Isolamento dei Nuclei Cardiomyocyte dal post-mortem del tessuto

L'obiettivo generale di questa procedura è isolare i nuclei dei cardiomiociti da tessuto post mortem. Questo viene ottenuto innanzitutto omogeneizzando il tessuto con un omogeneizzatore a sonda e un pestello di vetro, seguito da diversi passaggi di filtrazione. Il secondo passaggio consiste nell'isolare la frazione nucleare dalle altre frazioni cellulari mediante centrifugazione di sedimentazione per densità.

In seguito, i nuclei dei cardiomiociti vengono marcati mediante immunomarcazione con un anticorpo diretto contro PCM1. L'ultimo passaggio consiste nell'isolare i nuclei dei cardiomiociti marcati mediante sorting cellulare attivato da fluorescenza. Infine, immediatamente prima di ulteriori manipolazioni a valle, la purezza dei nuclei dei cardiomiociti viene confermata mediante ri-analisi delle frazioni nucleari ordinate.

Il principale vantaggio di questa tecnica è che i nuclei dei cardiomiociti possono essere analizzati con pari efficacia a partire da tessuti freschi o congelati di archivio, in modo ad alto rendimento. Gli studi basati sul DNA nei cardiomiociti sono particolarmente complessi per diversi motivi. In primo luogo, i cardiomiociti costituiscono solo circa il 20-30% delle cellule del cuore.

Inoltre, essi sono in misura significativa nucleati. Inoltre, i cardiomiociti sono in misura significativa poliploidi. Questo metodo qui descritto supera tutte queste difficoltà.

Prima di iniziare la procedura, ricoprire le provette per ultracentrifuga con 10 millilitri di una soluzione di rivestimento contenente BSA al 1% in PBS. Dopo aver fatto ruotare le provette per 30 minuti, rimuovere la soluzione di rivestimento e lasciarle asciugare all'aria.

Iniziare la procedura di isolamento dei nuclei cardiaci utilizzando un bisturi per dissezionare il ventricolo sinistro da un cuore di topo congelato rapidamente. Tagliare il campione dissezionato in piccoli segmenti, quindi trasferire i pezzi di tessuto in un tubo conico da 50 millilitri contenente 15 millilitri di buffer di lisi. Successivamente, omogeneizzare il tessuto cardiaco con un omogeneizzatore a sonda a 24.000 giri al minuto per 10 secondi, quindi diluire l'omogenato con un volume uguale di buffer di lisi fino a un volume totale di 30 millilitri. Trasferire l'omogenato in un omogeneizzatore in vetro utilizzando otto passaggi con una pestella a grande gioco per liberare i nuclei.

Quindi passare i nuclei grezzi. Isolarli prima attraverso un filtro cellulare da 100 micron, poi attraverso un filtro cellulare da 70 micron in un nuovo tubo conico da 50 millilitri. Ora centrifugare l'isolato di nuclei grezzi per 10 minuti a 700 ×g e a 4 gradi Celsius.

Rovesciare il tubo per rimuovere con attenzione il soprannatante, quindi asciugare l'interno del tubo con un tovagliolo di carta, avendo cura di non disturbare il pellet di nuclei. Pipettare la soluzione su e giù diverse volte per risospendere i nuclei grezzi.

Isolare in cinque millilitri di tampone saccarosio, quindi aggiungere ulteriori 25 millilitri di tampone saccarosio alla sospensione dei nuclei. Successivamente, aggiungere 10 millilitri di tampone saccarosio appena preparato in uno dei tubi per ultracentrifuga rivestiti precedentemente preparati. Quindi sovrapporre con attenzione il tampone con la soluzione del pellet di nuclei risospesi.

Dopo aver bilanciato il tubo in un rotore a pendolamento libero, inserire il rotore in una centrifuga ad alta velocità e centrifugare il campione di nuclei per 60 minuti a 13.000 ×g e a quattro gradi Celsius. Al termine della centrifugazione, rimuovere con attenzione i tubi dal rotore e capovolgerli nuovamente. Per eliminare il soprannatante, asciugare i residui rimanenti all'interno del tubo con un fazzoletto di carta come in precedenza, quindi risospendere il pellet di nuclei in un millilitro di buffer di conservazione dei nuclei.

