Name: Misurazione degli effetti degli anticorpi sulla funzione cellulare di cardiomiociti isolati (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-03-08T12:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 42 s
Description: Scopri come rilevare anticorpi cardiotropici nel plasma di pazienti con cardiomiopatia dilatativa usando cardiomiociti isolati di ratto Wistar. Questo metodo analizza la contrattilità cellulare e i transitori di calcio intracellulare.

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Questo lavoro è stato sostenuto dal Transregio Sonderforschungsbereich 19 (SFB/TR19, C2) della Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG), il Ministero Federale dell&#39;Economia e della Tecnologia progetto ZIM-KF 2727801MD0 e il Centro di Competenza Innovation - risposte immunitarie umorali in Malattie Cardiovascolari ( ZIK-ESCURSIONE, BMBF FKZ 03Z2CN12) del Ministero federale dell&#39;Istruzione e della Ricerca, in Germania. Corpo e gli esperimenti con gli animali sono stati eseguiti in conformità con le raccomandazioni della Società per Laboratorio Scienze Animali (Gesellschaft für Versuchstierkunde, GV-SOLAS) e la Federazione di Laboratorio europeo di Animal Science Association (FELASA).

1. Isolamento IgG da campioni di pazienti <ol><li> Preparare mini-immunoassorbimento colonne di riempimento 3 ml di anti-IgG sepharose paziente per 2 ml di plasma EDTA in una colonna vuota Econo Pac. IgG isolamento richiede almeno 2 ml di plasma del paziente. </li><li> Collocare un filtro sopra l&#39;anti-IgG Sepharose, tagliare aprire l&#39;estremità inferiore della colonna e premere il filtro per raggiungere una portata di circa 1 goccia / sec. Lasciare la soluzione di conservazione corto di colonna. </li><li> Lavare la colonna con 3 volumi NaCl 0,9% per volume di plasma. </li><li> Pipettare il plasma sulla colonna. Quando il plasma è completamente immerso nel anti-IgG Sepharose, lavare con lo stesso volume 0,9% NaCl. </li><li> Pipetta un volume plasmatico di 0,2 M glicina HCl, pH 2,8 su colonna e lasciare immergere nel Sepharose. Aggiungere un altro volume di glicina HCl sulla colonna. Raccogliere il flusso attraverso un tubo 15 ml e regolare il pH a 7,3 con 0,5 M Tris-HCl, pH 8,0. </li><li> Per rigenerare la colonna, Lavare con 3 volumi di plasma glicina HCl. Dopo un lavaggio finale con 2 volumi 0,9% NaCl, la colonna può essere utilizzato per il campione di plasma successivo. In alternativa, la colonna può essere riempita di soluzione di conservazione e conservata a 4-8 ° C fino a 4 settimane. </li><li> Per uso su cardiomiociti, la frazione IgG collezionati deve essere dializzato contro tampone sperimentale (EB). Per la preparazione della EB, aggiungere 117 mM NaCl, 2,8 mM KCl, 0,6 mM MgCl2, 1,2 mM KH 2 PO 4, 1.2 mM CaCl 2, 10 mM HEPES e 20 mM di glucosio ad 1 L di acqua distillata su un agitatore magnetico e regolare il pH a 7,3. </li><li> Riempire la frazione IgG di un tubo estere di cellulosa membrana di dialisi con un peso molecolare tagliato di 100 kDa. Mettere il tubo in 1 L EB e mescolare lentamente con un agitatore magnetico a 4 ° C. Dopo 8 ore, trasferire il tubo di dialisi in 3 L di EB fresco