Calcio Risposte imaging in neuroni GFP-tagged fette di cervello di topo ipotalamici

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di monitorare le risposte al calcio indotte dallo stimolo, sia nei neuroni marcati con GFP, sia spazialmente che temporalmente in fette di cervello utilizzando un colorante indicatore di calcio fluorescente non verde. Ciò si ottiene estraendo prima il cervello di un topo transgenico che esprime GFP in cellule specifiche. Il secondo passo consiste nel preparare fette di tessuto con un microtomo.

Successivamente, la soluzione di caricamento del colorante indicatore di calcio viene pipettata sulle fette per consentire l'assorbimento del colorante da parte delle cellule cerebrali. Il passaggio finale consiste nell'eseguire una registrazione timestamp delle cellule fluorescenti utilizzando la microscopia confocale. In definitiva, le risposte al calcio nei neuroni marcati con GFP vengono mostrate utilizzando l'analisi di imaging del calcio multicolore.

Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti di microscopia confocale è che possiamo visualizzare il calcio nei neuroni tecnologici GFP fluorescenti verdi utilizzando un die indicatore di calcio fluorescente spostato verso il rosso. L'enorme spostamento della corsa del meno rosso ci permette di eseguire analisi multicolore della fluorescenza rossa in combinazione con la GFP verde utilizzando una singola lunghezza d'onda di eccitazione. Abbiamo avuto l'idea di questo metodo quando ci siamo trovati di fronte al problema del monitoraggio dei segnali del calcio nei neuroni che potevamo identificare solo utilizzando una tecnologia fluorescente genetica, che era la proteina a fluorescenza verde.

Illustrerò ora alcuni passaggi critici di questa procedura. Iniziare la procedura versando la soluzione di agar riscaldata in una capsula di Petri quadrata ad un'altezza di un centimetro, dopo il raffreddamento e l'indurimento, il gel di agar al 4% viene tagliato in blocchi di un centimetro cubo e posto in una bottiglia per la conservazione. Dopo aver decapitato il topo, tagliare il cuoio capelluto con una lama di rasoio a filo singolo in direzione sagittale centrale dall'osso frontale alla protuberanza occipitale esterna.

Successivamente, aprire ulteriormente il cuoio capelluto tagliato prima in direzione laterale rostrale. Poi in direzione ventrale. Quindi eseguire due tagli laterali e uno rostrale.

Nel forame magno con una piccola forbice a molla tagliare con cura il cranio. In questo momento, le ossa occipitali interparietali e parietali devono essere staccate. Se la dura madre è ancora presente, rimuoverla con cura con un paio di pinze per evitare danni al cervello.

Successivamente, rimuovere l'osso squamale, l'etmoidale anteriore e il forame frontale. Ora il cervello può essere facilmente rimosso con una spatola a micro cucchiaio rovesciato e i nervi cranici possono essere recisi. Il cervello dovrebbe atterrare sul lato ventrale su una superficie resistente al taglio con la superficie ventrale del cervello rivolta verso il basso.

Usa una lama di rasoio a filo singolo per rimuovere il cervelletto. Questa superficie di taglio dritto sarà la base per il montaggio del cervello su una piastra per consentire il taglio delle sezioni coronali del cervello. Quindi, incolla il cervello con la superficie tagliata sulla piastra di base del microtomo usando una piccola quantità di super colla adesiva cianoacrilica ad alte prestazioni a polimerizzazione rapida.

Successivamente incollare un blocco di gel agar da un centimetro cubo sul lato ventrale del cervello sulla piastra di base del microtomo per sostenere e fissare il cervello durante l'affettatura. Dopo che il legame si è asciugato, mettere la piastra nel bagno del microtomo contenente una soluzione extracellulare ossigenata fredda a sei gradi Celsius. Quindi tagliare il cervello in fette di 300 micron di spessore con bassa velocità di taglio, le fette di cervello coronale vengono raccolte fino a quando l'intero cervello non è stato sezionato.

