Name: La stimolazione meccanica di condrociti-agarosio idrogel (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-10-27T19:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 45 s
Description: Impara a stimolare meccanicamente i condrociti in idrogel di agarosio per studiare la sintesi di collagene e proteoglicani. Questo metodo permette di analizzare la risposta metabolica cellulare in condizioni dinamiche.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

1. Isolamento dei condrociti articolari primarie Harvest 10-15 completi fette cartilagine spessore dalle superfici articolari delle articolazioni degli animali (ad esempio il metacarpo-falangea di vacche scheletro ottenuta da un mattatoio locale). <ol><li> Cartilagine Mettere le fette in un piatto 100 millimetri Petri e incubare a 20 ml di 0,5% proteasi in Ham F-12 (w / v) per 2 ore a 37 ° C. Risciacquare tre volte di Ham F-12 terreni di coltura e incubare con 20 ml di 0,15% Collagenase A in Ham F-12 Mezzi di coltura durante la notte a 37 ° C. </li><li> Filtrare la sospensione cellulare attraverso un filtro 200 mesh in un piatto pulito. Lavare il filtro con 5 ml di Ham F-12 e aggiungere al piatto. Trasferire la sospensione cellulare in una provetta da 50 ml. Lavare la piastra Petri con 10 ml di Ham F-12 e aggiungere al tubo conico. </li><li> Centrifugare la provetta a 600-800 rcf per 6-8 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Aspirare il supernatante, assicurando di non disturbare °e pellet e risospendere in 40 ml di Ham F-12 terreni di coltura. </li><li> Centrifugare la provetta a 600-800 rcf per 6-8 min. </li><li> Ripetere i passaggi 1,4 e 1,5 volte più per un totale di tre volte. Prima di centrifugazione per la terza volta, risospendere il pellet tramite agitazione e ottenere una aliquota 500 microlitri per la conta cellulare. </li><li> Contare le cellule vitali con il metodo di esclusione Trypan blu 9 con un emocitometro e un microscopio ottico invertito. </li><li> Aspirare il supernatante e risospendere il pellet in un volume di Ham F-12 supporti di raddoppiare la densità di semina desiderata (ad esempio 20 x 10 6 cellule / ml per una concentrazione finale di 10 x 10 6 cellule / ml dopo incapsulamento). </li></ol> 2. Condrociti-agarosio Hydrogel incapsulamento <ol><li> Calore 0,8 g autoclavato Type VII agarosio in 20 ml di PBS sterile 1x (pH 7,4) su una piastra calda impostata a 120 ° C fino a completa dissoluzione. Una volta sciolto, abbassare il calore a 60 ° C come temperature superiori will influenzare la vitalità delle cellule. </li><li> In una provetta da 50 ml, mescolare volumi uguali della sospensione cellulare con il doppio della concentrazione desiderata di agarosio (es. sospensione agarosio al 4% per un idrogel finale 2% agarosio). Evitare la formazione di bolle di grandi dimensioni in quanto possono influenzare la vitalità delle cellule e la costruzione di durata a fatica. </li><li> Un&#39;aliquota accuratamente 10 ml di agarosio-condrociti miscela in un piatto Petri diametro 60 mm, evitando la formazione di bolle grandi. </li><li> Lasciate riposare per 30 minuti a temperatura ambiente fino gelificata. </li><li> Ottenere il maggior numero di condrociti-agarosio campioni idrogel, se necessario (in genere 20-30) con una da 4 mm biopsia. </li><li> Misurare e registrare le dimensioni fisiche (diametro e altezza) di campioni rappresentativi con un micrometro. Costrutti deve essere di circa 5 mm di altezza, eliminare eventuali campioni ottenuti da una regione in cui la varianza altezza del campione è superiore al 2%. </li><li> Trasferire i campioni di un piatto dolce 60 millimetri Petri e integrarecon 10 ml di mezzi completi (ad esempio il 20% di siero fetale bovino in Ham F-12 mezzi di coltura con 20 mM HEPES, 100 pg / ml di acido ascorbico, e antibiotici / antimicotici 2x). </li></ol> 3. La stimolazione meccanica e radiomarcatura di condrociti-agarosio idrogel <ol><li> Autoclave i componenti metallici del rig compressione. Sterilizzare i componenti in plastica con il 70% di etanolo (durante la notte) e ai raggi UV (per almeno 15 minuti). </li><li> Per mantenere costrutti ribaltamento, mediante pinza, posto 12 anelli di plastica sterili fissaggio (con un diametro interno maggiore del diametro costrutto) (n = 6, campioni e controlli) nei pozzetti di una piastra a 24 pozzetti cultura. </li><li> Utilizzando pinze, trasferire accuratamente i