Name: Calcio Risposte imaging in neuroni GFP-tagged fette di cervello di topo ipotalamici (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-08-24T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 14 s
Description: Impara a monitorare le risposte del calcio in neuroni GFP-tagged in fette di cervello di topo ipotalamico usando un indicatore fluorescente rosso. Questo metodo consente l'analisi spaziale e temporale dei segnali di calcio con microscopia confocale.

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Ringraziamo i nostri colleghi che hanno partecipato ai lavori qui riassunte. Questo lavoro è stato sostenuto da finanziamenti della Deutsche Forschungsgemeinschaft (SFB 894), &#39;analisi integrativa dell&#39;olfatto&#39; della DFG Schwerpunktprogramm 1392 e dalla Fondazione Volkswagen (TLZ). TLZ è professore Lichtenberg della Fondazione Volkswagen.

<ol><li>Almholt, K., Arkhammar, P. O., Thastrup, O., Tullin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+visualization+of+the+translocation+of+protein+kinase+Calpha-green+fluorescent+protein+hybrids+and+intracellular+calcium+concentrations%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+J%22%5BJournal%5D)">Simultaneous visualization of the translocation of protein kinase Calpha-green fluorescent protein hybrids and intracellular calcium concentrations.</a> Biochem. J. 337 (Pt 2), 211-218 (1999).</li>
<li>Bolsover, S., Ibrahim, O., O'Luanaigh, N., Williams, H., Cockcroft, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+fluorescent+Ca2%2B+dyes+with+green+fluorescent+protein+and+its+variants%3A+problems+and+solutions%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+J%22%5BJournal%5D)">Use of fluorescent Ca2+ dyes with green fluorescent protein and its variants: problems and solutions.</a> Biochem. J. 356, 345-352 (2001).</li>
<li>Leinders-Zufall, T., Ishii, T., Mombaerts, P., Zufall, F., Boehm, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+requirements+for+the+activation+of+vomeronasal+sensory+neurons+by+MHC+peptides%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Structural requirements for the activation of vomeronasal sensory neurons by MHC peptides.</a> Nat. Neurosci. 12, 1551-1558 (2009).</li>
<li>Wen, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+identification+of+GnRH+receptor+neurons%3A+a+new+model+for+studying+neural+circuits+underlying+reproductive+physiology+in+the+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Genetic identification of GnRH receptor neurons: a new model for studying neural circuits underlying reproductive physiology in the mouse brain.</a> Endocrinology. 152, 1515-1526 (2011).</li>
<li>Hara, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+pancreatic+beta-cells+in+the+intact+pancreas%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Endocrinol.+Metab%22%5BJournal%5D)">Imaging pancreatic beta-cells in the intact pancreas.</a> Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab. 290, E1041-E1047 (2006).</li>
<li>Doherty, A. J., Coutinho, V., Collingridge, G. L., Henley, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+internalization+and+surface+expression+of+a+functional%2C+fluorescently+tagged+G-protein-coupled+glutamate+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+J%22%5BJournal%5D)">Rapid internalization and surface expression of a functional, fluorescently tagged G-protein-coupled glutamate receptor.</a> Biochem. J. 341 (Pt 2), 415-422 (1999).</li>
<li>Kurebayashi, N., Harkins, A. B., Baylor, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+fura+red+as+an+intracellular+calcium+indicator+in+frog+skeletal+muscle+fibers%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Use of fura red as an intracellular calcium indicator in frog skeletal muscle fibers.</a> Biophys. J. 64, 1934-1960 (1993).</li>
<li>Heyward, P. M., Chen, C., Clarke, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gonadotropin-releasing+hormone+modifies+action+potential+generation+in+sheep+pars+distalis+gonadotropes%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroendocrinology%22%5BJournal%5D)">Gonadotropin-releasing hormone modifies action potential generation in sheep pars distalis gonadotropes.</a> Neuroendocrinology. 58, 646-654 (1993).</li>
<li>Leinders-Zufall, T. Technique for setting up the perfusion of a recording chamber for physiological studies with cultured and acutely dissociated cells. , Avaliable from: 
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	http://www.warneronline.com/pdf/whitepapers/perfusion_strategies.pdf">
