Name: Purificazione e aggregazione della proteina precursore dellamiloide dominio intracellulare (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-08-28T12:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 8 s
Description: Impara la purificazione e l'aggregazione termica del dominio intracellulare della proteina precursore dell'amiloide (AICD) utilizzando microscopia a forza atomica. Questo metodo consente l'analisi biochimica e strutturale per la ricerca sull'Alzheimer.

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Gli autori desiderano ringraziare il Dr. Hui Zheng (Baylor College of Medicine) per la APP cDNA. Questo lavoro è stato finanziato da sovvenzioni NIH R21AG031948 (DB, JMB), F30AG030878 (ESS), R01DK073394 (AFO), il John Sealy Memorial Fondo di dotazione per la ricerca biomedica (AFO), e il C. Jean e William D. Willis Neuroscience Research Endowment (ESS). JMB è uno studioso nel Programma Translational Research Scholar e membro della University of Texas Medical Branch Claude E. Independence Pepper Centro anziani americani (supportato da sovvenzioni NIH UL1RR029876 e P30-AG-024832, rispettivamente).

<html> 1. L&#39;espressione di APP ricombinante dominio intracellulare (AICD) <ol><li> Transform E. coli ceppo BL21 con AICD umana (residui 649-695 di APP, isoforma neuronale numerazione) clonato nel vettore pGEX-4T-1 (GE Healthcare). Questo vettore esprimerà AICD la porzione C-terminale di una proteina di fusione di glutatione-S-transferasi (GST). Questo vettore codifica anche una sequenza trombina clivaggio per facilitare la rimozione della porzione GST. Dettagli della clonazione AICD in pGEX-4T-1 può essere trovata nella nostra precedente pubblicazione 4. </li><li> Da una singola colonia, inoculare 10 ml di brodo LB con ampicillina (100 ug / ml), e incubare una notte a 37 ° C con agitazione vigorosa. </li><li> Il mattino seguente, inoculare 400 ml LB / ampicillina in una beuta da un litro con 5 ml di coltura durante la notte. </li><li> Incubare a 37 ° C con agitazione vigorosa fino a quando la densità ottica a 600 nm ha raggiunto 0,4-0,6. Questo normalmente 2-2,5 ore. </li></ol>contenuto &quot;&gt; A questo punto può essere desiderabile per prendere un piccolo campione (~ 10 pl) di seguire la purificazione mediante SDS-PAGE (Figura 1A, B). Ogni fase successiva purificazione deve anche avere una piccola aliquota rimossi per l&#39;analisi mediante SDS-PAGE. <ol start="5"><li> Indurre l&#39;espressione di GST-AICD aggiungendo 0,4 mM di isopropil-beta-D-tiogalattopiranoside (IPTG). Incubare a 37 ° C con agitazione vigorosa per 5 ore. </li><li> Centrifugare le cellule a 6.000 xg per 15 min a 4 ° C. Il pellet cellulare può essere conservato a -80 ° C per diversi mesi, a questo punto del procedimento. </li></ol> 2. Purificazione di GST-AICD <ol><li> Preparare 50 ml di tampone di lisi come segue: 1 mM ditiotreitolo 1 mM acido etilendiamminotetraacetico (EDTA), 0,1% Triton-X100, 1 mM fenilmetilsulfonil fluoruro (PMSF), Complete cocktail inibitore di proteasi (Roche Applied Science), e tampone fosfato. Freddo sul ghiaccio. </li><li> Scongelare pellet batterico (se precedentemente congelato) sullaghiaccio. </li></ol> A questo punto, è fondamentale che tutti i passi vengono eseguiti a 4 ° C per limitare proteolisi. Tutti i tubi, tamponi, e altri reagenti devono essere pre-refrigerati. Se si utilizza una pressa francese o emulsionante per lisi, questi dovrebbero essere pre-refrigerati pure. <ol start="3"><li> Accuratamente risospendere il pellet batterico in 20 ml di tampone di lisi. Una combinazione di vortex e triturazione con pipetta 10 ml di ghiaccio assicurerà completa risospensione del pellet. </li><li> Far passare le cellule risospese batteriche attraverso un emulsionante (ad esempio, Avestin Emulsiflex-C3) o cellule pressione francese, pre-refrigerati a 4 ° C a 30.000 psi. Passare il lisato attraverso l&#39;emulsionante una seconda volta. Raccogliere il lisato in un pre-refrigerati tubo da 50 ml. </li></ol> Il vantaggio principale di questi due strumenti è che minimizzare il riscaldamento del campione. La tecnica comunemente usata di sonicazione genera calore sulla punta della sonda sonicazione epuò causare aggregazione di proteine ​​ricombinanti. <ol start="5"><li> Centrifugare il lisato a 15.000 xg per 30 min. Separare e mantenere il supernatante in un pre-raffreddata tubo da 50 ml. </li><li> Aggiungere 500 pl di un impasto al 50% di glutatione-agarosio (Sigma-Aldrich). Ruotare per 30 min a 4 ° C. Mentre il campione sta ruotando, fanno tampone fresco