e dializza per un&#39;altra ora e 20 a 4 ° C. </li><li> Seguendo la dialisi, il calore del campione per 30 min a 57 ° C in un bagno d&#39;acqua a inactivatposta complemento fattori. Determinare la concentrazione totale di IgG e preparare aliquote di 330 mg ogni IgG. Quando si aggiunge il campione di cardiomiociti di misura (fase 4.3), riempire le aliquote di 1 ml con EB. Aliquote non diluiti possono essere conservati a -20 ° C fino ad ulteriore utilizzo. </li></ol> 2. Isolamento di cardiomiociti di ratto <ol><li> Per la preparazione di Ca 2 +-tampone privo di isolamento (IB), aggiungere 110 mM NaCl, 2,6 mM KCl, 1,2 mM MgSO 4, 1,2 mM KH 2 PO 4, 20 mM HEPES e 11 mM di glucosio ad 1 L di acqua distillata con un magnetico agitatore. Portare il pH a 7,4, a temperatura ambiente e filtrare attraverso un filtro 0,2 micron top bottiglia per la sterilizzazione. </li><li> Riempire 80 ml di IB nel serbatoio superiore di un sistema di perfusione Langendorff termostatata. Regolare le impostazioni del termostato per mantenere una temperatura di buffer di 37 ° C e aerare buffer con 95% O 2/5% di CO 2 per 30 min. </li><li> Pesare circa 10.000 - 12.000 U di collagenase tipo II, 175 mg di acidi grassi liberi BSA e si sciolgono in 20 ml contenenti IB 22,5 pl di una mm 100 CaCl2 soluzione madre. Controllare il pH del tampone di isolamento nel serbatoio superiore e regolare se necessario. </li><li> Anestetizzare un ratto Wistar di 175 - 200 g con 375 mg / kg di peso corporeo tiopentale. Aggiungi 2500 UI di eparina alla soluzione tiopentale. Dopo toracotomia, accisa il cuore con cura con un arco aortico intatto e le trasferisce in gelata NaCl 0,9%. Pulire il cuore da sangue e tessuto circostante e trasferimento a fresco 0,9% NaCl. Esporre l&#39;aorta, aprire il riduttore di flusso del sistema Langendorff per ottenere una velocità di gocciolamento di 2-3/sec e attaccare il cuore alla cannula. </li><li> Perfondere il cuore fino a 3 minuti con una portata di 1 goccia / sec per lavare il sangue rimanente. Inizia a circolare le IB nel sistema Langendorff. Rimuovere 20 ml di tampone dal serbatoio superiore, caricare la soluzione collagenasi e riempire come buffer quanto necessario per raggiungere 80 ml. Far circolare il c<html> ollagenase soluzione per un altro 27 min. Portata deve essere controllata periodicamente e mantenuta a 1 goccia / sec utilizzando il riduttore di flusso. </li><li> Staccare il cuore dalla cannula, pulito da atri e aorta e tagliare in piccoli pezzi. Lasciare che la soluzione di collagenasi di scorrere nel serbatoio inferiore, ridurre il volume ad un massimo di 40 ml e in seguito digerire i ventricoli tritate per 10 - 15 minuti sotto aerazione continua con il 95% O 2/5% di CO 2. Successivamente, filtrare la sospensione cellulare con una garza 200 micron dimensione delle maglie in una provetta da 50 ml. </li><li> Ripristinare il Ca 2 + contenuto delle celle in 3 fasi: centrifugare la sospensione cellulare a 43 xg per 2 minuti a temperatura ambiente e risospendere le cellule in 10 ml contenenti IB 200 mM CaCl 2. Centrifugare nuovamente e risospendere le cellule in 10 ml IB con 500 mM CaCl 2. Dopo una centrifugazione finale risospendere