Misurazione degli effetti degli anticorpi sulla funzione cellulare di cardiomiociti isolati

L'obiettivo generale del seguente esperimento è quello di rilevare gli anticorpi cardio tropici nel plasma di pazienti con cardiomiopatia dilatativa o altre malattie cardiache con un background autoimmune. Ciò si ottiene mediante un iniziale mini assorbimento immunitario del plasma del paziente su colonne spheros anti IgG per purificare l'immunoglobulina G come seconda fase. I cardiomiociti ventricolari sono isolati da ratti wistar adulti, fornendo la base cellulare per questo biotest.

Successivamente, i cardiomiociti vengono lasciati attaccare ai vetrini di copertura della camera e colorati con URA 2:00 AM per consentire l'osservazione del transitorio intracellulare del calcio durante le contrazioni, quindi le IgG del paziente vengono testate per osservare il suo effetto sulla contrattilità dei cardiomiociti. I risultati dimostrano se le IgG di un paziente contengono anticorpi tropici in base alle variazioni della contrattilità e del transitorio del calcio nei cardiomiociti isolati. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti come i test immunologici standard per la rilevazione degli anticorpi è che è indipendente da un antigene specifico e che consente di discriminare tra anticorpi stimolanti e bloccanti.

La dimostrazione della procedura consentirà a Google e all'assistenza tecnica del nostro laboratorio. Per iniziare questa procedura, preparare le mini colonne di immunoassorbimento riempiendo tre millilitri di plasma di sferosi anti IgG per due millilitri di EDTA paziente in una colonna di econopak vuota. Quindi, posiziona un filtro sopra gli spheros anti IgG.

Aprire la punta inferiore della colonna e premere il filtro per raggiungere una portata di circa una goccia al secondo. Quindi lavare la colonna tre volte con un volume di plasma di cloruro di sodio allo 0,9%, pipettare il plasma nella colonna quando il plasma si è completamente immerso nel lavaggio anti IgG Spheros con lo stesso volume di cloruro di sodio allo 0,9%. Quindi, pipettare un volume plasmatico di 0,2 molari di glicina cloridrato a pH 2,8 nella colonna e lasciarlo immergere nel fos.

Quindi aggiungere un altro volume di glicina cloridrato alla colonna. Raccogliere il flusso in una provetta da 15 millilitri e regolare il pH a 7,3 con tris cloridrato 0,5 molare a p pH 8,0 per rigenerare la colonna. Lavarlo con tre volumi plasmatici di glicina cloridrato dopo un lavaggio finale con due volumi di cloruro di sodio allo 0,9%.

La colonna può essere utilizzata per il successivo campione di plasma da utilizzare sui cardiomiociti. La frazione IgG raccolta deve essere dializzata contro il tampone sperimentale riempiendo prima la frazione IgG in una provetta a membrana per dialisi con estere di cellulosa con un cutoff di peso molecolare a 100 kilodalton. Quindi mettere la provetta in un litro di EB e mescolare lentamente con un'agitazione magnetica a quattro gradi Celsius Dopo otto ore, trasferire la provetta per dialisi in tre litri di EB fresco e dializzare per altre 20 ore a quattro gradi Celsius dopo la dialisi.

Far bollire il campione per 30 minuti a 57 gradi Celsius a bagnomaria. Per inattivare i fattori del complemento, determinare la concentrazione totale di IgG e preparare aliquote contenenti ciascuna 330 microgrammi di IgG. In questa procedura, preparare un tampone di isolamento privo di calcio secondo il manoscritto allegato.

Quindi riempire 80 millilitri di IB nel serbatoio superiore di un sistema di perfusione lanor termostatico e mantenere il tampone a 37 gradi Celsius e aerarlo con il 95% di ossigeno, il 5% di anidride carbonica per 30 minuti. Sciogliere circa 7.000-10.000 unità di collagenasi di tipo due e 174 milligrammi di BSA senza acidi grassi in 20 millilitri. IB contenente 112,5 micromolari di cloruro di calcio e, se necessario, regolare il pH del tampone di isolamento nel serbatoio superiore.

Successivamente, anestetizzare un ratto wistar da 175 a 200 grammi usando il tiopentale a 375 microgrammi per chilogrammo con 2.500 UI di eparina aggiunte alla soluzione tiopentale. Dopo la toracotomia, asportare accuratamente il cuore con un arco aortico intatto e trasferirlo in cloruro di sodio ghiacciato, zero virgola percento in cloruro di sodio ghiacciato. Rimuovere il sangue e il tessuto circostante dal cuore.

Quindi trasferirlo in cloruro di sodio fresco allo 0,9% ed esporre l'aorta. Accendere il riduttore di flusso del sistema langor per ottenere una velocità di caduta da due a tre al secondo. Quindi attacca il cuore alla cannula.

Perfonderlo per un massimo di tre minuti con una velocità di flusso di una goccia al secondo per lavare via il sangue rimanente. Successivamente, fai circolare l'IB nel sistema LOR. Ora rimuovi 20 millilitri di tampone dal serbatoio superiore.