eluizione: 50 mM Tris 7,8, 0,1% Triton-X100, 0,5 mM di ditiotreitolo, 10 mM glutatione ridotto. </li></ol> L&#39;unico passo del protocollo che viene eseguita a temperatura ambiente è la fase di eluizione. Così, il tampone di eluizione viene mantenuta a temperatura ambiente. Buffer di eluizione deve essere preparato fresco. <ol start="7"><li> Versare il lisato e dei liquami in un usa e getta 5 &quot;colonna polistirolo cromatografia con grossolani (90-130 micron) filtri (Evergreen scientifico). Lavare la colonna 5 volte con 3 ml di tampone fosfato. </li><li> Tappare il fondo della colonna e aggiungere 500 microlitri di tampone di eluizione temperatura ambiente. Cap all&#39;inizio dellacolonna e ruotare per 5 min a temperatura ambiente. Raccogliere l&#39;eluato in una provetta da microcentrifuga refrigerata 1,5 ml. Ripetere l&#39;eluizione altre due volte (1.5 ml eluato totale). </li><li> Dializzare l&#39;eluato in un molecolare 10000 membrana di dialisi taglio di peso (ad esempio, Thermo Scientific Slide-A-lizzatore dialisi cassette) in 4 litri di soluzione salina tamponata per una notte a 4 ° C. Dializza contro un ulteriore 4 litri di tampone fosfato a 4 ° C per 1 ora il giorno seguente. </li><li> Rimuovere la proteina dalla cassetta dialisi ed eseguire un test per determinare la quantificazione delle proteine ​​resa di GST-AICD. Una purificazione tipico da 400 ml di coltura comporta rendimenti di&gt; 20 mg di proteina purificata a concentrazioni di 10-20 mg / ml. Aliquotare la proteina in 200 pl aliquote e congelati a -80 ° C. </li></ol> 3. Cleavage trombina di GST-AICD e Purificazione di AICD <ol><li> Scongelare 200 ml di acqua di GST-AICD e aggiungere 20 ml di 1 U / mL thrombtrovi Incubare per una notte a 37 ° C. </li></ol> La qualità e la purezza della trombina varia considerevolmente tra i costruttori, e può essere una fonte di contaminazione. Usiamo trombina da GE Healthcare (vedi tabella dei reagenti). Dopo incubazione per una notte,&gt; 95% della proteina di fusione deve essere scisso (Figura 1B). <ol start="2"><li> Dopo clivaggio notte con trombina, è probabile che una frazione del AICD liberato subito aggregazione e la soluzione può apparire torbida. Cancellare il materiale aggregato mediante centrifugazione a 20.000 xg per 30 min a 4 ° C. Rimuovere il surnatante in un pre-raffreddata provetta per microcentrifuga. </li><li> Aggiungere 50 ml di 50% di glutatione-agarosio slurry e 50 pl 50% p-aminobenzamidine-agarosio slurry per rimuovere GST e trombina, rispettivamente. Incubare con rotazione per 5 min a temperatura ambiente. </li><li> Centrifugare brevemente per sedimentare le perline di agarosio, e rimuovere il surnatante in una nuova provetta. Estratto tGST ha quattro volte più con glutatione-agarosio. Una singola estrazione con p-aminobenzamidine-agarosio è sufficiente a rimuovere il 20 U di trombina. </li><li> Eseguire un test di quantificazione delle proteine, il 5 microlitri della AICD purificato. Rese tipiche di una cultura 400 ml sono 50-100 mcg ad una concentrazione di 0,2 a 0,5 mg / ml. Rese più elevate sono possibili, con l&#39;adesione più grandi volumi di GST-AICD. </li></ol> Purificato AICD deve essere preparato fresco per la caratterizzazione biochimica / biofisica. Materiale non utilizzato deve essere eliminato. È anche possibile concentrare il AICD dalla liofilizzazione del campione e la risospensione in un volume più piccolo di tampone 6. Se la rilevazione AICD richiede assorbente (ad esempio dopo una trappola filtro o saggio dot blot), il recupero antigene sulla membrana deve essere eseguita come descritto da Pimplikar e Suryanarayana 12. 4. Aggregazione AICD per microscopia a forza atomica (AFM) <ol><li> Diluire appena preparata AICD in phosphate salina tamponata ad una concentrazione di 0,1 mg / ml in un volume finale di 15 microlitri. A questo punto, vari composti e / o le proteine ​​possono essere aggiunti per determinare se essi inibiscono l&#39;aggregazione AICD. Per esempio, abbiamo dimostrato che le concentrazioni equimolari di ubiquilin-1 prevenire l&#39;aggregazione di AICD in questo test 4. </li></ol> È anche possibile aggregare grandi volumi di reazione per esperimenti biochimici come saggi trap filtrazione e diffusione della luce 4. Abbiamo avuto successo eseguendo saggi trappola filtro su miscele di reazione più grande a 400 ml con AICD diluito a concentrazioni a partire da 1 pM. <ol start="2"><li> Inducono aggregazione termica incubando i campioni a 43 ° C con agitazione a 800 rpm in un Thermomixer Eppendorf per 48 ore. Questa