condrociti-agarosio idrogel dalla capsula di Petri a 24 pozzetti, assicurando ognuno in un anello di ritegno. </li><li> Trasferire 400 ml di mezzi completi (ad esempio il 20% FBS in Ham F-12 terreni di coltura con 20 mM di HEPES, 100 mcg / ml di acido ascorbico, e2x antibiotici / antimicotici) in ciascun pozzetto. </li><li> Montare l&#39;impianto di compressione sterilizzato (Figura 1) e fissare le piastre con viti di fissaggio. Collegare l&#39;impianto di perforazione di compressione al 24 pozzetti piastra di coltura. </li><li> Rilasciare e ri-fissare le viti a stabilire contatto piastra-idrogel (zero stato di deformazione). </li><li> Caricare l&#39;impianto di compressione assemblati in un sistema di Mach-1 Test di micromeccanica. Rig sicuro allo stadio verticale tramite perno di posizionamento e bloccaggio in posizione con vite di fermo. Rimuovere la dima spaziatura. </li><li> Applicare al carico di compressione dinamica ampiezza desiderata (ampiezza di deformazione ad esempio 10% in base all&#39;altezza originale dei campioni), la frequenza (ad esempio 1 Hz) e durata o il numero di cicli (ad esempio, intervalli di tempo fino a 60 min). </li><li> Al termine della stimolazione meccanica, sostituire la maschera di distanza, allentare la vite di fermo posizionamento perno e rimuovere l&#39;impianto di compressione e piastra di coltura dal sistema-1 Mach Testing micromeccanica. </li&gt; <li> Radiotracciante cellula-idrogel costrutti completandola i media con 5 uCi dell&#39;isotopo desiderato (ad esempio, [3 H]-prolina label proteine ​​per condrociti specifica sintesi del collagene e [35 S] tenore di zolfo per la sintesi dei proteoglicani). </li><li> Incubare i costrutti radiomarcati per 24 hr a 37 ° C, 5% CO 2 10. </li><li> Raccogliere i costrutti idrogel radioattivi e lavare 3 volte in 1x PBS (pH 7.4) per rimuovere eventuale isotopo prive di personalità giuridica. Campioni digest usando papaina (40 mg / ml in 20 mM di acetato di ammonio, acido 1 mM ditiotreitolo ethyldiaminetetraacetic e 2 mM a 65 ° C per 72 ore). </li><li> Saggio digest per il contenuto di DNA per mezzo del test PicoGreen colorante 11 e l&#39;attività degli isotopi incorporato, normalizzato al contenuto di DNA, da β-liquido di scintillazione conteggio 12,13 digestione papaina subito dopo. </li></ol> Nota: L&#39;acquisto e lo smaltimento di materiali radioattivi (isotopi di rifiuti e oggettiche possano essere venuti in contatto con materiali radioattivi) deve seguire il istituzionale rilevante (e / o di governo) le politiche e le procedure per la manipolazione e lo smaltimento di sostanze radioattive. 4. Risultati rappresentativi Condrociti articolari bovini-agarosio costrutti idrogel (2% agarosio con 10 x 10 6 cellule / ml cellule incapsulate) sono stati stimolati meccanicamente ad una ampiezza di 10% di deformazione a compressione ad una frequenza di 1 Hz per 20 a 60 min (o 1.200 a 3.600 cicli ) e analizzati per il contenuto di DNA e la sintesi della matrice extracellulare per incorporazione radioisotopo. DNA e sintesi di matrice extracellulare è stato influenzato in un modo dipendente dalla dose. Contenuto di DNA hanno mostrato una diminuzione del 35% come risultato di 20 o 30 min di stimolazione (p &lt;0,01), mentre 60 min di stimolazione mostrato alcun effetto (Figura 2). Cartilagine-specifiche sintesi di collagene e proteoglicani (determinato da [3 H]-prolina e[35 S]-zolfo incorporazione, rispettivamente) mostra significativi aumenti di circa il 60% in risposta a 20 o 30 min di stimolazione (p &lt;0,01), con 60 min di stimolazione esibendo alcun effetto osservabile (Figura 3). <img src="/files/ftp_upload/4229/4229fig1.jpg" alt="Figura 1" /> . Figura 1 Schema della fuoriserie rig compressione dinamica per stimolare condrociti-agarosio costrutti sinistra:. Rig assemblato destra:. Esploso che mostra i singoli componenti. <img src="/files/ftp_upload/4229/4229fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Modifiche Figura 2. Nel contenuto di DNA-agarosio condrociti idrogel stimolato meccanicamente sotto una ampiezza 10% di deformazione a compressione a 1 Hz per 20 a 60 minuti (media ± SEM, n = 6/group). Modifiche Figura 3. Nella sintesi della matrice extracellulare (collagene e proteoglicani) di condrociti-agarosio idrogel meccanicamente stimolato meno del 10% ampiezza di deformazione a compressione a 1 Hz per 20 a 60 minuti (media ± SEM, n = 6/group).