in cardiomiociti EB filtrata sterile (vedi 1.8) ad una densità di 50.000 cellule / ml. </li></ol>e_title &quot;&gt; 3. Fura-2 colorazione dei cardiomiociti <ol><li> Cappotto a 4 coprioggetti ben camerata con 10 laminina pg per bene e attendere che sia completamente asciugato. </li><li> Riempire 1 ml della sospensione cardiomiocita in ogni pozzetto usando una micropipetta con una punta di taglio. Permettere alle cellule di aderire per 1 ora a temperatura ambiente. </li><li> Diluire 10 ml di 1 mg / ml Fura-2 AM soluzione madre in 5 ml di EB. Conservare la soluzione di colorazione al buio. </li><li> Togliere celle buffer e distaccato dal coprioggetto e pipettare 0,5 ml di soluzione colorante in ogni pozzetto. Incubare le cellule per 10 minuti sotto agitazione moderata. Successivamente, togliere la soluzione colorante, lavare le cellule una volta con 1 ml di EB e riempire EB 0,5 ml in tutti i pozzetti. Evitare la luce diretta durante il processo di colorazione e tenere sempre le cellule colorate al buio. </li></ol> 4. Registrazione di accorciamento cellulare e Ca 2 + transitori <ol><li> Posizionare il coprioggetto a camera su un m inversa fluorescenzaicroscope collegato ad un calcio miociti e sistema di registrazione contrattilità. Posizionare un elettrodo di misura con un afflusso ed efflusso del tubo nel primo pozzetto. Cardiomiociti Superfuse con 1 ml / min EB e iniziare la stimolazione elettrica (20 V, 1 Hz, durata di 5 msec). Permettere alle cellule di adattarsi alla stimolazione per circa 2 min. </li><li> Scegli una cardiomiociti intatto a forma di asta con striatura chiara e costante contrazione. Posizionare la cella al centro del campo visivo e aprire il canale. Orientare la cella orizzontalmente all&#39;interno dell&#39;area video ruotando l&#39;adattatore inquadratura cella e spostando la fase microscopio. </li><li> Regolare il bordo rilevare elementi di controllo della zona video (Figura 2), aprire il canale fluorescente e registrare 10-15 contrazioni per ottenere la riduzione iniziale delle cellule e Ca 2 + transitori. </li><li> Chiudere il canale di luce del microscopio per evitare sbiancamento della macchia fluorescenza. Accendere il flusso attraverso da EB al campionebypass con una valvola a 3 vie e cardiomiociti superfuse con 1 ml di IgG paziente. Fermare la pompa poco prima che l&#39;aria raggiunga il bene. </li><li> Aprire il canale di luce e registrarne un altro 10-15 contrazioni per ottenere la risposta acuta cella. Mettere in pausa la registrazione e chiudere il canale di nuovo luce. Ripetere la registrazione dopo 2 e 5 min. </li><li> Estrarre l&#39;elettrodo di pozzo. Pulire accuratamente le provette con EB e continuare con il pozzo successivo del coprioggetti incamerata. </li><li> Analizzare l&#39;accorciamento cella e Ca 2 + temporaneo con il software IonWizard utilizzando il &quot;Edge-Length/Length&quot; e la finestra &quot;fura 2-numerico sottratto / Ratio&quot;, rispettivamente. Calcolare la variazione percentuale dal accorciamento cellula iniziale e Ca 2 + transitoria dell&#39;altezza del picco cui la linea di base (bl% picco h) per l&#39;acuta, il 2 min e la risposta di 5 min. </li></ol>