temperatura è stato scelto sulla base di test di chaperone che esaminano l&#39;aggregazione termica del modello citrato sintasi accompagnatore substrato 4,13. </li></ol><p class="jove_content"Aggregazione&gt; termico è un metodo comunemente usato per indurre la transizione strutturale di una proteina da un nativo a una struttura non nativo (che di solito è ricca foglietto beta) che si traduce nella formazione di aggregati intermolecolari. Aggregazione termica è anche utilizzato per esaminare la funzione di chaperone molecolare, che proteggono i segmenti idrofobi da formare appropriato interazioni intermolecolari (e quindi ritardare o prevenire l&#39;aggregazione termica). <ol start="3"><li> Diluire il campione di 20 volte in acqua deionizzata e posto su 2 microlitri mica appena spaccati. Essiccare il campione in essiccatore notte. Sarà necessario determinare empiricamente la diluizione ottimale per immagini, e quindi diluizioni diverse da 10 - a 100 volte sarebbe prudente. </li><li> Visualizza la AICD aggregato AFM utilizza il sistema operativo in tapping mode 14. I cantilever utilizzati sono leve micro oro rivestite con nitruro di taglienti (MSNL, Bruker) con un raggio di punta nominale di 2 nm. Tipica toccando ampiezze duranteing imaging sono 10-20 nm alla frequenza di risonanza del cantilever (30-50 kHz). </li></ol> Abbiamo trovato che la qualità dell&#39;immagine e il contrasto di aggregati proteici differenti dipendeva dalla forza applicata e la durata dell&#39;esperimento. Per minimizzare perturbazione campione dalla punta, abbiamo mantenuto la forza applicata relativamente basso mantenendo un set-point rapporto superiore al 95% e limitando la scansione di ogni campione per 5-10 min. L&#39;elaborazione delle immagini è stata effettuata con il software WSxM (Nanotec). Elaborazione immagine standard consisteva piano sottrazione e appiattimento. I nostri laboratori utilizzano una &quot;casa-costruita&quot; AFM 15 interfacciato ad un sistema commerciale di sonda di controllo microscopio a scansione (Nanotec). 5. Risultati rappresentativi L&#39;espressione e arricchimento relativo di GST-AICD è mostrato nella Figura 1A. Dopo lisi, la maggior parte della proteina di fusione è presente nella frazione solubile e quindi estrazione da Inclusiil corpo non è necessaria. Il materiale eluito dalla colonna di glutatione agarosio è&gt; 95% puro. Nella preparazione mostrato nella figura 1, la concentrazione di proteina eluita dalla colonna era 14,5 mg / ml, e la resa era 22 mg (da una coltura iniziale di 400 ml). Clivaggio di 200 pl di questa preparazione overnight con 20 U di trombina comportato quasi il 100% clivaggio della proteina di fusione (Figura 1B). La quantità di trombina utilizzata è sufficientemente basso da non essere rilevabile mediante colorazione con Coomassie blue (vedi corsia &quot;Cleaved&quot;, Figura 1B). Rimozione della trombina e GST provocato una perdita di materiale, tuttavia era&gt; 90% puro con una resa in questa preparazione di 70 pg di AICD ad una concentrazione di 0,35 mg / ml. Figura 1C mostra il diagramma di flusso per l&#39;aggregazione di AICD e successiva analisi. Aggregati AICD ripreso da AFM sono tipicamente sferoide / amorfo, e la gamma nel formato da 50 a 100 nM (Figura 1D, F). Aggregatomateriale non è rilevabile quando una quantità equimolare di chaperone ubiquilin-1 viene aggiunto alla reazione di aggregazione (Figura 1E) 4. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/4204/4204fig1.jpg" /> Figura 1. Purificazione e aggregazione di AICD. A) Coomassie colorazione blu di campioni raccolti in ogni fase del processo di purificazione. Per i campioni uninduced e indotta, 20 pl di batteri totali sono stati eseguiti sul gel. Per la frazione supernatante, 5 microlitri di lisato (da un volume totale di 20 ml) sono stati analizzati su gel. Per la frazione di pellet, il pellet è stato risospeso in 20 ml di tampone di lisi, e 5 microlitri di questo materiale sono stati sonicati in un sonicatore bagno di acqua per 30 minuti a 4 ° C prima di caricare il gel. Per l&#39;eluato, 5 microlitri sono stati eseguiti sul gel. Le quantità di eluato caricati sul gel sono indicati. B) Coomassie blu gel colorato di uncleaved e spaccati GST-AICD (2 ml) e 1 e 5 &amp; mu, l purificato AICD. C) Diagramma di flusso di purificazione AICD, aggregazione e analisi. D, E) Rappresentante AFM immagine termicamente aggregate AICD in assenza (D) e presenza (E) del chaperone molecolare ubiquilin-1. F) Istogramma della distribuzione delle dimensioni degli aggregati AICD.