<ol><li>Grodzinsky, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cartilage+tissue+remodeling+in+response+to+mechanical+forces%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biomedical+Engineering%22%5BJournal%5D)">Cartilage tissue remodeling in response to mechanical forces.</a> Annual Review of Biomedical Engineering. 2, 691-713 (2000).</li>
<li>Kuettner, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biochemistry+of+articular+cartilage+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Biochemistry of articular cartilage in health and disease.</a> Clinical Biochemistry. 25, 155-163 (1992).</li>
<li>Neu, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+interface+of+functional+biotribology+and+regenerative+medicine+in+synovial+joints%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering+Part+B%3A+Reviews%22%5BJournal%5D)">The interface of functional biotribology and regenerative medicine in synovial joints.</a> Tissue Engineering Part B: Reviews. 14, 235-247 (2008).</li>
<li>Demarteau, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+compression+of+cartilage+constructs+engineered+from+expanded+human+articular+chondrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">Dynamic compression of cartilage constructs engineered from expanded human articular chondrocytes.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 310, 580-588 (2003).</li>
<li>Waldman, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+intermittent+compressive+stimulation+improves+the+composition+and+mechanical+properties+of+tissue-engineered+cartilage%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering%22%5BJournal%5D)">Long-term intermittent compressive stimulation improves the composition and mechanical properties of tissue-engineered cartilage.</a> Tissue Engineering. 10, 1323-1331 (2004).</li>
<li>Hunter, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+compression+of+chondrocyte-seeded+fibrin+gels%3A+effects+on+matrix+accumulation+and+mechanical+stiffness%5BTitle%5D)+AND+%22Osteoarthritis+and+Cartilage%22%5BJournal%5D)">Dynamic compression of chondrocyte-seeded fibrin gels: effects on matrix accumulation and mechanical stiffness.</a> Osteoarthritis and Cartilage. 12, 117-130 (2004).</li>
<li>Buschmann, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+compression+modulates+matrix+biosynthesis+in+chondrocyte%2Fagarose+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Mechanical compression modulates matrix biosynthesis in chondrocyte/agarose culture.</a> Journal of Cell Science. 108 (Pt 4), 1497-1508 (1995).</li>
<li>Quinn, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+compression+alters+proteoglycan+deposition+and+matrix+deformation+around+individual+cells+in+cartilage+explants%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Mechanical compression alters proteoglycan deposition and matrix deformation around individual cells in cartilage explants.</a> Journal of Cell Science. 111 (Pt 5), 573-583 (1998).</li>
<li>Kuettner, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+of+cartilage+matrix+by+mammalian+chondrocytes+in+vitro.+I.+Isolation%2C+culture+characteristics%2C+and+morphology%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Synthesis of cartilage matrix by mammalian chondrocytes in vitro. I. Isolation, culture characteristics, and morphology.</a> The Journal of Cell Biology. 93, 743-750 (1982).</li>
<li>Lee, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+loading+of+chondrocytes+embedded+in+3D+constructs%3A+in+vitro+methods+for+assessment+of+morphological+and+metabolic+response+to+compressive+strain%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Mechanical loading of chondrocytes embedded in 3D constructs: in vitro methods for assessment of morphological and metabolic response to compressive strain.</a> Methods in Molecular Medicine. 100, 307-324 (2004).</li>
<li>McGowan, K. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biochemical+quantification+of+DNA+in+human+articular+and+septal+cartilage+using+PicoGreen+and+Hoechst+33258%5BTitle%5D)+AND+%22Osteoarthritis+and+Cartilage%22%5BJournal%5D)">Biochemical quantification of DNA in human articular and septal cartilage using PicoGreen and Hoechst 33258.</a> Osteoarthritis and Cartilage. 10, 580-587 (2002).</li>
<li>Fan, J. C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+intermittent+static+biaxial+tensile+strains+on+tissue+engineered+cartilage%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Biomedical+Engineering%22%5BJournal%5D)">The effect of intermittent static biaxial tensile strains on tissue engineered cartilage.</a> Annals of Biomedical Engineering. 38, 1672-1682 (2010).</li>
<li>Kaupp, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+vibrations+increase+the+proliferation+of+articular+chondrocytes+in+high-density+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+Institution+of+Mechanical+Engineers%2C+Part+H%3A+Journal+of+Engineering+in+Medicine%22%5BJournal%5D)">Mechanical vibrations increase the proliferation of articular chondrocytes in high-density culture.</a> Proceedings of the Institution of Mechanical Engineers, Part H: Journal of Engineering in Medicine. 222, 695-703 (2008).</li>
<li>Waldman, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+intermittent+shear+deformation+improves+the+quality+of+cartilaginous+tissue+formed+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Orthopaedic+Research%22%5BJournal%5D)">Long-term intermittent shear deformation improves the quality of cartilaginous tissue formed in vitro.</a> Journal of Orthopaedic Research. 21, 590-596 (2003).</li>
<li>Waldman, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+single+application+of+cyclic+loading+can+accelerate+matrix+deposition+and+enhance+the+properties+of+tissue-engineered+cartilage%5BTitle%5D)+AND+%22Osteoarthritis+and+Cartilage%22%5BJournal%5D)">A single application of cyclic loading can accelerate matrix deposition and enhance the properties of tissue-engineered cartilage.</a> Osteoarthritis and Cartilage. 14, 323-330 (2006).</li>
<li>Kisiday, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+dynamic+compressive+loading+on+chondrocyte+biosynthesis+in+self-assembling+peptide+scaffolds%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomechanics%22%5BJournal%5D)">Effects of dynamic compressive loading on chondrocyte biosynthesis in self-assembling peptide scaffolds.</a> Journal of Biomechanics. 37, 595-604 (2004).</li>
<li>Chowdhury, T. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporal+regulation+of+chondrocyte+metabolism+in+agarose+constructs+subjected+to+dynamic+compression%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Biochemistry+and+Biophysics%22%5BJournal%5D)">Temporal regulation of chondrocyte metabolism in agarose constructs subjected to dynamic compression.</a> Archives of Biochemistry and Biophysics. 417, 105-111 (2003).</li>
</ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