Preparare ora una soluzione di 20% di onic F1 27 in DMSO aggiungendo la soluzione di DMSO alla polvere di onic F1 27. Quindi, scioglierlo facendo sonicare direttamente la soluzione per due minuti. Successivamente, aggiungere cinque microlitri di soluzione al 20% di onic F1 27 a un tubo di 50 microgrammi di acido peloso permeabile alle cellule.

Mescolare la soluzione con una pipetta. Quindi aggiungere 45 microlitri di soluzione extracellulare alla miscela e agitarla. In breve, aggiungere altri 325 microlitri di soluzione extracellulare e sonicare il tubo per altri tre minuti.

Dopo la sonicazione, aggiungere 1,156 millilitri di soluzione extracellulare ossigenata per ottenere la soluzione finale di carico D dell'indicatore di calcio. Trasferire le fette di cervello coronale in una piastra di coltura cellulare a sei pozzetti riempita con soluzione extracellulare ossigenata fino a sei fette per pozzetto. Aspirare quindi la soluzione extracellulare ossigenata dalle camere facendo attenzione a non danneggiare le fette cerebrali.

Quindi pipettare 750 microlitri della soluzione di caricamento dell'indicatore di calcio D direttamente su ciascuno. Bene, le fette di cervello dovrebbero essere coperte dalla soluzione contenente rore am. Successivamente, incubare le fette nell'incubatore per colture cellulari di ossigeno e anidride carbonica per 45-60 minuti a 37 gradi Celsius.

Al termine dell'incubazione, sostituire la soluzione di caricamento dell'indicatore di calcio DI con una soluzione extracellulare ossigenata fresca per evitare il sovraccarico delle cellule. Per monitorare i cambiamenti indotti dallo stimolo nel segnale fluorescente, trasferire una delle fette di cervello caricate con il rosso fure in una camera di registrazione e posizionarla come desiderato. Dopo aver montato la camera sulla configurazione del microscopio confocale, perfondere la fetta per 10 minuti con una soluzione extracellulare ossigenata per rimuovere qualsiasi eccesso di colorante indicatore di calcio extracellulare.

Dopo essere uscito dalla camera di registrazione, il PERFUSE eight viene raccolto in una bottiglia a vuoto. Quindi guarda la fetta attraverso il microscopio a basso ingrandimento. Prendi nota dell'orientamento della fetta e trova l'area di interesse nella fetta, nel nostro caso l'area ipotalamica nel cervello.

Successivamente, passa all'ingrandimento elevato. Trova la cellula di interesse nella fetta raccogliendo immagini GFP e controllando contemporaneamente l'intensità di fluorescenza del segnale rosso URA. Regolare la potenza del laser su un valore che consenta di misurare la variazione dell'intensità della fluorescenza del rosso URA e prevenga lo sbiancamento dei due fluorofori.

Successivamente, inizia ad acquisire immagini a velocità comprese tra 0,5 e due hertz per raccogliere i segnali fure e GFP. Questa figura mostra l'immagine confocale dei neuroni GN, RHR, Tau, GFP in una fetta di cervello coronale. Questo è il segnale di fluorescenza relativamente uniforme osservato dopo aver caricato la fetta di cervello con fure am e questa è l'immagine unita che mostra i neuroni caricati con il colorante indicatore di calcio.

Ecco alcuni esempi delle risposte al calcio indotte dallo stimolo somatico da singoli neuroni marcati con GFP in diverse aree cerebrali ipotalamiche. I segnali distinti di calcio tra i neuroni che esprimono GN RHR di diversi nuclei ipotalamici possono essere confrontati utilizzando l'area sotto la curva come stima della variazione totale di calcio in una data cellula durante lo stesso periodo Una volta padroneggiato. Questa tecnica può essere eseguita in meno di 90 minuti, compresa la preparazione del colorante indicatore di calcio, il caricamento e l'incubazione delle fette se eseguita correttamente.