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</ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

In questo protocollo abbiamo delineato una procedura per ottenere AICD elevata purezza per analisi strutturali, biofisica e biochimica. Questa procedura non richiede attrezzature sofisticate cromatografia ed è quindi accessibile alla maggior parte dei laboratori. Altri gruppi hanno purificato AICD 5-7,16, compreso GST-AICD 17-19, per le analisi biochimiche / strutturale. Svantaggi ai protocolli precedenti includono scarsa solubilità di AICD 16, a meno di ideale purezza 17, e l...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome del reagente </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td><td> Commenti </td></tr><tr><td> pGEX-4T-1 </td><td> GE Healthcare </td><td> 28-9545-49 </td><td></td></tr><tr><td> Trombina </td><td> GE Healthcare </td><td> 27-0846-01 </td><td></td></tr><tr><td> Ampicillin </td><td> Fisher Scientific </td><td> BP1760 </td><td></td></tr><tr><td> Bradford proteine ​​reagenti del dosaggio </td><td> Bio-Rad </td><td> 500-0002 </td><td></td></tr><tr><td> Coomassie blu </td><td> Bio-Rad </td><td> 161-0786 </td><td></td></tr><tr><td> IPTG (isopropil-beta-D tiogalattopiranoside) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> I6758 </td><td></td></tr><tr><td> Glutatione-agarosio </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> G4510 </td><td></td></tr><tr&gt; <td> p-aminobenzamidine-agarosio </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A7155 </td><td></td></tr><tr><td> Completa cocktail di inibitori delle proteasi </td><td> Roche </td><td> 11836170001 </td><td></td></tr><tr><td> Slide-A-lizzatore dialisi cassette </td><td> Thermo Scientific </td><td> 66380 </td><td></td></tr><tr><td> Cromatografia colonne </td><td> Evergreen scientifico </td><td> 208-3367-050 </td><td></td></tr><tr><td> Emulsionante </td><td> Avestin, Inc </td><td> Emulsiflex-C3 </td><td> Consigliatissimo </td></tr><tr><td> Eppendorf Thermomixer </td><td> Eppendorf </td><td> 022670107 </td><td></td></tr><tr><td> Mica dischi </td><td> Ted Pella </td><td> 50-12 </td><td></td></tr><tr><td> Cantilever AFM </td><td> Bruker </td><td> MSNL-10 </td><td></td></tr><tr><td> WSxM software </td><td> Nanotec </td><td> N / A </td><td> Pee scaricare </td></tr></tbody></table>

purificazione e aggregazione della proteina precursore dell&#39;amiloide dominio intracellulare

Purification and Aggregation of the Amyloid Precursor Protein Intracellular Domain