<html> Il metodo descritto per l&#39;applicazione di stimoli meccanici controllati alla cella testa di serie agarosio idrogel permette l&#39;indagine diretta sugli effetti dinamici delle forze di compressione sul metabolismo dei condrociti. L&#39;uso del custom-test rig in combinazione con gli anelli di ritenuta previsto vincolo laterale per i costrutti di evitare potenziali problemi di campione ribaltamento. L&#39;uso di morti ponderati piani di carico garantiti da equipaggi set garantisce un contatto diretto con i cost...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome del reagente o attrezzature </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td><td> Commenti (opzionale) </td></tr><tr><td> Ham F-12 </td><td> Thermo Fisher Scientific </td><td> SH3001002 </td><td></td></tr><tr><td> Collagenasi A </td><td> Sigma Aldrich Ltd. </td><td> C0130 </td><td></td></tr><tr><td> Proteasi </td><td> Sigma Aldrich Ltd. </td><td> P5147 </td><td></td></tr><tr><td> Siero fetale bovino </td><td> Sigma Aldrich Ltd. </td><td> F1051 </td><td></td></tr><tr><td> Ascorbato </td><td> Sigma Aldrich Ltd. </td><td> A4034 </td><td></td></tr><tr><td> Gli antibiotici / antimicotici </td><td> Sigma Aldrich Ltd. </td><td> A5955 </td><td></td></tr><tr><td> HEPES </td><td> Bioshop Canada Ltd. </td><td> HEP001 </td><td></td></tr><tr><td> Blu Trypan </td><td> Sigma Aldrich Ltd. </td><td> 93595 </td><td></td></tr><tr><td> Reichert Luminoso-Line Emocitometro </td><td> Hausser scientifico </td><td> 1490 </td><td></td></tr><tr><td> Quant-iT PicoGreen </td><td> Invitrogen </td><td> P7589 </td><td></td></tr><tr><td> Papaina da papaia lattice </td><td> Sigma Aldrich Ltd. </td><td> P3125 </td><td></td></tr><tr><td> Ammonio acetato </td><td> Sigma Aldrich Ltd. </td><td> A1542 </td><td></td></tr><tr><td> Acid Ethyldiaminetetraacetic </td><td> Sigma Aldrich Ltd. </td><td> E9884 </td><td></td></tr><tr><td> DL-Dithiothreitol </td><td> Sigma Aldrich Ltd. </td><td> 43819 </td><td></td></tr><tr><td> Basso punto di fusione agarosio, Type VII </td><td> Sigma Aldrich Ltd. </td><td> A9045 </td><td></td></tr> &lt;tr&gt; <td> Schermo Mesh (200) Filtro </td><td> Sigma Aldrich Ltd. </td><td> S4145 </td><td></td></tr><tr><td> Mach-1 Tester micromeccanici </td><td> Biomomentum Inc. </td><td> V500cs </td><td></td></tr><tr><td> Compressione Caricamento Jig </td><td> Custom-built </td><td></td><td> Prodotto similare potrebbe essere fornito da Biomomentum Inc. </td></tr><tr><td> Falcon 24 piastra di coltura Bene </td><td> Thermo Fisher Scientific </td><td> B353047 </td><td></td></tr><tr><td> β-liquido di scintillazione Contatore </td><td> Beckman Coulter </td><td> LS6500 </td><td></td></tr><tr><td> [3H] prolina </td><td> Perkin-Elmer </td><td> NET323005MC </td><td></td></tr><tr><td> [35S] Zolfo </td><td> Perkin-Elmer </td><td> NEX041005MC </td><td></td></tr></tbody></table>