	http://www.warneronline.com/pdf/whitepapers/perfusion_strategies.pdf</a> (1998).</li>
<li>Kneen, M., Farinas, J., Li, Y., Verkman, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Green+fluorescent+protein+as+a+noninvasive+intracellular+pH+indicator%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Green fluorescent protein as a noninvasive intracellular pH indicator.</a> Biophys. J. 74, 1591-1599 (1998).</li>
<li>Wen, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+characterization+of+genetically+labeled+gonadotropes%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Functional characterization of genetically labeled gonadotropes.</a> Endocrinology. 149, 2701-2711 (2008).</li>
<li>Paxinos, G., Franklin, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPaxinos%2C+G+%22The+mouse+brain+in+stereotaxic+coordinates%22">The mouse brain in stereotaxic coordinates</a>. , 2nd edn, Academic Press. (2001).</li>
<li>Tirindelli, R., Dibattista, M., Pifferi, S., Menini, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+pheromones+to+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol.+Rev%22%5BJournal%5D)">From pheromones to behavior.</a> Physiol. Rev. 89, 921-956 (2009).</li>
<li>Kelliher, K. R., Wersinger, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Olfactory+regulation+of+the+sexual+behavior+and+reproductive+physiology+of+the+laboratory+mouse%3A+effects+and+neural+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22ILAR+J%22%5BJournal%5D)">Olfactory regulation of the sexual behavior and reproductive physiology of the laboratory mouse: effects and neural mechanisms.</a> ILAR J. 50, 28-42 (2009).</li>
<li>Yoon, H., Enquist, L. W., Dulac, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Olfactory+inputs+to+hypothalamic+neurons+controlling+reproduction+and+fertility%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Olfactory inputs to hypothalamic neurons controlling reproduction and fertility.</a> Cell. 123, 669-682 (2005).</li>
<li>Boehm, U., Zou, Z., Buck, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Feedback+loops+link+odor+and+pheromone+signaling+with+reproduction%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Feedback loops link odor and pheromone signaling with reproduction.</a> Cell. 123, 683-695 (2005).</li>
<li>Wilson, J. M., Dombeck, D. A., Diaz-Rios, M., Harris-Warrick, R. M., Brownstone, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+calcium+imaging+of+network+activity+in+XFP-expressing+neurons+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Two-photon calcium imaging of network activity in XFP-expressing neurons in the mouse.</a> J. Neurophysiol. 97, 3118-3125 (2007).</li>
<li>Hu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+near-atmospheric+concentrations+of+CO2+by+an+olfactory+subsystem+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Detection of near-atmospheric concentrations of CO2 by an olfactory subsystem in the mouse.</a> Science. 317, 953-957 (2007).</li>
<li>Perez, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+transient+receptor+potential+channel+expressed+in+taste+receptor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">A transient receptor potential channel expressed in taste receptor cells.</a> Nat. Neurosci. 5, 1169-1176 (2002).</li>
<li>Trollinger, D. R., Cascio, W. E., Lemasters, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+loading+of+Rhod+2+into+mitochondria+shows+mitochondrial+Ca2%2B+transients+during+the+contractile+cycle+in+adult+rabbit+cardiac+myocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys.+Res.+Commun%22%5BJournal%5D)">Selective loading of Rhod 2 into mitochondria shows mitochondrial Ca2+ transients during the contractile cycle in adult rabbit cardiac myocytes.</a> Biochem Biophys. Res. Commun. 236, 738-742 (1997).</li>
<li>Properties of Asante Calcium Red - a novel ratiometric indicator with long excitation wavelength. Meshik, X. A., Hyrc, K. L., Goldberg, M. P. Neuroscience Meeting Planner, , Society for Neuroscience. San Diego, CA. (2010).</li>
</ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Una questione importante nel campo delle neuroscienze è quello di capire come il cervello elabora le informazioni sociale. La fonte principale delle informazioni necessarie per il riconoscimento sociale è codificato da segnali olfattivi o feromonale. La rilevazione di questi segnali da parte delle popolazioni neuronali nel naso e il riconoscimento dei segnali nel cervello, in particolare l&#39;ipotalamo, svolgono un ruolo fondamentale in molti processi sociali ed ormoni influenza e di altri fattori neuroendocrini 1...