<ol><li>Roger, V. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heart+disease+and+stroke+statistics--2011+update%3A+a+report+from+the+American+Heart+Association%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Heart disease and stroke statistics--2011 update: a report from the American Heart Association.</a> Circulation. 123 (4), e18(2011).</li>
<li>Caforio, A. L., Vinci, A., Iliceto, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anti-heart+autoantibodies+in+familial+dilated+cardiomyopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Autoimmunity%22%5BJournal%5D)">Anti-heart autoantibodies in familial dilated cardiomyopathy.</a> Autoimmunity. 41 (6), 462(2008).</li>
<li>Yoshikawa, T., Baba, A., Nagatomo, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autoimmune+mechanisms+underlying+dilated+cardiomyopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Circ.+J%22%5BJournal%5D)">Autoimmune mechanisms underlying dilated cardiomyopathy.</a> Circ. J. 73 (4), 602(2009).</li>
<li>Felix, S. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hemodynamic+effects+of+immunoadsorption+and+subsequent+immunoglobulin+substitution+in+dilated+cardiomyopathy%3A+Three-month+results+from+a+randomized+study%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+College+of+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Hemodynamic effects of immunoadsorption and subsequent immunoglobulin substitution in dilated cardiomyopathy: Three-month results from a randomized study.</a> Journal of the American College of Cardiology. 35 (6), 1590(2000).</li>
<li>Staudt, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+immunoglobulin+G3+subclass+in+dilated+cardiomyopathy%3A+results+from+protein+A+immunoadsorption%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+Heart+J%22%5BJournal%5D)">Role of immunoglobulin G3 subclass in dilated cardiomyopathy: results from protein A immunoadsorption.</a> Am. Heart J. 150 (4), 729(2005).</li>
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<li>Gocayne, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+structure+of+rat+cardiac+beta-adrenergic+and+muscarinic+cholinergic+receptors+obtained+by+automated+DNA+sequence+analysis%3A+further+evidence+for+a+multigene+family%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Primary structure of rat cardiac beta-adrenergic and muscarinic cholinergic receptors obtained by automated DNA sequence analysis: further evidence for a multigene family.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 84 (23), 8296(1987).</li>
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<li>Grynkiewicz, G., Poenie, M., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+generation+of+Ca2%2B+indicators+with+greatly+improved+fluorescence+properties%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">A new generation of Ca2+ indicators with greatly improved fluorescence properties.</a> J. Biol. Chem. 260 (6), 3440(1985).</li>
<li>Magnusson, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autoimmunity+in+idiopathic+dilated+cardiomyopathy.+Characterization+of+antibodies+against+the+beta+1-adrenoceptor+with+positive+chronotropic+effect%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Autoimmunity in idiopathic dilated cardiomyopathy. Characterization of antibodies against the beta 1-adrenoceptor with positive chronotropic effect.</a> Circulation. 89 (6), 2760(1994).</li>
<li>Wakefield, I. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+application+of+in+vitro+methods+to+safety+pharmacology%5BTitle%5D)+AND+%22Fundam.+Clin.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">The application of in vitro methods to safety pharmacology.</a> Fundam. Clin. Pharmacol. 16 (3), 209(2002).</li>
<li>Kajzar, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toward+physiological+conditions+for+cell+analyses%3A+forces+of+heart+muscle+cells+suspended+between+elastic+micropillars%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Toward physiological conditions for cell analyses: forces of heart muscle cells suspended between elastic micropillars.</a> Biophys. J. 94 (5), 1854(2008).</li>
</ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Il metodo proposto offre un modo adatto a rilevare autoanticorpi funzionalmente efficaci cardiaci in pazienti con DCM di origine poco chiara. In confronto ad altri metodi, ad esempio il rilevamento di anticorpi funzionali attivi contro l&#39;β1-adrenocettori da loro impatto sui livelli di cAMP 6, il nostro metodo è indipendente da uno specifico epitopo. Naturalmente ci sono altri saggi indipendenti epitopi descritti nella letteratura, cioè contando il tasso battendo cardiomiociti neonatali d...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome del reagente / attrezzature </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td><td> Commenti </td></tr><tr><td> Immunosorba conservazione soluzione </td><td> Fresenius Medical Care </td><td> 903609211 </td><td></td></tr><tr><td> Collagenasi di tipo 2 </td><td> Cella di sistema </td><td> LS004176 </td><td></td></tr><tr><td> BSA, acidi grassi liberi </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A6003 </td><td></td></tr><tr><td> Laminina </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> L2020 </td><td></td></tr><tr><td> Fura-2 AM </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> F0888 </td><td> 1 mg / ml in DMSO </td></tr><tr><td> Econo Pac Cromatografia Colonne </td><td> BioRad </td><td> 732-1010 </td><td></td></tr><tr><td> Spectra / Por Biotech Cellulosa Ester dialisi Membrane </td><td> Spectrumlabs </td><td> 131417 </td><td></td></tr><tr><td> 4 ben Chambered vetrino </td><td> Nunc </td><td> 155383 </td><td></td></tr><tr><td> Calcio miociti e Sistema di registrazione contrattilità </td><td> IonOptix </td><td></td><td></td></tr><tr><td> IonWizard 6,0 ​​software di analisi </td><td> IonOptix </td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