la stimolazione meccanica di condrociti-agarosio idrogel

Mechanical Stimulation of Chondrocyte-agarose Hydrogels

La cartilagine articolare soffre di una limitata capacità di riparazione, se danneggiato da insulto meccanico o degradato da malattie, come osteoartrite. Per rimediare a questa mancanza, diversi interventi medici sono stati sviluppati. Uno di questi metodi è quello di riaffiorare l&#39;area danneggiata con il tessuto-ingegnerizzato cartilagine, tuttavia, il tessuto ingegnerizzato manca in genere le proprietà biochimiche e la durata della cartilagine nativa, mettendo in discussione la sua sopravvivenza a lungo termine. Questo limita l&#39;applicazione di ingegneria tissutale cartilagine alla riparazione di piccoli difetti focali, basandosi sul tessuto circostante per proteggere il materiale impiantato. Per migliorare le proprietà del tessuto sviluppato, stimolazione meccanica è un metodo utilizzato per aumentare la sintesi di matrice extracellulare cartilaginea e le risultanti proprietà meccaniche del tessuto ingegnerizzato. Stimolazione meccanica applica forze al tessuto costrutti analoghi a quelli sperimentati in vivo. Questoè basato sulla premessa che l&#39;ambiente meccanico, in parte, regola lo sviluppo e la manutenzione di 1,2 tessuto nativo. La forma più comunemente applicato di stimolazione meccanica in ingegneria tissutale cartilagine è la compressione dinamica a ceppi fisiologiche di circa il 5-20% con una frequenza di 1 Hz 1,3. Diversi studi hanno studiato gli effetti della compressione dinamica e hanno mostrato di avere un effetto positivo sul metabolismo dei condrociti e biosintesi, infine influenzare le proprietà funzionali del tessuto sviluppato 4-8. In questo lavoro, ci illustrano il metodo per stimolare meccanicamente condrociti-agarosio costrutti idrogel in compressione dinamica e analizzare i cambiamenti nella biosintesi attraverso test biochimici e radioisotopi. Questo metodo può essere facilmente modificato per valutare eventuali cambiamenti potenzialmente indotti in risposta cellulare a seguito di stimoli meccanici.

La biosintesi di matrice extracellulare cartilaginea dai condrociti può essere influenzata da applicazione di stimoli meccanici. Questo metodo descrive la tecnica di applicazione di compressione dinamiche ceppi di condrociti incapsulati in costrutti 3D e la valutazione dei cambiamenti indotti nel metabolismo dei condrociti.

La stimolazione meccanica di condrociti-agarosio idrogel

La cartilagine articolare presenta una limitata capacità di riparazione quando è danneggiata da traumi meccanici o degradata da patologie, come l'osteoartrite. Per rimediare...