There was a typo in the abstract of <a href="http://www.jove.com/video/4213">Imaging Calcium Responses in GFP-tagged Neurons of Hypothalamic Mouse Brain Slices</a>.

Erratum: Imaging Calcium Responses in GFP-tagged Neurons of Hypothalamic Mouse Brain Slices

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome </td><td> Azienda </td><td> Cat. N ° </td></tr><tr><td> Agar </td><td> Sigma </td><td> A1296 </td></tr><tr><td> Fura-red/AM </td><td> Invitrogen </td><td> F-3021 </td></tr><tr><td> Pluronic F-127 </td><td> Sigma </td><td> P2443 </td></tr><tr><td> Dimetilsolfossido </td><td> Fisher Scientific </td><td> BP231 </td></tr><tr><td> Vibrante-Blade Microtomo Hyrax V 50 </td><td> Zeiss </td><td> 9770170 </td></tr><tr><td> Dispositivo di raffreddamento CU 65 per Microtomo Hyrax V 50 </td><td> Zeiss </td><td> 9920120 </td></tr><tr><td> O 2 / CO 2 Incubatore, CB210-UL </td><td> Legante </td><td> 0019389 </td></tr><tr><td> Super colla, Loctite 406TM </td><td> Henckel </td><td> 142580 </td></tr><tr><td> Spatole doppia, a forma di cucchiaio </td><td>Bochem </td><td> 3182 </td></tr><tr><td> Spatole Microspoon, forma cucchiaio </td><td> Bochem </td><td> 3344 </td></tr><tr><td> Forbici di primavera, Moria-Vannas-Wolff - Lame 7 millimetri </td><td> Strumenti Scienza Belle </td><td> 15370-52 </td></tr><tr><td> Forbici di primavera, Vännäs - Lame 3 millimetri </td><td> Strumenti Scienza Belle </td><td> 15000-00 </td></tr><tr><td> Wagner Forbici </td><td> Strumenti Scienza Belle </td><td> 14071-12 </td></tr><tr><td> Medical Pinze, 7b Dumont </td><td> Strumenti Scienza Belle </td><td> 11270-20 </td></tr><tr><td> Grande camera rettangolare Open Bath (RC-27) </td><td> Warner Instruments </td><td> 64-0238 </td></tr><tr><td> Confocale BioRad Radiance Microscopio 2100 </td><td> Zeiss </td><td> na </td></tr></tbody></table>

calcio risposte imaging in neuroni gfp-tagged fette di cervello di topo ipotalamici

Imaging Calcium Responses in GFP-tagged Neurons of Hypothalamic Mouse Brain Slices