Riempire il serbatoio con la soluzione di collagenasi e riempire il tampone necessario per raggiungere gli 80 millilitri. Quindi far circolare la soluzione digestiva per altri 27 minuti. Quindi, staccare il cuore dalla cannula.

Eliminate gli atri e l'aorta, quindi tagliate i ventricoli a pezzetti. Lasciare che il tampone di digestione scorra nel serbatoio inferiore. Ridurre il volume a un massimo di 40 millilitri per digerire ulteriormente i ventricoli tritati per 10-15 minuti sotto l'aerazione continua con il 95% di ossigeno e il 5% di anidride carbonica.

Successivamente, filtrare la sospensione cellulare attraverso una garza da 200 micron in un tubo da 50 millilitri. Infine, ripristinare il contenuto di calcio delle cellule centrifugando la sospensione cellulare a 40 3G per due minuti. A temperatura ambiente, risospendere le celle in 10 millilitri.

IB contenente 200 micromolari di cloruro di calcio centrifugare nuovamente e risospendere le cellule in 10 millilitri. IB con 500 micromolari di cloruro di calcio. Dopo un'ultima centrifugazione, sospendere nuovamente i cardiomiociti in EB filtrato sterile ad una densità di 50.000 cellule per millilitro.

Rivestire i bicchieri di copertura in una camera a quattro pozzetti con 10 microgrammi di laminina per pozzetto e attendere che sia completamente asciutto. Quindi riempire un millilitro della sospensione di cardiomiociti in ciascun pozzetto. Utilizzando una micropipetta con punta tagliata e lasciando aderire le cellule per un'ora a temperatura ambiente, diluire 10 microlitri della soluzione madre da un milligrammo per millilitro fira 2:00 AM in cinque millilitri, eb, e mantenere la soluzione colorante al buio.

Quindi, rimuovere il tampone e le cellule non attaccate dal coperchio pipettare 0,5 millilitri di soluzione colorante. In ciascuno, incubare bene le cellule per 10 minuti con agitazione moderata. Successivamente, rimuovere la soluzione colorante e lavare le celle una volta con un millilitro eb.

Quindi aggiungere 0,5 millilitri di EB a ciascun pozzetto in questa procedura, posizionare il vetro di copertura sotto un microscopio a fluorescenza inversa collegato a un sistema di registrazione del calcio e della contrattilità dei miociti. Posizionare un elettrodo su misura con un tubo di afflusso e afflusso nel primo pozzetto e nel super. Fondere i cardiomiociti con un millilitro al minuto eb.

Iniziare la stimolazione elettrica a 20 volt, un hertz e cinque millisecondi di durata per impulso, e lasciare che le cellule si adattino alla stimolazione per circa due minuti. Scegli un cardiomiocita integro a forma di bastoncello con striature nette e contrazione costante e posizionalo al centro del campo visivo. Quindi aprire il canale della telecamera e orientare la cella orizzontalmente all'interno dell'area video ruotando l'adattatore per l'inquadratura della cella e spostando il tavolino del microscopio.

Regolare il confine degli elementi di controllo di rilevamento dell'area video. Attiva il canale fluorescente e registra da 10 a 15 contrazioni per ottenere l'accorciamento cellulare iniziale e il transitorio del calcio. Successivamente, spegnere il canale della luce del microscopio per evitare lo sbiancamento della macchia fluorescente.

Commutare il flusso dall'EB al bypass del campione con una valvola a tre vie e fondere i cardiomiociti con un millilitro di IgG del paziente. Arrestare la pompa appena prima che l'aria raggiunga il canale, accendere il canale della luce e registrare per altre 10-15 contrazioni per ottenere la risposta cellulare acuta. Quindi mettere in pausa la registrazione e spegnere nuovamente il canale della luce, ripetere le registrazioni dopo due e cinque minuti e ritirare l'elettrodo dal pozzetto quando hanno finito alla fine, analizzare l'accorciamento cellulare e il transitorio di calcio con il software della procedura guidata ionica utilizzando rispettivamente la lunghezza del bordo e la finestra del rapporto di sbarra sottratta numerica URA.

Successivamente, calcolare le variazioni percentuali per le risposte acute, di due minuti e di cinque minuti dall'accorciamento cellulare iniziale e dall'altezza del picco transitorio del calcio. Ecco un esempio rappresentativo della misurazione del controllo. L'accorciamento cellulare e il transitorio del calcio sono stati monitorati online prima della superfusione con IgG e immediatamente due minuti e cinque minuti dopo la superfusione con IgG.

Ed ecco un esempio della misurazione di un campione di IgG contenente anticorpi cardiodepressivi. L'accorciamento cellulare e il transitorio del calcio sono stati misurati online prima della superfusione con IgG e immediatamente due minuti e cinque minuti dopo la superfusione con IgG. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come rilevare gli anticorpi del traffico cardiaco nel plasma del paziente misurando l'effetto delle IgG isolate sull'accorciamento cellulare nel transitorio di calcio dei cardiomiociti rossi adulti isolati.