L'obiettivo generale di questa procedura è applicare un carico meccanico compressivo dinamico a idrogeli seminati con cellule. Per ottenere questo risultato, le cellule primarie vengono ottenute mediante dissezione e digestione enzimatica di fette di cartilagine. Le cellule isolate vengono incapsulate in un idrogel allo 2% di agarosio e vengono creati costrutti seminati con cellule utilizzando un punch per biopsia.I campioni vengono quindi posizionati nel dispositivo di carico compressivo e inseriti in un micro stimolatore meccanico mach one. Viene quindi applicato un carico compressivo dinamico ai costrutti seminati con cellule per valutare la sintesi di collagene e proteoglicani. I costrutti vengono radiomarcati dopo l'incubazione e il relativo incorporamento.Gli isotopi vengono quantificati mediante conteggio a scintillazione dei dati risultanti, i quali vengono normalizzati rispetto al DNA. I risultati mostrano variazioni nella sintesi della matrice extracellulare in seguito a stimolazione meccanica. Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sulla risposta del sito controllaterale e sulla stimolazione meccanica.È possibile applicarlo anche ad altri sistemi, come cellule staminali, altri tessuti connettivi o cellule meccanorecettrici. Le articolazioni metacarpo-falangee di bovini adulti dal punto di vista scheletrico, utilizzate in questo caso, sono state ottenute da un macello locale e lavorate in un'area di dissezione sterile. All'interno di una cappa a flusso laminare, collocare le fette di cartilagine in una piastra di Petri da 100 millimetri contenente 20 millilitri di Hams F12 con l'aggiunta dello 0,5% di proteasi e incubare per due ore a 37 gradi Celsius.Dopo l'incubazione sotto vuoto, aspirare la soluzione di proteasi e risciacquare le sezioni aggiungendo delicatamente il mezzo di coltura Hams F12 con movimenti rotatori, quindi aspirare. Ripetere questo lavaggio altre due volte; dopo il terzo lavaggio, aspirare sotto vuoto il mezzo di coltura.Aggiungere 20 millilitri di Hams F12 contenenti 0,15% di collagenasi A e incubare le piastre durante la notte a 37 gradi Celsius. Il giorno successivo, pipettare la sospensione cellulare attraverso un filtro a maglia 200 in una nuova capsula di Petri; per lavare il filtro, aggiungere ulteriori cinque millilitri di Hams F12, raccogliendo il flusso passante nella stessa capsula. Trasferire la sospensione cellulare in un tubo conico da 50 millilitri.Lavare la piastra di Petri con 10 millilitri di Hams F12. Quindi aggiungere la soluzione di lavaggio al tubo conico. Centrifugare il tubo a 600-800 RCF per sei-otto minuti a temperatura ambiente.Al termine della centrifugazione, aspirare il soprannatante avendo cura di non disturbare il pellet cellulare. Risospendere il pellet in 40 millilitri di mezzo di coltura. Centrifugare il tubo a 600-800 RCF per sei-otto minuti.Ripetere l'aspirazione, la risospensione e la centrifugazione altre due volte, per un totale di tre cicli prima della terza centrifugazione. Risospendere il pellet mediante agitazione e prelevare un'aliquote di 500 microlitri per il conteggio cellulare. Durante la terza centrifugazione, utilizzare un emocitometro e un microscopio ottico invertito per contare le cellule vitali nell'aliquote mediante esclusione del blu di trian.Una volta determinato il numero di cellule e completata la terza centrifugazione, aspirare il sovranatante e il resuspensione. Sospendere il pellet in un volume di mezzo di coltura pari al doppio della densità di semina desiderata. In questo caso, i condrociti vengono risospesi a una concentrazione di 20 volte 10 alla sesta cellule per millilitro.Il passaggio successivo della procedura consiste nell'incapsulare i condrociti articolari primari isolati in un idrogel di aros. In un becher, sospendere 0,8 grammi di aros in 20 millilitri di PBS sterile. Porre il becher su un piastra riscaldante impostata a 120 gradi Celsius non appena l'aros si scioglie.Abbassare la temperatura a 60 gradi Celsius in un tubo conico da 50 millilitri. Combinare volumi uguali della sospensione cellulare con il doppio della concentrazione desiderata della soluzione di aro riscaldata. In questo caso, cinque millilitri di sospensione cellulare vengono aggiunti a cinque millilitri di sospensione di agaro al 4% per ottenere una miscela finale di idrogel al 2% di Agros, mescolando accuratamente mediante pipettaggio e facendo attenzione a non formare bolle di grandi dimensioni, che potrebbero compromettere la vitalità cellulare.Successivamente, aggiungere con attenzione 10 millilitri della miscela di agros condrociti in una piastra di Petri di diametro 60 millimetri. Ancora una volta, evitando la formazione di bolle di grandi dimensioni. Coprire la piastra con il coperchio.Quindi lasciare riposare la miscela per 30 minuti a temperatura ambiente. Una volta che la miscela si è solidificata, utilizzare un punch per biopsia di quattro millimetri per ottenere il maggior numero possibile di campioni di idrogel acrilico a base di condrociti. In genere, si ottengono da 20 a 30 campioni.Posizionare i campioni in una piastra di Petri pulita utilizzando una misura al micrometro e registrare il diametro e l'altezza di ciascun campione. Idealmente, il costrutto dovrebbe avere un'altezza di circa cinque millimetri; scartare tutti i campioni ottenuti da una regione in cui l'altezza del campione supera il 2%. Trasferire i campioni in una nuova piastra di Petri da 60 millimetri contenente 10 millimetri di mezzo completo. In questa parte del protocollo, i costrutti cellulari verranno stimolati meccanicamente mediante compressione dinamica.Questo sarà