misurazione degli effetti degli anticorpi sulla funzione cellulare di cardiomiociti isolati

Measurement of Antibody Effects on Cellular Function of Isolated Cardiomyocytes

Cardiomiopatia dilatativa (DCM) è una delle principali cause di insufficienza cardiaca nei giovani adulti 1. Sebbene predisposizione genetica ed esposizione a sostanze tossiche sono note cause per questa malattia in circa un terzo dei pazienti, l&#39;origine di DCM rimane poco chiara. In un numero considerevole di questi pazienti, gli anticorpi contro epitopi cardiaci sono stati individuati e sono sospettati di svolgere un ruolo centrale nella insorgenza e la progressione della malattia 2,3. L&#39;importanza di autoanticorpi cardiache è sottolineata da un miglioramento emodinamico osservato nei pazienti DCM dopo l&#39;eliminazione di autoanticorpi da immunoassorbimento 3-5. Una varietà di antigeni specifici sono già stati individuati 2,3 e anticorpi contro tali obiettivi possono essere rilevati da immunosaggi. Tuttavia, questi test non può discriminare tra stimolante (e quindi funzionalmente efficaci) e bloccando autoanticorpi. Vi è una crescente evidence che questa distinzione è cruciale 6,7. Si può anche ritenere che gli obiettivi di un certo numero di anticorpi cardiotropic sono ancora da identificare e pertanto non può essere rilevato dal test immunologici. Pertanto, abbiamo stabilito un metodo per la rilevazione di anticorpi funzionalmente attivi cardiotropic, indipendentemente dal loro rispettivo antigene. Lo sfondo per il metodo è l&#39;alta omologia di solito osservata per le regioni funzionali di proteine ​​cardiache nei mammiferi tra 8,9. Questo suggerisce che gli anticorpi diretti contro antigeni cardiaci umani reazione crociata con non umani cellule bersaglio, che permette prove di IgG da pazienti DCM su cardiomiociti di ratto adulto. Il nostro metodo si compone di 3 fasi: la prima, IgG è isolato dal plasma del paziente con sefarosio accoppiati anti-IgG anticorpi ottenuti da colonne immunoassorbimento (PlasmaSelect, Teterow, Germania). Secondo, cardiomiociti adulti sono isolati mediante perfusione con collagenasi in un apparato perfusione Langendorff utilizzando apROTOCOLLO modificato da lavori precedenti 10,11. I cardiomiociti ottenuti sono allegati alla laminina rivestite chambered vetrini colorati con Fura-2, un inibitore selettivo colorante fluorescente che può essere facilmente portato nella cella di osservare intracellulare di calcio (Ca 2 +) contenuti 12. Nell&#39;ultimo passaggio, l&#39;effetto del paziente IgG sulla riduzione delle cellule e Ca 2 + transitori di cardiomiociti campo stimolate è monitorato on-line utilizzando un calcio commerciale miociti e sistema di monitoraggio contrattilità (IonOptix, Milton, MA, USA) collegato ad una fluorescente standard di inversa microscopio.

Due esempi per la misurazione di inotropismo cellulare nel campo stimolato cardiomiociti adulti (figura 2) utilizzando una miociti Ca 2 + e registrazione contrattilità sono riportati di seguito. Figura 3 dà l&#39;impressione di una misura di controllo, mentre in figura 4 l&#39;effetto di anticorpi cardiodepressive di un paziente con DCM è mostrato. In entrambi gli esempi, accorciamento cellula iniziale e Ca 2 + transito...

Il metodo proposto offre un modo per rilevare funzionali autoanticorpi cardiotropic efficaci nel plasma di pazienti con cardiomiopatia dilatativa, indipendentemente l&#39;antigene specifico, analizzando l&#39;impatto di immunoglobulina paziente isolato su accorciamento cellulare e transienti di calcio intracellulare in cardiomiociti isolati di ratto.

