Calcio Risposte imaging in neuroni GFP-tagged fette di cervello di topo ipotalamici

L'obiettivo generale di questa procedura è monitorare le risposte al calcio indotte da stimoli, sia nelle cellule nervose marcate con GFP, sia dal punto di vista spaziale che temporale, in sezioni di tessuto cerebrale mediante un colorante fluorescente per il calcio non verde. Questo risultato si ottiene innanzitutto estraendo il cervello di un topo transgenico che esprime GFP in cellule specifiche. Il secondo passaggio consiste nel preparare sezioni di tessuto con un microtomo.

Successivamente, la soluzione di carico del colorante indicatore del calcio viene pipettata sulle sezioni in modo che il colorante venga assorbito dalle cellule cerebrali. L'ultimo passaggio consiste nell'effettuare una registrazione temporale delle cellule fluorescenti mediante microscopia confocale. Infine, le risposte al calcio nei neuroni marcati con GFP vengono visualizzate utilizzando un'analisi di imaging del calcio multicolore.

Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti di microscopia confocale è che possiamo visualizzare il calcio nei neuroni verdi fluorescenti GFP utilizzando un colorante indicatore di calcio fluorescente spostato verso il rosso. L'elevato spostamento verso il rosso del colorante ci permette di effettuare un'analisi multicolore della fluorescenza rossa in combinazione con il GFP verde, utilizzando una singola lunghezza d'onda di eccitazione. Abbiamo avuto per la prima volta l'idea di questo metodo quando ci siamo trovati di fronte al problema del monitoraggio dei segnali di calcio nei neuroni che potevamo identificare solo mediante una tecnica fluorescente genetica, ovvero la proteina verde fluorescente.

Illustrerò ora diverse fasi critiche di questa procedura. Iniziare versando la soluzione di agar riscaldata in una piastra di Petri quadrata fino a un'altezza di un centimetro; dopo il raffreddamento, il gel di agar al 4% viene tagliato in blocchi di un centimetro cubo e collocato in una bottiglia per la conservazione. Dopo aver decapitato il topo, tagliare il cuoio capelluto con una lametta a bordo singolo nella direzione sagittale mediale, dall'osso frontale alla protuberanza occipitale esterna.

Successivamente, aprire ulteriormente il cuoio capelluto tagliato prima in direzione laterale rostrale, poi in direzione ventrale. Quindi effettuare due tagli laterali e un taglio rostrale.

Nel foro magno, con una piccola forbice a molla, staccare con cura il cranio. In questo momento, le ossa occipitali interparietali e parietali devono essere separate. Se la dura madre è ancora presente, rimuoverla con delicatezza utilizzando una pinzetta per evitare danni al cervello.

Successivamente, rimuovere l'osso squamoso, il forame etmoidale anteriore e il forame frontale. Ora il cervello può essere facilmente asportato utilizzando una spatola microscopica a cucchiaio invertita e i nervi cranici possono essere recisi. Il cervello deve appoggiarsi sul suo lato ventrale su una superficie resistente al taglio, con la superficie ventrale rivolta verso il basso.

Utilizzare una lama di rasoio a tagliente singolo per rimuovere il cervelletto. Questa superficie di taglio dritta costituirà la base per il fissaggio del cervello su una piastra, al fine di consentire il taglio di sezioni cerebrali coronali. Successivamente, incollare il cervello con la superficie tagliata sulla piastra di base del microtomo utilizzando una piccola quantità di colla cianoacrilica superattiva ad alta prestazione e rapida polimerizzazione.

In seguito, incollare un blocco di gel di agar di un centimetro cubo sulla faccia ventrale del cervello alla piastra di base del microtomo per sostenere e fissare il cervello durante il taglio. Dopo che l'adesione si è asciugata, inserire la piastra nel bagno del microtomo contenente soluzione extracellulare ossigenata a sei gradi Celsius. Quindi tagliare il cervello in fette di 300 micron di spessore con una bassa velocità di taglio; le sezioni coronali del cervello vengono raccolte finché l'intero cervello è stato sezionato.

