Facilitare Drug Discovery: un sistema automatico di alta Tenore infiammazione in Zebrafish

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di eseguire uno screening fenotipico per identificare l'attività immunomodulatoria dei composti utilizzando un test di infiammazione del pesce zebra in vivo. Ciò si ottiene distribuendo prima la larva di pesce zebra a un 384. I composti successivi da sottoporre a screening vengono aggiunti alle larve per consentire la penetrazione nei tessuti.

Quindi viene aggiunta una soluzione di solfato di rame per infliggere danni specifici ai tessuti. Infine, i composti e il solfato di rame vengono sostituiti da un mezzo fresco. In definitiva, è possibile ottenere risultati che mostrano l'entità dell'afflusso di leucociti tessuto-specifici nel tempo attraverso l'analisi dei dati di microscopia in vivo in tempo reale.

Il vantaggio principale di questa tecnica è che consente l'induzione simultanea dell'infiammazione in centinaia di individui e quindi consente l'automazione sperimentale e analitica. A dimostrare la procedura sarà Christina Whitman, una dottoranda del mio laboratorio per il test del mento. Impostare accoppiamenti di gruppo tra pesci omozigoti, doppi transgenici e selvatici di tipo AB, raccolgono embrioni per deposizione naturale delle uova e allevano da 50 a 70 per piastra in E tre a 29 gradi Celsius a tre giorni dopo la fecondazione.

Controllare tutte le larve sotto uno stereoscopio fluorescente per verificare l'espressione del reporter fluorescente, l'infiammazione spontanea e lo sviluppo appropriato correlato all'età. Dopo aver preparato il terreno di screening e aver aggiunto 20 microlitri ai pozzetti di un pozzetto 384, trasferire la singola larva anestetizzata in 74 microlitri di terreno in ciascun pozzetto. Utilizzando un puntale per pipetta tagliato a una dimensione del foro di due millimetri con un puntale flessibile per micropipette.

Orientare la larva in posizione laterale all'interno del pozzetto Condurre tutte le seguenti fasi di manipolazione dei liquidi con una postazione di lavoro robotizzata per la manipolazione dei liquidi per garantire il trattamento simultaneo di tutte le larve per il trattamento farmacologico. Pipettare su e giù cinque volte per mescolare i composti in una piastra di riserva del farmaco. Aggiungere 16 microlitri della piastra madre del farmaco 7,5 x alla piastra di screening e mescolare cinque volte a 10 microlitri al secondo.

Coprire la piastra di vagliatura con un foglio di alluminio e incubarla per un'ora a 29 gradi Celsius. Per indurre ferite chimiche. Aggiungere 10 microlitri di soluzione di lavoro di solfato di rame da 120 micromolari a ciascuno.

Bene, accetta i controlli negativi, mescola quattro volte e incuba di nuovo per un'ora a 29 gradi Celsius. Lavare gli embrioni rimuovendo e scambiando 80 microlitri di terreno da ciascun pozzetto due volte a partire da 90 minuti. Dopo il trattamento iniziale con il rame, acquisire le immagini su un microscopio automatico invertito utilizzando un obiettivo Forex.

Impostare il livello Z iniziale in modo che la massa neurologica dalla linea laterale posteriore destra e sinistra sia visibile e visualizzare ogni pozzetto una volta all'ora. Utilizzando i canali Brightfield side three e GFP su quattro piani focali. Il software di visualizzazione da laboratorio personalizzato crea immagini con messa a fuoco estesa da quattro piani focali per ciascuno dei canali.

Le immagini vengono quindi unite per creare un'immagine finale di sovrapposizione RGB. Uno strumento di riconoscimento dei modelli identifica i neuromi all'interno delle immagini di sovrapposizione RGB e crea un'area di interesse empiricamente definita attorno ai neuromi I leucociti fluorescenti rossi che circondano i neuromi danneggiati vengono valutati, risultando in una lettura primaria dell'area percentuale occupata dai leucociti o pallida. In media, il 95% delle larve viene rilevato correttamente e può essere successivamente sottoposto a un'ulteriore elaborazione dei dati.

Il successo dei singoli esperimenti viene valutato utilizzando mappe dell'infiammazione o mappe oculari. I dati chiari sono codificati a colori con il verde brillante, che rappresenta un alto indice infiammatorio iniziale, e il nero indica l'assenza di infiammazione. Questa rapida panoramica consente di identificare rapidamente gli esperimenti falliti, che possono quindi essere esclusi da ulteriori analisi dei dati.

iMap al tempo 0,0 e al tempo 0,5 mostrano chiaramente se un esperimento deve essere incluso in un'ulteriore elaborazione dei dati. I controlli in rame si presentano in varie tonalità di verde, mentre i pozzetti di controllo DMSO appaiono in verde scuro o nero al tempo 0,5. L'infiammazione è quasi risolta nei controlli in rame, ora indicati in tonalità scure di verde o nero per elaborare i controlli.

Vengono calcolate la media delle 32 repliche di controllo e la deviazione standard. Soltanto. Sono inclusi i punti dati all'interno di due deviazioni standard. Il valore medio del DMSO del controllo negativo è impostato su zero e il PAOL medio più alto per il controllo del rame è impostato su uno. Il PAOL di ciascun composto è linearmente, interpolato o estrapolato ai rispettivi controlli sulla piastra sperimentale.

I dati grezzi normalizzati degli esperimenti replicati vengono mediati producendo una lettura finale, l'indice infiammatorio dovuto alla risoluzione dell'infiammazione. Nel corso del tempo, viene eseguito un adattamento di regressione non lineare esponenziale monotona verso l'infiammazione iniziale. Utilizzando questa formula in cui uno è la misura per la risposta iniziale al tempo uguale a zero e uno è correlato alla pendenza della grandezza nel tempo per generare lo spazio delle caratteristiche, viene applicata una regressione non lineare e un'analisi dei cluster divide uno spazio delle caratteristiche in regioni caratteristiche, consentendo così l'identificazione automatica di candidati interessanti da diverse categorie di modulatori immunitari.

Tutti i parametri vengono visualizzati nel grafico 2D in base ai parametri ACE di zero e asso di uno. Le routine di gestione dei dati creano pagine Web che forniscono una rapida panoramica dei risultati, nonché una visualizzazione dettagliata e richiesta dall'utente. Sono integrati anche collegamenti morbidi ad altri database eterogenei, biologici e chimici pertinenti per fornire una risorsa preziosa per studi comparativi e nuovi con queste routine.

Sono stati impostati standard di dati e meta informazioni adeguati per l'archiviazione a lungo termine di questi dati in uno schermo pilota, è stata eseguita un'analisi in una libreria di 640 composti bioattivi noti approvati dalla FDA per l'effetto sulla progressione di inizio o sulla risoluzione di una risposta infiammatoria granulocitica. Sulla base degli effetti osservati, sono stati classificati quattro tipi di fenotipi immunomodulatori che possono essere indicativi di diverse modalità d'azione, antinfiammatoria, anti-risoluzione, pro-infiammatoria e pro risoluzione. 45 dei 640 composti hanno esercitato effetti antinfiammatori significativi riducendo l'indice infiammatorio iniziale al 50% o meno.

All'interno di questa categoria sono stati trovati sei composti che appartenevano alla classe farmacologica dei farmaci antinfiammatori in buona fede. A conferma della validità di questo approccio, dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come lo screening fenotipico in vivo per l'attività dei composti immunomodulatori possa essere ampiamente automatizzato, consentendo sia l'acquisizione di dati coerenti che l'analisi in un contesto animale completo.