Misurazione degli effetti degli anticorpi sulla funzione cellulare di cardiomiociti isolati

La cardiomiopatia dilatativa (DCM) è una delle cause principali di insufficienza cardiaca negli adulti giovani1. Sebbene la predisposizione genetica e l'esposizione a sostanze tossiche...

L'obiettivo generale del seguente esperimento è rilevare gli anticorpi cardiocinetropi nel plasma di pazienti affetti da cardiomiopatia dilatativa o da altre malattie cardiache con base autoimmune. Questo viene ottenuto mediante un'immunoassorbimento iniziale su colonne di sferosilice rivestite con anti-IgG per purificare l'immunoglobulina G come secondo passaggio. I cardiomiociti ventricolari vengono isolati da ratti Wistar adulti, fornendo la base cellulare per questo saggio biologico.Successivamente, si lascia che i cardiomiociti aderiscano agli slip di copertura della camera e vengano colorati con URA 2:00 AM al fine di consentire l'osservazione del transitorio intracellulare di calcio durante le contrazioni; quindi, si testa l'IgG del paziente per osservarne l'effetto sulla contrattilità del cardiomiocita. I risultati indicano se l'IgG di un paziente contiene anticorpi trofici, in base alle variazioni osservate nella contrattilità e nel transitorio di calcio nei cardiomiociti isolati. Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come i saggi immunitari standard per il rilevamento di anticorpi, è che essa è indipendente da un antigene specifico e permette di discriminare tra anticorpi stimolanti e quelli bloccanti.La dimostrazione della procedura sarà effettuata da Google e riceverà assistenza tecnica dal nostro laboratorio. Per iniziare la procedura, preparare le colonne mini di immunosorbimento riempiendo tre millilitri di sferos anti-IgG per ogni due millilitri di plasma del paziente con EDTA in una colonna vuota Econopak. Successivamente, posizionare un filtro sulla sommità dei sferos anti-IgG.Tagliare l'estremità inferiore della colonna e premere il filtro per ottenere un flusso di circa una goccia al secondo. Quindi lavare la colonna tre volte con un volume di plasma di cloruro di sodio 0,9%, pipettando il plasma nella colonna quando il plasma si è completamente immerso nell'anti IgG Spheros. Lavare con lo stesso volume di cloruro di sodio 0,9%. Successivamente, pipettare un volume di plasma di glicina cloridrato 0,2 molare a pH 2,8 nella colonna e lasciarlo penetrare nel phos.Quindi aggiungere un altro volume di cloridrato di glicina alla colonna. Raccogliere il flusso in un tubo da 15 millilitri e portare il pH a 7,3 utilizzando cloridrato di tris 0,5 molarità a pH 8,0 per rigenerare la colonna. Lavare con tre volumi di plasma di cloridrato di glicina dopo un lavaggio finale con due volumi di cloruro di sodio 0,9%.La colonna può essere utilizzata per il successivo campione di plasma destinato all'uso su cardiomiociti. La frazione di IgG raccolta deve essere dializzata contro il buffer sperimentale riempiendo innanzitutto la frazione di IgG in un tubo di dialisi in membrana di estere di cellulosa con cutoff di peso molecolare a 100 chilodalton. Successivamente, inserire il tubo in un litro di EB e agitare lentamente con un agitatore magnetico a quattro gradi Celsius. Dopo otto ore, trasferire il tubo di dialisi in tre litri di EB fresco e dializzare per ulteriori 20 ore a quattro gradi Celsius dopo la dialisi.Fare bollire il campione per 30 minuti a 57 gradi Celsius in un bagno d'acqua. Per inattivare i fattori del complemento, determinare la concentrazione totale di IgG e preparare aliquote contenenti ciascuna 330 microgrammi di IgG. In questa procedura, preparare il buffer di isolamento privo di calcio secondo il manoscritto allegato.Quindi riempire il serbatoio superiore di un sistema di perfusione lanor termostatato con 80 millilitri di IB e mantenere il tampone a 37 gradi Celsius, aerandolo con 95%ossigeno, 5%anidride carbonica per 30 minuti. Sciogliere circa 7.000-10.000 unità di collaghenasi di tipo due e 174 milligrammi di BSA priva di acidi grassi in 20 millilitri. IB contenente cloruro di calcio 112,5 micromolare e regolare il pH del tampone di isolamento nel serbatoio superiore se necessario.Successivamente, anestetizzare un ratto Wistar del peso di 175-200 grammi utilizzando tiopentale a 375 microgrammi per chilogrammo, con l'aggiunta di 2.500 UI di eparina alla soluzione di tiopentale. Dopo la toracotomia, escindere con cura il cuore mantenendo integro l'arco aortico e trasferirlo in cloruro di sodio allo 0,0 percento freddo in ghiaccio, contenuto in cloruro di sodio freddo in ghiaccio. Rimuovere dal cuore il sangue e i tessuti circostanti.Quindi trasferirla in una soluzione fresca di cloruro di sodio allo 0,9% ed esporre l'aorta. Accendere il riduttore di flusso del sistema langor per ottenere una velocità di gocciolamento di due-tre gocce al secondo. Successivamente, fissare il cuore alla cannula.Perfusione per un massimo di tre minuti con un flusso di una goccia al secondo per eliminare il sangue residuo. Successivamente, far circolare l'IB nel sistema LOR. A questo punto, rimuovere 20 millilitri di tampone dal