Proteina precursore dell&#39;amiloide (APP) è un tipo di proteina transmembrana I associato alla patogenesi della malattia di Alzheimer (AD). APP è caratterizzata da un grande dominio extracellulare e un dominio breve citosolico chiamato il dominio intracellulare di APP (AICD). Durante la maturazione attraverso la via secretoria, APP può essere scissa dalla proteasi denominate α, β, e γ-secretasi 1. Sequenziale clivaggio proteolitico di APP con β e γ-secretasi porta alla produzione di un peptide piccolo proteolitico, Ap definito, che è amiloidogena e il componente principale delle placche senili. L&#39;AICD è liberata dalla membrana dopo trasformazione secretasi, e attraverso interazioni con Fe65 e Tip60, può traslocare al nucleo di partecipare nella regolazione della trascrizione di geni bersaglio più 2,3. Proteina-proteina interazioni che coinvolgono il AICD può influenzare il traffico, l&#39;elaborazione, e le funzioni cellulari di olo-APP e il suo C-terminaL frammenti. Abbiamo recentemente dimostrato che AICD può aggregare in vitro, e questo processo è inibito dalla AD-implicato chaperone molecolare ubiquilin-1 4. Coerentemente con questi risultati, il AICD ha esposto domini idrofobici ed è intrinsecamente disordinati in vitro 5,6, tuttavia ottiene stabile struttura secondaria quando si lega al Fe65 7. Abbiamo proposto che ubiquilin-1 impedisce appropriato interazioni inter e intramolecolari di AICD, impedendo l&#39;aggregazione in vitro e in cellule intatte 4. Mentre la maggior parte degli studi si concentrano sul ruolo di APP nella patogenesi di AD, il ruolo di AICD in questo processo non è chiara. Espressione di AICD ha mostrato di indurre apoptosi 8, per modulare i percorsi di segnalazione 9 e di regolare il calcio segnalazione 10. Over-espressione di AICD e Fe65 in un modello di topo transgenico induce Alzheimer come patologia 11, e recentemente AICD è stato rilevato in reggisenonei lisati mediante Western blotting utilizzando appropriate tecniche di recupero di antigene 12. Per facilitare studi strutturali, biochimici e biofisici del AICD, abbiamo sviluppato una procedura per produrre quantità elevate di ricombinante altamente puro proteine ​​AICD. Abbiamo inoltre descrivere un metodo per indurre l&#39;aggregazione in vitro termica AICD e analisi mediante microscopia a forza atomica. I metodi descritti sono utili per la caratterizzazione biochimica, biofisica e strutturale del AICD e gli effetti di chaperone molecolare sull&#39;aggregazione AICD.

Un metodo per la grande purificazione del dominio intracellulare APP (AICD) è descritto. Abbiamo anche descrivere la metodologia di indurre<em&gt; In vitro</em&gt; AICD aggregazione e visualizzazione mediante microscopia a forza atomica. I metodi descritti sono utili per la caratterizzazione biochimica / strutturale del AICD e gli effetti di chaperone molecolare sulla sua aggregazione.

Purificazione e aggregazione della proteina precursore dell&#39;amiloide dominio intracellulare

La proteina precursore dell'amiloide (APP) è una proteina transmembrana di tipo I associata alla patogenesi della malattia di Alzheimer (AD). L'APP è caratterizzata da una ...

Lo scopo di questa procedura è purificare il dominio intracellulare della proteina precursore dell'amiloide, noto anche come A ICD, e presentare un protocollo per l'aggregazione termica e la caratterizzazione dell'A ICD mediante microscopia a forza atomica. Questo viene ottenuto esprimendo innanzitutto una fusione A GST dell'A ICD in batteri. Successivamente, la proteina G-S-T-A-I-C-D viene purificata, scissa con trombina per separare il GST dall'A ICD e il GST viene rimosso.Successivamente, viene indotta l'aggregazione termica dell'A ICD. Infine, gli aggregati di A ICD vengono visualizzati mediante microscopia a forza atomica. In definitiva, si possono ottenere risultati che dimostrano come l'A ICD possa essere purificato fino all'omogeneità in quantità sufficiente per analisi biochimiche e biophysiche.Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, che richiedono complesse fasi di cromatografia, è che un ICD altamente puro e solubile può essere isolato direttamente sul banco di laboratorio utilizzando reagenti ed attrezzature standard. Un ICD prodotto con questo protocollo è adatto a ulteriori caratterizzazioni biochimiche e biofisiche.La procedura sarà di

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SDD-AGE è una tecnica utile per la rilevazione e la caratterizzazione di amiloide-come i polimeri nelle cellule. Qui mostriamo un adattamento che rende questa tecnica suscettibile di applicazioni su larga scala.