Nonostante un aumento enorme nella nostra conoscenza dei meccanismi alla base della codifica delle informazioni nel cervello, una questione centrale relativa alle tappe precise molecolari così come l&#39;attività dei neuroni specifici nuclei multi-funzionale delle aree cerebrali come l&#39;ipotalamo rimangono. Questo problema si include l&#39;identificazione dei componenti molecolari coinvolti nella regolazione delle cascate di trasduzione del segnale diverse neuro ormone. Elevazioni di Ca 2 + intracellulare svolgono un ruolo importante nella regolazione della sensibilità dei neuroni, sia a livello di trasduzione del segnale e nei siti sinaptici. Sono emersi nuovi strumenti per identificare neuroni nel miriade di neuroni cerebrali esprimendo la proteina fluorescente verde (GFP) sotto il controllo di un promotore specifico. Per monitorare tempo e nello spazio stimolo-indotto di Ca 2 + risposte in GFP-tagged neuroni, un non-verde fluorescente Ca 2 + indicatore colorante nresponsabili politici da utilizzare. Inoltre, la microscopia confocale è un metodo preferito di neuroni immagini singole fette di tessuto a causa della sua capacità di visualizzare neuroni in diversi piani di profondità all&#39;interno del tessuto e di limitare out-of-focus fluorescenza. Il raziometrico Ca 2 + indicatore fura-2 è stato usato in combinazione con GFP-tagged neuroni 1. Tuttavia, il colorante viene eccitato da raggi ultravioletti (UV). Il costo del laser e la limitata profondità di penetrazione della luce UV ottico ostacolato il suo uso in molti laboratori. Inoltre, fluorescenza GFP può interferire con le fura-2 segnali 2. Pertanto, abbiamo deciso di utilizzare un rosso fluorescente Ca 2 + indicatore colorante. L&#39;enorme cambiamento Strokes di fura-rosso permette analisi multicolore della fluorescenza rossa in combinazione con GFP usando una singola lunghezza d&#39;onda di eccitazione. Abbiamo avuto buoni risultati precedentemente con fura-rosso, in combinazione con GFP-tagged neuroni olfattivi 3. I protocolli di fettine di tessuto olfattivi sembrava funzionare equally bene in neuroni ipotalamici 4. Fura-rosso sulla base di Ca 2 + di imaging è successo anche in combinazione con GFP-tagged pancreatiche β-cellule e GFP-tagged recettori espressi in cellule HEK 5,6. Una peculiarità del piccolo fura-red è che la sua intensità di fluorescenza a 650 nm diminuisce per l&#39;indicatore si lega calcio 7. Pertanto, la fluorescenza di neuroni di sosta con bassa concentrazione di Ca 2 + ha intensità relativamente elevata. Va notato, che gli altri rossi Ca 2 + indicatori di coloranti esistono o sono in fase di sviluppo, che potrebbe dare risultati migliori o migliorate di neuroni e aree cerebrali.

In questo protocollo, che aggiorniamo i recenti progressi nel campo dell&#39;imaging Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; Segnali di neuroni GFP-tagged in fettine di tessuto cerebrale con un rosso fluorescente Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; Indicatore di colorante.

Calcio Risposte imaging in neuroni GFP-tagged fette di cervello di topo ipotalamici

Nonostante l'enorme aumento delle nostre conoscenze sui meccanismi che sottendono la codifica delle informazioni nel cervello, una questione centrale riguardante il...