serbatoio superiore.Riempire il serbatoio con la soluzione di collaghenasi e ricaricare tanta soluzione tampone quanta è necessaria per raggiungere 80 millilitri. Quindi, far circolare la soluzione di digestione per altri 27 minuti. Successivamente, staccare il cuore dalla cannula.Rimuovere gli atri e l'aorta, quindi tritare i ventricoli in piccoli pezzi. Far scorrere il buffer di digestione nel serbatoio inferiore. Ridurre il volume a un massimo di 40 millilitri per digerire ulteriormente i ventricoli tritati per 10-15 minuti sotto aerazione continua con 95%ossigeno, 5%diossido di carbonio.Successivamente, filtrare la sospensione cellulare attraverso una garza con dimensione della maglia di 200 micron in un tubo da 50 millilitri. Infine, ripristinare il contenuto di calcio delle cellule centrifugando la sospensione cellulare a 40 3G per due minuti. A temperatura ambiente, risospendere le cellule in 10 millilitri.IB contenente cloruro di calcio 200 micromolare, centrifugare nuovamente e risospendere le cellule in 10 millilitri. IB con cloruro di calcio 500 micromolare. Dopo una centrifugazione finale, risospendere i cardiomiociti in EB sterile filtrato a una densità di 50.000 cellule per millilitro.Rivestire i vetri coprioggetto in una piastra a quattro pozzetti con 10 microgrammi di laminina per pozzetto e attendere fino a quando non sarà completamente asciutta. Quindi aggiungere un millilitro di sospensione di cardiomiociti in ciascun pozzetto. Utilizzando una micropipetta con la punta tagliata e lasciando le cellule aderire per un'ora a temperatura ambiente, diluire 10 microlitri della soluzione stock di fira 2:00 AM a un milligrammo per millilitro in cinque millilitri di eb e mantenere la soluzione di colorazione al buio.Successivamente, rimuovere il tampone e le cellule non attaccate dai vetrini, pipettando 0,5 millilitri della soluzione di colorazione. In ogni pozzetto, incubare le cellule per 10 minuti sotto agitazione moderata. Successivamente, rimuovere la soluzione di colorazione e lavare le cellule una volta con un millilitro di EB.Quindi aggiungere 0,5 millilitri di EB in ogni pozzetto in questa procedura, posizionare il vetrino sotto un microscopio a fluorescenza invertito collegato a un sistema di registrazione del calcio e della contrattilità dei miociti. Posizionare un elettrodo su misura con un tubo di influx e un tubo di influx nel primo pozzetto e nel super. Fondere i cardiomiociti con 1 millilitro al minuto di EB.Avviare la stimolazione elettrica a 20 volt, 1 hertz e una durata di cinque millisecondi per impulso, e lasciare che le cellule si adattino alla stimolazione per circa due minuti. Selezionare un cardiomiocita a forma di bacillo integro, con striature ben visibili e contrazione costante, e posizionarlo al centro del campo visivo. Quindi aprire il canale della telecamera ed orientare la cellula in posizione orizzontale all'interno dell'area video ruotando l'adattatore di fissaggio della cellula e spostando il tavolo del microscopio.Regolare il limite degli elementi di controllo di rilevamento dell'area video. Accendere il canale fluorescente e registrare da 10 a 15 contrazioni per ottenere l'accorciamento cellulare iniziale e il transitorio del calcio. Successivamente, spegnere il canale della luce del microscopio per evitare lo sbiancamento della colorazione fluorescente.Passare il flusso da EB al bypass del campione mediante una valvola a tre vie e fusare i cardiomiociti con un millilitro di IgG del paziente. Fermare la pompa poco prima che l'aria raggiunga la pozzetta, accendere il canale della luce e registrare altre 10-15 contrazioni per ottenere la risposta acuta della cellula. Quindi mettere in pausa la registrazione e spegnere nuovamente il canale della luce; ripetere le registrazioni dopo due e cinque minuti ed estrarre l'elettrodo dalla pozzetta al termine delle operazioni. Analizzare l'accorciamento cellulare e il transitorio del calcio mediante il software Ion Wizard, utilizzando rispettivamente la lunghezza del bordo/lunghezza e la finestra del rapporto numerico sottratto URA2.Successivamente, calcolare le variazioni percentuali delle risposte acute, a due minuti e a cinque minuti, rispetto all'accorciamento cellulare iniziale e all'altezza massima del transiente del calcio. Di seguito è riportato un esempio rappresentativo della misurazione di controllo. L'accorciamento cellulare e il transiente del calcio sono stati monitorati in tempo reale prima della superfusione con IgG e immediatamente a due minuti e a cinque minuti dalla superfusione con IgG.Ecco un esempio della misurazione di un campione di IgG contenente anticorpi cardio-depressivi. L'accorciamento cellulare e il transitorio del calcio sono stati misurati in tempo reale prima della superfusione con IgG e immediatamente a due e cinque minuti dalla superfusione con IgG. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una chiara comprensione su come rilevare gli anticorpi cardio-depressivi nel plasma del paziente misurandone l'effetto sull'accorciamento cellulare e sul transitorio del calcio nei cardiomiociti adulti isolati.

