedure.Sono stati stabiliti appropriati standard di dati e informazioni metadatiche per l'archiviazione a lungo termine di questi dati in uno schermo pilota; è stata quindi effettuata un'analisi su una libreria di 640 composti bioattivi noti approvati dalla FDA, per valutarne l'effetto sull'insorgenza, la progressione o la risoluzione di una risposta infiammatoria granulocitica. Sulla base degli effetti osservati, sono stati classificati quattro tipi di fenotipi immunomodulatori che potrebbero indicare diversi meccanismi d'azione: anti-infiammatorio, anti-risoluzione, pro-infiammatorio e pro-risoluzione. 45 su 640 composti hanno esercitato effetti anti-infiammatori significativi, riducendo l'indice infiammatorio iniziale al 50% o meno.All'interno di questa categoria, sono stati identificati sei composti appartenenti alla classe farmacologica dei farmaci antinfiammatori effettivi. A conferma della validità di questo approccio, dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come lo screening fenotipico in vivo per l'attività di composti immunomodulatori possa essere ampiamente automatizzato, consentendo sia l'acquisizione dei dati che l'analisi in modo costante in un contesto di organismo intero.

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