L'obiettivo generale di questa procedura è monitorare le risposte al calcio indotte da stimoli, sia nelle cellule nervose marcate con GFP, sia dal punto di vista spaziale che temporale, in sezioni di tessuto cerebrale utilizzando un colorante fluorescente per il calcio non verde. Questo risultato si ottiene innanzitutto estraendo il cervello di un topo transgenico che esprime GFP in cellule specifiche. Il secondo passaggio consiste nel preparare sezioni di tessuto con un microtomo.Successivamente, la soluzione di carico del colorante indicatore del calcio viene pipettata sulle sezioni in modo che il colorante venga assorbito dalle cellule cerebrali. L'ultimo passaggio consiste nell'effettuare una registrazione temporale delle cellule fluorescenti mediante microscopia confocale. Infine, le risposte al calcio nei neuroni marcati con GFP vengono visualizzate utilizzando un'analisi di imaging del calcio multicolore.Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti di microscopia confocale è che possiamo visualizzare il calcio nei neuroni verdi fluorescenti GFP utilizzando un colorante indicatore di calcio fluorescente spostato verso il rosso. L'elevato spostamento Stokes del fluoroforo rosso ci permette di effettuare un'analisi multicolore della fluorescenza rossa in combinazione con la GFP verde, utilizzando una singola lunghezza d'onda di eccitazione. Abbiamo avuto per la prima volta l'idea di questo metodo quando ci siamo trovati di fronte al problema del monitoraggio dei segnali di calcio in neuroni che potevamo identificare solo mediante una tecnica fluorescente genetica, ovvero la proteina verde fluorescente.Illustrerò ora diverse fasi critiche di questa procedura. Iniziare versando la soluzione di agar riscaldata in una piastra di Petri quadrata fino a un'altezza di un centimetro; dopo il raffreddamento, il gel di agar al 4% viene tagliato in blocchi di un centimetro cubo e collocato in una bottiglia per la conservazione. Dopo aver decapitato il topo, tagliare il cuoio capelluto con una lametta a bordo singolo nella direzione sagittale mediale, dall'osso frontale alla protuberanza occipitale esterna.Successivamente, aprire ulteriormente il cuoio capelluto tagliato prima in direzione laterale rostrale, poi in direzione ventrale. Quindi effettuare due tagli laterali e un taglio rostrale.Nel foro magno, con forbici a molla di piccole dimensioni, staccare con cura il cranio. A questo punto, le ossa occipitali interparietali e parietali devono essere separate. Se la dura madre è ancora presente, rimuoverla con delicatezza utilizzando una pinzetta per evitare danni al cervello.Successivamente, rimuovere l'osso squamoso, il forame etmoidale anteriore e il forame frontale. Ora il cervello può essere facilmente asportato utilizzando una spatola microscopica a cucchiaio invertita e i nervi cranici possono essere recisi. Il cervello deve appoggiarsi sul lato ventrale su una superficie resistente al taglio, con la faccia ventrale rivolta verso il basso.Utilizzare una lama di rasoio a tagliente singolo per rimuovere il cervelletto. Questa superficie di taglio dritta costituirà la base per il fissaggio del cervello su una piastra, consentendo il taglio di sezioni cerebrali coronali. Successivamente, incollare il cervello con la superficie tagliata sulla piastra di base del microtomo utilizzando una piccola quantità di colla cianoacrilica superattiva ad alta prestazione e rapida polimerizzazione.In seguito, incollare un blocco di gel di agar di un centimetro cubo sulla faccia ventrale del cervello alla piastra di base del microtomo per sostenere e fissare il cervello durante il taglio. Dopo che l'adesione si &egrave; asciugata, inserire la piastra nel bagno del microtomo contenente soluzione extracellulare ossigenata a sei gradi Celsius. Quindi tagliare il cervello in fette di 300 micron di spessore con una bassa velocit&agrave; di taglio; le sezioni coronali del cervello vengono raccolte finch&eacute; l'intero cervello &egrave; stato sezionato.Ora preparare una soluzione al 20% di onic F1 27 in DMSO aggiungendo soluzione di DMSO alla polvere di onic F1 27. Successivamente, sciogliere direttamente la soluzione mediante sonificazione per due minuti. Dopodiché, aggiungere cinque microlitri di soluzione al 20% di onic F1 27 a un tubo contenente 50 microgrammi di furred am permeabile alle cellule.Mescolare la soluzione con una pipetta. Quindi aggiungere 45 microlitri di soluzione extracellulare alla miscela e vortexare. Breve aggiunta di ulteriori 325 microlitri di soluzione extracellulare e sonicare il tubo per altri tre minuti.Dopo la sonificazione, aggiungere 1,156 millilitri di soluzione extracellulare ossigenata per ottenere la soluzione finale di carico con l'indicatore di calcio D. Trasferire le sezioni coronali del cervello in una piastra per colture cellulari a sei pozzetti contenente soluzione extracellulare ossigenata, con un massimo di sei sezioni per pozzetto. Quindi aspirare la soluzione extracellulare ossigenata dalle camere avendo cura di non danneggiare le sezioni cerebrali.Successivamente, pipettare 750 microlitri della soluzione di carico dell'indicatore calcico D direttamente in ciascun pozzetto, in modo che le fette cerebrali siano completamente ricoperte dalla soluzione contenente rore am. Dopodiché, incubare le fette nell'incubatore per colture cellulari con ossigeno e anidride carbonica per 45-60 minuti a 37 gradi Celsius.Al termine dell'incubazione, sostituire la soluzione di carico dell'indicatore del calcio DI con una soluzione extracellulare fresca e ossigenata per evitare un sovraccarico delle cellule. Per monitorare le variazioni del segnale fluorescente indotte dallo stimolo, trasferire una delle fette di cervello caricate con fure rosso in una camera di registrazione e posizionarla come desiderato. Dopo aver montato la camera sul microscopio confocale, perfondere la fetta per 10 minuti con soluzione extracellulare ossigenata per rimuovere qualsiasi eccesso di colorante indicatore del calcio presente nell'ambiente extracellulare.Dopo essere uscito dalla camera di registrazione, il PERFUSE eight viene raccolto in una bottiglia sotto vuoto. Successivamente, osservare la sezione al microscopio con ingrandimento basso. Prendere nota dell'orientamento della sezione e individuare l'area di interesse nella sezione; nel nostro caso, l'area ipotalamica del cervello.Successivamente, passare ad un ingrandimento elevato. Individuare la cellula di interesse nella sezione acquisendo immagini GFP e verificando contemporaneamente l'intensità di fluorescenza del segnale rosso URA. Regolare la potenza del laser a un valore che consenta misurazioni nella variazione dell'intensità di fluorescenza rossa URA, evitando lo sbiancamento dei due fluorocromi.Successivamente, iniziare ad acquisire immagini a frequenze comprese tra 0,5 e 2 hertz per raccogliere i segnali di fure e GFP. Questa figura mostra l'immagine confocale dei neuroni GN, RHR Tau GFP in una sezione coronale di cervello. Questo è il segnale di fluorescenza relativamente uniforme osservato dopo aver caricato la sezione cerebrale con fure am e questa è l'immagine sovrapposta che mostra i neuroni caricati con il colorante indicatore del calcio.Di seguito sono riportati esempi di risposte al calcio indotte da stimolo somatico in singoli neuroni marcati con GFP appartenenti a diverse aree cerebrali ipotalamiche. I segnali al calcio distinti tra i neuroni esprimenti GN RHR di diversi nuclei ipotalamici possono essere confrontati utilizzando l'area sotto la curva come stima della variazione totale del calcio in una determinata cellula durante lo stesso periodo di tempo. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in meno di 90 minuti, compresa la preparazione del colorante indicatore del calcio, il caricamento e l'incubazione delle fette, se eseguita correttamente.