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Immunology and Infection

Immunologia e Infezioni

Questo metodo per isolare le cellule immunitarie funzionale dal cuore offre un'alternativa ai metodi convenzionali di digestione collagenasi, che provoca indesiderati attivazione immunitaria delle cellule, con conseguente diminuzione di risposta di queste cellule. Il nostro metodo di isolamento rese funzionali cellule cardiache immunitario evitando problemi legati alla digestione enzimatica.

Isolamento di cellule cardiache funzionali immunitario

Qui si descrive l'isolamento di cardiomyoctyes adulte di topo mediante un sistema di perfusione Langendorff. Le cellule risultanti sono Ca2 +-tolerant, elettricamente quiescente e può essere colta e trasfettate con-adeno o lentivirus per manipolare l'espressione genica. La loro funzionalità può anche essere analizzato con il sistema MMSYS e tecniche di patch clamp.

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Singoli cardiomiociti di topi wild type e mutanti possono essere isolati dal cuore per studiare la loro contrattilità e i transitori del calcio. Ciò consente di caratterizzare il contributo della disfunzione cellulare alla disfunzione cardiaca da qualsiasi causa.

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Qui, descriviamo una procedura basata su Langendorff, ottimizzata per l'isolamento di singole cellule cardiomiociti atriali da un modello del ratto di metabolico sindrome-relativo infarto con la frazione conservata di espulsione. Una regolazione manuale della pressione intraluminale delle cavità cardiache è implementata per rendere funzionalmente intatto miociti adatto per studi di accoppiamento eccitazione-contrazione.

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