Purificazione e aggregazione della proteina precursore dell'amiloide dominio intracellulare

Lo scopo di questa procedura è quello di purificare il dominio intracellulare della proteina precursore dell'amiloide, noto anche come ICD A, e di presentare un protocollo per l'aggregazione termica e la caratterizzazione dell'ICD A mediante microscopia a forza atomica. Ciò si ottiene esprimendo prima la fusione A GST di A ICD nei batteri. Successivamente, la proteina G-S-T-A-I-C-D viene purificata scissa con trombina per separare la GST dall'A ICD e la GST viene rimossa.

Quindi viene indotta l'aggregazione termica di A ICD. Infine, gli aggregati A ICD vengono riprodotti utilizzando la microscopia a forza atomica. In definitiva, si possono ottenere risultati che dimostrano che l'ICD A può essere purificato in quantità equivalente sufficiente per l'analisi biochimica e biofisica.

Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, che richiedono passaggi cromatografici complessi, è che è altamente pura e solubile. Un ICD può essere isolato sul banco di lavoro utilizzando reagenti e apparecchiature standard. Un ICD prodotto da questo protocollo è adatto per un'ulteriore caratterizzazione biochimica e biofisica.

A dimostrare la procedura sarà Amina ti. Un ex postdoc per il mio laboratorio, il Dr.Andres Oberer, dimostrerà come eseguire l'imaging al microscopio a forza atomica di A ICD per esprimere il dominio intracellulare A PP ricombinante o A ICD. Iniziare con le cellule BL 21 trasformate con il vettore pgx 41, ospitando l'ICD umano A fuso al terminale C della GST con una singola colonia, inoculare 10 millilitri di brodo LB con ampicillina e incubare per una notte a 37 gradi Celsius con agitazione vigorosa la mattina seguente.

Incubare 400 millilitri di ampicillina LB in un pallone da un litro con cinque millilitri di coltura notturna. Incubare a 37 gradi Celsius agitando vigorosamente fino a quando la densità ottica a 600 nanometri ha raggiunto da 0,4 a 0,6. Questo normalmente richiede da due a 2,5 ore per indurre l'espressione di G-S-T-A-I-C-D.

Stiamo aggiungendo 0,4 millimolari di IPTG e incubato a 37 gradi Celsius con agitazione vigorosa per cinque ore. Centrifugare le celle a 6.000 volte G per 15 minuti a quattro gradi Celsius e conservare il pellet a meno 80 gradi Celsius. Dopo aver preparato la lisi, tamponare e gettare i batteri sul ghiaccio, aggiungere 20 millilitri di tampone al pellet e utilizzare accuratamente una combinazione di vortice e tazione su ghiaccio con una pipetta.

Reese sospendere il pellet batterico passare il lisato batterico sospeso Reese attraverso un emulsionante pre raffreddato o una pressa francese. A 30.000 PSI passare il lisato attraverso l'emulsionante una seconda volta e raccogliere il lisato in un tubo pre-raffreddato da 50 millilitri. Centrifugare il lisato a 15.000 volte G e quattro gradi Celsius per 30 minuti.

Separare e trasferire il supinato in una provetta pre-raffreddata da 50 millilitri. Aggiungere 500 microlitri di un impasto al 50% di glutatione emerso. Ruotare per 30 minuti a quattro gradi Celsius mentre il campione è in rotazione.

Preparare un nuovo tampone di eluizione dopo l'incubazione. Versare il lisato e l'impasto in una colonna cromatografica monouso in polistirene da cinque pollici con filtri di corso. Lavare la colonna cinque volte con tre millilitri di PBS.

Tappare il fondo della colonna e aggiungere 500 microlitri di tampone di eluizione a temperatura ambiente. Chiudere la parte superiore della colonna e ruotare per cinque minuti a temperatura ambiente. Raccogliere il peso iniziale in un tubo di microrifiuti refrigerato da 1,5 millilitri.

Ripetere l'eluizione altre due volte. Dializzare l'eluato in una membrana di dialisi con cutoff di 10.000 pesi molecolari in quattro litri di PBS durante la notte a quattro gradi Celsius il giorno successivo. Dializzare con altri quattro litri di PBS a quattro gradi Celsius per un'ora.