Prima di iniziare la procedura di colorazione immunofluorescente, trasferire un'aliquote da 20 microlitri del campione di nuclei in una provetta fax. Aggiungere 980 microlitri di tampone di conservazione per nuclei all'aliquote ed etichettare la provetta come controllo negativo. Aggiungere ora l'anticorpo anti PCM1 al campione di nuclei e alle provette del controllo negativo in una diluizione di uno a 500.

Quindi, incubare entrambi i tubi a quattro gradi Celsius durante la notte. Il giorno successivo, dopo aver lavato i tubi con il buffer di conservazione dei nuclei e aver scartato il surnatante, sospendere i pellet nucleari in un altro millilitro di buffer di conservazione dei nuclei.

Quindi aggiungere l'anticorpo secondario fluorescente anti-rabbia ai campioni cellulari in un rapporto di diluizione 1:100 e incubare a quattro gradi Celsius per un'ora. Dopo aver lavato i tubi con tampone di conservazione per nuclei, risospendere i pellet in un millilitro di tampone di conservazione per nuclei per la successiva analisi e separazione mediante citometria a flusso. Dopo aver rivestito i nuclei e i tubi di raccolta con BSA e PBS, come all'inizio del video, filtrare il campione e il controllo negativo attraverso filtri cellulari individuali da 30 micron. Poco prima del caricamento, aggiungere un colorante per il DNA.

Aggiungere una diluizione da uno a 500 per l'identificazione delle popolazioni nucleari. Caricare il controllo negativo sul citometro a flusso. Utilizzare i parametri di scattering anteriore e laterale per impostare il primo gate per definire i nuclei cardiaci, in modo analogo al grafico DOT mostrato qui.

Quindi utilizzare i parametri di diffusione in avanti e larghezza dell'impulso di diffusione in avanti per creare un secondo gate intorno ai nuclei singoletti, simile al grafico DOT mostrato qui. Ora caricare il campione immunoetichettato e posizionare il terzo gate per differenziare i nuclei dei cardiomiociti positivi per PCM1 da quelli negativi per PCM1 appartenenti ai non cardiomiociti. Utilizzare la colorazione del DNA nucleare per analizzare il contenuto di DNA e per eseguire l'analisi del ciclo cellulare, simile all'analisi illustrata da questo istogramma.

Dopo aver ordinato i nuclei in base alla loro positività per PCM1, mettere i nuclei ordinati sul ghiaccio e riesaminare un'aliquote di ciascun campione ordinato per determinare la purezza dell'ordinamento. Infine, centrifugare i nuclei ordinati nei loro tubi di raccolta per 15 minuti a 1500 × g e a quattro gradi Celsius. Dopo aver eliminato i soprannatanti, risospendere i pellet di nuclei in un buffer compatibile con l'applicazione successiva desiderata.

In questa prima figura, un cuore di topo adulto è stato colorato con un colorante nucleare e con anticorpi contro PCM1, il fattore di trascrizione cardiaco murino NKX2.5 e la miosina heavy chain o MHC. Qui viene mostrato un ingrandimento della sovrapposizione della figura precedente. Si noti come i nuclei marcati con PCM1 in bianco esprimano il fattore di trascrizione NKX2.5 in rosso e siano circondati dal citoplasma dei cardiomiociti in verde.

Questi dati dimostrano congiuntamente l'accuratezza con cui la colorazione per PCM uno identifica i nuclei dei cardiomiociti. L'ingrandimento evidenzia il pattern di colorazione epinucleare di PCM uno nei nuclei dei miociti, come ulteriormente indicato dalle frecce nell'esperimento rappresentato nelle prossime tre figure, in cui isolati di nuclei cardiaci sono stati colorati con il colorante per il DNA DRAC cinque e con anticorpi diretti contro PCM uno. Qui, la sovrapposizione delle due figure precedenti, le frecce evidenziano nuovamente il pattern di colorazione epinucleare di PCM uno nei nuclei isolati dei cardiomiociti.

Questo diagramma a punti dimostra che circa il 30% dei nuclei isolati con questo metodo sono nuclei di cardiomiociti, come indicato dalla loro marcatura per PCM1. Infine, come illustrano questi istogrammi, i nuclei dei cardiomiociti del mouse sono principalmente diploidi, come indicato dal picco 2N, e solo una piccola sottopopolazione è tetraploide, come indicato dal picco 4N di minori dimensioni. Uno dei vantaggi di questa tecnica è che può essere facilmente adattata ad altre specie.

Come per gli esseri umani.