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L'organo vomeronasale (VNO) rileva i segnali chimici intraspecie che veicolano informazioni sociali e riproduttivi. Abbiamo effettuato Ca2 + esperimenti di imaging con topi transgenici che esprimono G-CaMP2 nel tessuto VNO. Questo approccio ci consente di analizzare i modelli di risposta dei neuroni complicato vomeronasale a un gran numero di stimoli feromone.

Le risposte di imaging neuronale in preparazione Fetta di organo vomeronasale Esprimere un sensore di calcio geneticamente codificato

Fonte: Bancroft, E. A., et al. Quantificare spontaneamente Ca2+ flussi e i loro effetti a valle nei neuroni primari del mesencefalo del topo. J. Vis. Exp. (2020) Questo video dimostra la visualizzazione in tempo reale dell'afflusso di calcio nei neuroni mesencefalici ventrali derivati da embrioni di topo. Utilizzando un vettore virale per esprimere un indicatore di calcio, i neuroni vengono ripresi al microscopio confocale per tracciare i cambiamenti nell'intensità della fluorescenza durante...

Visualizzazione dell'afflusso di calcio nei neuroni ventrali del mesencefalo derivati da embrioni di topo

Descriviamo una procedura sperimentale per la misura di attività neuronale attraverso finestre ottiche dual sopra bilaterale corticies somatosensoriale primaria (S1) in Thy1-GCaMP6s topi transgenici utilizzando 2 fotoni (2P) microscopia in vivo.