realizzato utilizzando un apparato di compressione su misura che accoppia meccanicamente il caricamento dei PLA al costrutto a un sistema micro-meccanico fittizio, il quale controlla l'entità della compressione applicata ai costrutti. L'aspetto più complesso della procedura consiste nel caricare i campioni nell'apparato di compressione. È fondamentale regolare correttamente le piastre nell'apparato per garantire un'applicazione appropriata del carico compressivo dinamico.Prima dell'uso, sterilizzare le componenti metalliche del dispositivo di compressione in un autoclave. Sterilizzare le componenti in plastica con etanolo al 70% per tutta la notte e con luce UV per almeno 15 minuti. Per evitare che gli idrogel con condrociti cadano.Utilizzare pinze per posizionare 12 anelli di ritenzione in plastica sterili nei pozzetti di una piastra da coltura a 24 pozzetti. Il diametro interno degli anelli di ritenzione deve essere maggiore rispetto al diametro dei costrutti. Procedere con attenzione utilizzando le pinze.Trasferire gli idrogeli chondro aros dalla piastra di Petri alla piastra a 24 pozzetti, posizionando ciascuno al centro di un anello di ritenzione. Aggiungere 400 microlitri di mezzo completo a ciascun campione. Successivamente, assemblare l'apparato di compressione sterilizzato e, utilizzando le viti di bloccaggio, fissare le PLAs.Collegare il dispositivo di compressione alla piastra per colture a 24 pozzetti per stabilire il rilascio del contatto dell'idrogel e riposizionare. La deformazione del dispositivo verrà applicata a questo stato di riferimento senza carico o stato di deformazione zero. Inserire il dispositivo di compressione assemblato in un sistema di prova micro-meccanico Mach one con il perno di posizionamento.Fissare il dispositivo al palco verticale e quindi utilizzare una vite di bloccaggio per bloccarlo in posizione. Rimuovere il calibro di spaziatura. Utilizzare l'interfaccia software Mach one per impostare la frequenza a un hertz, l'ampiezza a 350 micron e il numero di cicli a 1.200.Questo applica un carico compressivo dinamico con un'ampiezza di deformazione del 10% rispetto all'altezza originale dei campioni. Per iniziare la stimolazione meccanica, premere il pulsante di avvio, l'attuatore mach one. Il dispositivo di carico che si aggancia alla piastra di coltura presenta sei indentazioni che si muovono verso l'alto e verso il basso, stimolando contemporaneamente sei campioni.I campioni di controllo non stimolati si trovano anche nella stessa piastra di coltura, ma non vengono posizionati nei pozzetti con le incisioni. Al termine della procedura, il mach one emetterà un segnale acustico e l'attuatore passerà allo stato di riferimento senza carico. Al termine della stimolazione meccanica, sostituire il calibro distanziatore.Allentare la vite di bloccaggio del perno di posizionamento ed estrarre il dispositivo di compressione e la piastra di coltura dal sistema di prova accanto all'etichetta radioattiva; pipettare in ciascun pozzetto cinque microcurie di prolina marcata al trizio come etichetta proteica specifica per la sintesi del collagene nei condrociti e S-35 per la sintesi dei proteoglicani. Incubare i costrutti marcati radioattivamente per 24 ore a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica per raccogliere i costrutti idrogel marcati. Utilizzare pinzette per risciacquare ogni costrutto idrogel per tre volte immergendolo in PBS, al fine di rimuovere l'isotopo non incorporato, quindi posizionare il costrutto risciacquato in una provetta da 1,5 millilitri.Successivamente, aggiungere 500 microlitri di soluzione pape nei tubi da 1,5 millilitro. Posizionarli su un blocco riscaldante e lasciarli digerire a 65 gradi Celsius per 72 ore. Una volta completata la digestione, il campione dovrebbe apparire relativamente chiaro.Immediatamente dopo la digestione con pape, prelevare aliquote di 100 microlitri da ogni campione per determinare il contenuto di DNA utilizzando il saggio pico green D. Successivamente, prelevare un'aliquote di 100 microlitri da ogni campione per determinare l'attività dell'isotopo incorporato mediante conteggio della scintillazione liquida beta. L'attività dell'isotopo risultante deve quindi essere normalizzata rispetto al contenuto di DNA per l'analisi.Costrutti a base di idrogel di aros condrociti articolari bovini composti dal 2% di aros con 10 × 10⁶ cellule per millilitro di cellule incapsulate sono stati stimolati meccanicamente con un'ampiezza del 10% di deformazione compressiva a una frequenza di 1 hertz per 20-60 minuti, ovvero 1.200-3.600 cicli. Successivamente sono stati analizzati per contenuto di DNA e sintesi della matrice extracellulare mediante incorporazione di radioisotopi.Come si può vedere qui, la sintesi di DNA e della matrice extracellulare è risultata influenzata in maniera dose-dipendente. Il contenuto di DNA ha mostrato una significativa diminuzione del 35% a seguito di una stimolazione di 20 o 30 minuti, con un valore p inferiore a 0,01; una stimolazione di 60 minuti non ha mostrato alcun effetto. La sintesi del collagene e dei proteoglicani specifici della cartilagine è stata determinata mediante l'incorporazione rispettivamente di trizio, prolina e zolfo S-35.Questi hanno mostrato aumenti significativi di circa il 60% in risposta a 20 o 30 minuti di stimolazione, con un valore p inferiore a 0,01; 60 minuti di stimolazione non hanno prodotto un effetto osservabile. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come stimolare meccanicamente colture di idrogel utilizzando l'impronta dinamica e di come adattare questo protocollo per applicazioni simili.