Ora preparare una soluzione al 20% di onic F1 27 in DMSO aggiungendo soluzione di DMSO alla polvere di onic F1 27. Successivamente, sciogliere sonicando direttamente la soluzione per due minuti. Dopodiché, aggiungere cinque microlitri di soluzione al 20% di onic F1 27 a un tubo contenente 50 microgrammi di furred am permeabile alle cellule.

Mescolare la soluzione con una pipetta. Quindi aggiungere 45 microlitri di soluzione extracellulare alla miscela e vortexare. Breve aggiunta di ulteriori 325 microlitri di soluzione extracellulare e sonicare il tubo per altri tre minuti.

Dopo la sonificazione, aggiungere 1,156 millilitri di soluzione extracellulare ossigenata per ottenere la soluzione finale di carico con l'indicatore di calcio D. Trasferire le sezioni coronali del cervello in una piastra per colture cellulari a sei pozzetti contenente soluzione extracellulare ossigenata, con un massimo di sei sezioni per pozzetto. Quindi aspirare la soluzione extracellulare ossigenata dalle camere avendo cura di non danneggiare le sezioni cerebrali.

Successivamente, pipettare 750 microlitri della soluzione di carico dell'indicatore calcico D direttamente in ciascun pozzetto, in modo che le sezioni cerebrali siano completamente ricoperte dalla soluzione contenente rore am. Successivamente, incubare le sezioni nell'incubatore per colture cellulari con ossigeno e anidride carbonica per 45-60 minuti a 37 gradi Celsius.

Al termine dell'incubazione, sostituire la soluzione di carico dell'indicatore del calcio DI con una soluzione extracellulare fresca e ossigenata per evitare il sovraccarico delle cellule. Per monitorare le variazioni del segnale fluorescente indotte dallo stimolo, trasferire una delle fette di cervello caricate con fure rosso in una camera di registrazione e posizionarla come desiderato. Dopo aver montato la camera sul microscopio confocale, perfondere la fetta per 10 minuti con soluzione extracellulare ossigenata per rimuovere qualsiasi eccesso di colorante indicatore del calcio presente nell'ambiente extracellulare.

Dopo essere stato espulso dalla camera di registrazione, il PERFUSE otto viene raccolto in una bottiglia sotto vuoto. Successivamente, osservare la sezione al microscopio con ingrandimento basso. Prendere nota dell'orientamento della sezione e individuare l'area di interesse nella sezione; nel nostro caso, l'area ipotalamica del cervello.

Successivamente, passare ad un ingrandimento elevato. Individuare la cellula di interesse nella sezione acquisendo immagini GFP e controllando contemporaneamente l'intensità di fluorescenza del segnale rosso URA. Regolare la potenza del laser a un valore che consenta misurazioni nel cambiamento dell'intensità di fluorescenza rossa URA, evitando lo sbiancamento dei due fluorofori.

Successivamente, iniziare ad acquisire immagini a frequenze comprese tra 0,5 e 2 hertz per raccogliere i segnali di fure e GFP. Questa figura mostra l'immagine confocale dei neuroni GN, RHR Tau GFP in una sezione coronale di cervello. Questo è il segnale di fluorescenza relativamente uniforme osservato dopo aver caricato la sezione cerebrale con fure am e questa è l'immagine sovrapposta che mostra i neuroni caricati con il colorante indicatore del calcio.

Di seguito sono riportati esempi di risposte al calcio indotte da stimolo somatico in singoli neuroni marcati con GFP appartenenti a diverse aree cerebrali ipotalamiche. I segnali al calcio distinti tra i neuroni esprimenti GN RHR di diversi nuclei ipotalamici possono essere confrontati utilizzando l'area sotto la curva come stima della variazione totale del calcio in una determinata cellula durante lo stesso periodo di tempo. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in meno di 90 minuti, compresa la preparazione del colorante indicatore del calcio, il caricamento e l'incubazione delle fette, se eseguita correttamente.