Imaging di attività neurale nella corteccia somatosensoriale primaria utilizzando Thy1-topi transgenici GCaMP6s

Presentiamo un metodo che unisce le registrazioni della intero-cellula patch-clamp e due-fotone imaging per registrare transitori di Ca2 + nei dendriti neuronali nelle fette del cervello acuto.

Imaging del due-fotone calcio nei dendriti neuronali nelle fette del cervello

Qui presentiamo come esporre il ganglio genicolato di un topo da laboratorio vivo e anestetizzato e come utilizzare l'imaging del calcio per misurare le risposte degli insiemi di questi neuroni agli stimoli del gusto, consentendo prove multiple con diversi stimolanti. Ciò consente confronti approfonditi di quali neuroni rispondono a quali tastants.

Imaging in vivo del calcio delle risposte del neurone ganglio genicolato di topo agli stimoli del gusto

Presentiamo un protocollo per esporre il tronco encefalico del topo adulto dal lato ventrale. Utilizzando una lente indice gradient-rifrazione con un microscopio in miniatura, l'imaging di calcio può essere utilizzato per esaminare l'attività dei somata neurali olivari inferiori in vivo.

In vivo Imaging del calcio nell'oliva inferiore del topo

Questo protocollo descrive l'esposizione chirurgica del ganglio della radice dorsale (DRG) seguito da GCaMP3 (indicatore Ca2+ codificato geneticamente; Green Fluorescent Protein-Calmodulin-M13 Protein 3) Ca2+ imaging degli insiemi neuronali utilizzando topi Pirt-GCaMP3 mentre si applica una varietà di stimoli alla zampa posteriore omolaterale.

In vivo Imaging del calcio di insiemi neuronali in reti di neuroni sensoriali primari nei gangli della radice dorsale intatti

Questo protocollo descrive in dettaglio la procedura per l'imaging delle risposte del calcio nel collicolo superiore (SC) dei topi svegli, compreso l'imaging dell'attività di un singolo neurone con microscopia a due fotoni, lasciando intatta la corteccia nei topi wild-type, e l'imaging dell'intero SC con microscopia ad ampio campo nei topi mutanti a corteccia parziale.

Imaging del calcio nel collicolo superiore del topo

Il presente protocollo delinea l'imaging del calcio in vivo per misurare le risposte di insiemi di neuroni DRG lombari-6 a stimoli somatici e viscerali. Confronti approfonditi possono essere effettuati tra i neuroni che rispondono a diversi stimoli. Questo protocollo è prezioso per studiare i meccanismi del dolore viscerale e della stimolazione somatica, come l'agopuntura.

in vivo Imaging del calcio della risposta dei neuroni dei gangli della radice dorsale a stimoli somatici e viscerali

Il giro dentato dell'ippocampo svolge funzioni essenziali e distinte nell'apprendimento e nella memoria. Questo protocollo descrive una serie di procedure robuste ed efficienti per l'imaging in vivo del calcio di cellule granulari nel giro dentato in topi che si muovono liberamente.

Imaging in vivo del calcio delle cellule dei granuli nel giro dentato dell'ippocampo nei topi 

Questo protocollo descrive l'imaging in vivo del calcio GCaMP di neuroni del ganglio trigemino (TG) intatti. Questa descrizione include la chirurgia dell'esposizione ai TG, l'imaging al microscopio confocale in vivo dei neuroni TG, l'applicazione di stimoli somatici durante l'imaging microscopico dei neuroni TG e l'analisi dei dati di imaging del calcio GCaMP in vivo .

In vivo Imaging del calcio di insiemi neuronali in reti di neuroni sensoriali primari in gangli trigeminali intatti

Impara a monitorare le risposte del calcio in neuroni GFP-tagged in fette di cervello di topo ipotalamico usando un indicatore fluorescente rosso. Questo metodo consente l'analisi spaziale e temporale dei segnali di calcio con microscopia confocale.

Calcio Risposte imaging in neuroni GFP-tagged fette di cervello di topo ipotalamici

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