mechanical-stimulation-of-chondrocyte-agarose-hydrogels

Research

Ricerca

JoVE Journal

Biology

Biologia

Un sistema 3D di coltura di condrociti articolari umani in alti livelli di liquido sinoviale è descritto. Liquido sinoviale riflette il microambiente più naturale per la cartilagine articolare, e può essere facilmente ottenuti e memorizzati. Questo sistema quindi può essere utilizzato per studiare la rigenerazione della cartilagine e per terapie di screening per il trattamento di artrite.

Un sistema 3D per condrociti articolari umani in coltura liquido sinoviale

Abbiamo progettato un nuovo bioreattore carico meccanico in grado di applicare sollecitazioni meccaniche monoassiale o biassiale per un biocomposite cartilagine prima del trapianto in un difetto della cartilagine articolare.

Progettazione di un biassiale Carico meccanico bioreattore per l&#39;ingegneria tissutale

Un bioprinter stato usato per creare idrogel patterned basato su uno stampo sacrificale. Lo stampo poloxamer stata riempita con un secondo idrogel e quindi eluita, lasciare vuoti che sono stati riempiti con una terza idrogel. Questo metodo utilizza eluizione veloce e buona stampabilità di polossalene di generare architetture complesse di biopolimeri.

La stampa termosensibile Stampi inversa per la Creazione di Patterned idrogeli a due componenti per coltura cellulare 3D

La riparazione della cartilagine rappresenta una sfida medica insoddisfatta e gli approcci basati sulle cellule per ingegnerizzare la cartilagine articolare umana sono una soluzione promettente. Qui, descriviamo gli idrogel biomimetici tridimensionali (3D) come uno strumento ideale per l'espansione e la maturazione dei condrociti articolari umani.

3D Hydrogel Ponteggi per articolare condrociti, Cultura e Cartilagine Generation

Un iniettabili impalcatura ingegneria tissutale composta da poli (N-isopropilacrilammide) solfato -graft-condroitina (PNIPAAm-g-CS) contenenti, microparticelle di alginato è stato preparato. La forza adesiva, gonfiore proprietà e in biocompatibilità vitro vengono analizzati in questo studio. Le tecniche di caratterizzazione sviluppate qui possono essere applicabili ad altri sistemi thermogelling.

Sintesi di Thermogelling poli (N-isopropilacrilammide) -graft-condroitin solfato compositi con alginato microparticelle per ingegneria dei tessuti

Lo stress meccanico può indurre la differenziazione condrogenica delle cellule staminali, fornendo un potenziale approccio terapeutico per la riparazione della cartilagine compromessa. Presentiamo un protocollo per indurre la differenziazione condrogenica di cellule staminali di derivazione adiposa (ASC) utilizzando la gravità centrifuga (CG). L'upregolazione di SOX9 indotta dalla CG porta allo sviluppo di fenotipi condrogenici.

Condrogenico Differenziazione induzione di cellule staminali derivate da tessuto adiposo per gravità centrifuga

Condrogenesi da cellule staminali richiede la messa a punto delle condizioni di coltura. Qui vi presentiamo un approccio magnetico per condensare le cellule, un passo essenziale per iniziare condrogenesi. Inoltre, mostriamo che la maturazione dinamico in un bioreattore applica stimolazione meccanica ai costrutti cellulari e aumenta la produzione di matrice extracellulare cartilaginea.

3D Stem magnetica cellulare Aggregazione e bioreattore maturazione per la cartilagine Regeneration

Questo articolo fornisce metodi dettagliati per la fabbricazione e la caratterizzazione di un dispositivo microfluidico azionato retice per la compressione condrocitica.

Una piattaforma microfluidica per stimolare i condrociti con la compressione dinamica

La terapia ossea tramite ossificazione endocondrale mediante l'impianto di tessuto cartilagineo artificiale prodotto da cellule staminali mesenchimali ha il potenziale per aggirare gli inconvenienti delle terapie convenzionali. Gli idrogel di acido ialuronico sono efficaci nel ridimensionare gli innesti di cartilagine uniformemente differenziati e nel creare osso integrato con vascolarizzazione tra innesti fusi in vivo.

Formazione ossea integrata attraverso l'ossificazione endocondrale in vivo utilizzando cellule staminali mesenchimali

Questo studio descrive un metodo per la produzione di sferoidi condrocitici aggregando le cellule in sferoidi in condizioni di bassa adesione utilizzando la gravità, seguita dalla coltura degli sferoidi risultanti in mini-bioreattori.

Generazione di sferoidi da vari condrociti utilizzando condizioni di bassa adesività per gravità e mini-bioreattori fatti in casa

Impara a stimolare meccanicamente i condrociti in idrogel di agarosio per studiare la sintesi di collagene e proteoglicani. Questo metodo permette di analizzare la risposta metabolica cellulare in condizioni dinamiche.

La stimolazione meccanica di condrociti-agarosio idrogel

Esplora altri video