Rimuovere la proteina dalla cassetta per dialisi ed eseguire un test di quantificazione delle proteine per determinare la resa di G-S-T-A-I-C-D. Una tipica purificazione da 400 millilitri di coltura si tradurrà in rese superiori a 20 milligrammi di proteine purificate con concentrazioni da 10 a 20 milligrammi per millilitro. Aliquotare la proteina in 200 microlitri, aliquote e congelare a meno 80 gradi Celsius.

Per liberare l'ICD A dallo scongelamento GST, 200 microlitri di G-S-T-A-I-C-D purificati e aggiungere 20 micro rilasci di un'unità per microlitro di trombina incubare per una notte a 37 gradi Celsius il giorno successivo, eliminare qualsiasi materiale aggregato mediante centrifugazione a 20.000 volte G per 30 minuti di quattro gradi Celsius. Trasferire il SUPINATO in una microprovetta pre-raffreddata per rimuovere la GST e la trombina. Aggiungere 50 microlitri di liquame aro al 50% di glutatione e 50 microlitri, rispettivamente il 50% di p e wino zaine aro

Incubare a rotazione per cinque minuti a temperatura ambiente. Centrifugare brevemente per sedimentare le perle di agro e rimuovere il supinato in una provetta nuova. Estrarre il GST altre quattro volte con il glutatione.

Gli Aros eseguono un saggio di quantificazione delle proteine su cinque microlitri di ICD A purificato. Le rese tipiche di una coltura da 400 millilitri sono comprese tra 50 e 100 microgrammi a una concentrazione compresa tra 0,2 e 0,5 milligrammi per millilitro. Dopo aver diluito l'ICD A appena preparato in PBS a una concentrazione di 0,1 milligrammi per millilitro ha indotto l'aggregazione termica incubando i campioni a 43 gradi Celsius a 800 giri/min in un agitatore riscaldato per 48 ore.

Diluire il campione 20 volte con acqua deionizzata e posizionare due microlitri sul fresco tagliato. La mica asciuga il campione in un essiccato durante la notte per visualizzare l'aggregato A ICD utilizza la microscopia a forza atomica in modalità di spillatura con capra d'oro. Cantilever in nitruro micro sharpp con un raggio nominale della punta di due nanometri.

Tipiche ampiezze di tapping durante l'imaging, da 10 a 20 nanometri alla frequenza di risonanza dei cantilever. L'espressione e l'arricchimento relativo di G-S-T-A-I-C-D sono mostrati qui. Dopo la lisi, la maggior parte della proteina di fusione è presente nella frazione solubile e quindi non è necessaria l'estrazione dai corpi di inclusione.

Il materiale a cui si allude dalla colonna di glutatione è puro più del 95%. Nella preparazione mostrata qui, la concentrazione di proteine a cui si allude dalla colonna era di 14,5 milligrammi per millilitro e la resa era di 22 milligrammi. La scissione di 200 microlitri di questo preparato durante la notte con 20 unità di trombina ha provocato quasi il 100% di scissione della proteina di fusione.

La quantità di trombina utilizzata è sufficientemente bassa da non essere rilevabile da kumasi. La colorazione blu, la rimozione della trombina e della GST hanno comportato una certa perdita di materiale. Tuttavia, era puro più del 90% con una resa in questa preparazione di 70 microgrammi di A ICD a una concentrazione di 0,35 milligrammi per millilitro.

Gli aggregati di ICD, ripresi da un FM, sono tipicamente amorfi steroidei e hanno dimensioni comprese tra 50 e 100 nanometri. Il materiale aggregato non è rilevabile quando alla reazione di aggregazione viene aggiunta una quantità equimolare del chaperone UBI Quillin one. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione su come purificare l'EICD inducendo la sua aggregazione e l'aggregazione di immagini dell'alloggiamento A-F-M-E-I-C-D.

Purificato da questa tecnica può essere applicato ad altri metodi come la diffusione della luce e i saggi di trappola filtrante per rispondere a domande riguardanti l'effetto degli chaperoni molecolari sull'aggregazione EACD.