Lo screening per aggregazione amiloide di semi-denaturazione detergente-Agarosio elettroforesi su gel

Qui, descriviamo un protocollo per la purificazione del altamente attivi Hsp104, un esamerica AAA + proteine ​​da lievito, che le coppie idrolisi dell'ATP per disaggregazione delle proteine. Questo schema sfrutta un costrutto His6-tag per la purificazione di...

Purificazione di Hsp104, una proteina Disaggregase

Le proteine possono adottare una struttura nativa o ripiegarsi erroneamente in amiloide insolubile. Le condizioni che favoriscono la via del ripiegamento errato portano alla formazione di diversi tipi di fibrille amiloidi. I metodi qui descritti consentono una rapida conversione di proteine native in amiloide in vitro.

Generazione rapida di amiloide da proteine native in vitro

Mentre il trasporto delle proteine ​​di superficie cellulare è relativamente facile studiato, visualizzare il traffico di proteine ​​intracellulari è molto più difficile. Qui, usiamo costrutti incorporano GFP fotoattivabile e dimostrare un metodo per seguire con precisione la proteina precursore dell'amiloide dal Golgi di down-stream scomparti e seguire il suo gioco.

Imaging il traffico intracellulare di APP con GFP fotoattivabile

Viene descritto un metodo cromatografico in due fasi per la purificazione della proteina Shadoo ricombinante espressa come corpi di inclusione in Escherichia coli, nonché un protocollo per fibrillare Shadoo purificato in strutture amiloidi.

Purificazione e ripiegando a amiloide fibrille di (sua)<sub&gt; 6</sub&gt; -tagged proteina ricombinante Shadoo Espresso come corpi di inclusione in<em&gt; E. coli</em

Qui riportiamo un protocollo di purificazione HPLC su misura che produce peptidi di amiloide-beta 42 (Aβ42) e amiloide-beta 40 (Aβ40) ad alta purezza, in grado di formare oligomeri. L'amiloide-beta è un peptide idrofobico altamente incline all'aggregazione implicato nella malattia di Alzheimer. La natura amiloidogenica del peptide rende la sua purificazione una sfida.

Un Tailored HPLC purificazione protocollo che i rendimenti di elevata purezza beta-amiloide 42 e beta amiloide 40 peptidi, in grado di Oligomer Formazione

Qui usiamo l'elettroforesi del gel dell'agarosi semi-denaturante bidimensionale per confermare la presenza di amiloide-come le fibre di dimensioni eterogenee ed escludere la possibilità che l'eterogeneità di dimensioni è dovuto dissociazione delle fibre amiloidi durante il gel processo in esecuzione.

Uso di elettroforesi del Gel di agarosio detergente semi-denaturante dimensionale due per confermare dimensioni eterogeneità delle fibre amiloidi o amiloide-come

Questo protocollo descrive come preparare oligomeri Aβ da un peptide sintetico in vitro e per valutare la quantità relativa di oligomero Aβ da un punto di analisi macchiante.

Oligomero di β-amiloide a11-positiva preparazione e valutazione utilizzando Dot Blotting analisi

Fornito qui è un protocollo per studiare le interazioni tra forma nativa, prefibrillare, e fibrille amiloidi mature di diversi peptidi e proteine con mitocondri isolati da diversi tessuti e varie aree del cervello.

Interazioni con e Membrana Permeabilizzazione di mitocondri cerebrali di Amyloid Fibrils

Questo metodo di purificazione biochimica con analisi proteomica basata sulla spettrometria di massa facilita la robusta caratterizzazione dei nuclei di fibrille amiloidi, che possono accelerare l'identificazione di bersagli per la prevenzione della malattia di Alzheimer.

Purificazione biochimica e caratterizzazione proteomica dei nuclei di fibrille amiloidi dal cervello

Impara la purificazione e l'aggregazione termica del dominio intracellulare della proteina precursore dell'amiloide (AICD) utilizzando microscopia a forza atomica. Questo metodo consente l'analisi biochimica e strutturale per la ricerca sull'Alzheimer.

Purificazione e aggregazione della proteina precursore dell'amiloide dominio intracellulare

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