Name: Isolamento rapido di cellule tumorali circolanti da campioni di sangue del paziente (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-06-15T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 32 s
Description: Scopri l'isolamento di cellule tumorali circolanti vitali da campioni di sangue utilizzando un dispositivo di microtubo funzionalizzato con E-selectin. Questa tecnica biomimetica permette di catturare CTC senza danneggiarle per terapie personalizzate.

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Il lavoro descritto è stato sostenuto dal Centro Cornell sul microambiente e metastasi attraverso il numero di U54CA143876 Award dal National Cancer Institute. Il contenuto è di esclusiva responsabilità degli autori e non necessariamente rappresentano le opinioni ufficiali del National Cancer Institute e il National Institutes of Health. Questo lavoro è stato inoltre finanziato in parte da una National Science Foundation Graduate Research Fellowship (ADH).

Il protocollo seguito è per la produzione di un dispositivo microtubo singolo. 1. Preparazione della soluzione Nanotubi Halloysite <ol><li> Sottoporre ad ultrasuoni (10-13 W (rms)) 250 microlitri soluzione di nanotubi halloysite (6,6% in peso in acqua) 30 sec. Soluzione di raffreddare con acqua fredda e sonicazione ripetere una sola volta. Raffreddare di nuovo. </li><li> Disegna la soluzione sonicato in una siringa, collegare un filtro per siringa 0,45 micron, e la soluzione di filtro in provetta per microcentrifuga pulita. Vortex la soluzione di tanto in tanto per mantenere l&#39;omogeneità. </li></ol> 2. Rivestimento di superficie Conetti interno con nanotubi halloysite <ol><li> Ottenere 50 cm lungo tratto di Micro-Renathane microtubing (300 micron di diametro interno, 35,3 microlitri di volume interno). Tagliare un&#39;estremità della provetta in diagonale e inserire in un piccolo pezzo adattatore IDEX. Inserire l&#39;ago di una siringa 3/10 cc 29G nell&#39;altra estremità della provetta. </li><li> Per pulire la provetta, posizionare l&#39;estremità aperta della provetta (finecon l&#39;adattatore) in etanolo al 70% e il pareggio ~ 50 microlitri di etanolo nella siringa per riempire provetta. </li><li> Sciacquare la produzione di etanolo da provetta disegnando un volume generoso di acqua distillata nella siringa. </li><li> Staccare la siringa dal microprovetta, svuotare la siringa, e quindi ricollegare alla provetta. </li><li> Preparare una soluzione di 0,02% w / v poli L-lisina in acqua. Disegnare 50 pl nella provetta e lasciare riposare per 5 min a temperatura ambiente (RT). </li><li> Disegnare 100 ul di soluzione nanotubo filtrata nella provetta e consentire ad incubare per 3 minuti a RT. </li><li> Disegnare 100 microlitri di acqua attraverso la provetta per sciacquare la soluzione nanotubo. Lasciare microprovetta rivestito di sedersi, riempita con acqua, durante la notte a temperatura ambiente. </li></ol> 3. Preparazione di Microtubes per l&#39;isolamento cellulare <ol><li> Preparare una soluzione di 10 ug / mL proteina G in fosfato di Dulbecco 1X salina tamponata (PBS, pH 7,0 - 7,2). Disegnare 50 microlitri di PBS attraverso provetta e quindi disegnare 50 pl dila proteina-G soluzione e consentono di incubare per 1,5 ore a temperatura ambiente. </li><li> Preparare una soluzione contenente 5 pg / mL E-selectina-IgG e 50 ug / ml di anticorpo (anti-EpCAM per la maggior parte dei campioni di cancro, anti-PSMA per campioni di cancro della prostata) in PBS. Estrarre 50 pl della E-selectina e la soluzione di anticorpi nella provetta e permettono di incubare per 2 ore a temperatura ambiente. </li><li> Non specifica adesione cellulare è bloccato con le proteine ​​del latte del 5%. Preparare una soluzione di 5% (w / v), proteine ​​del latte in PBS. Estrarre 50 pl soluzione di proteina del latte nella provetta e consentire ad incubare per 1 ora a RT. </li><li> Disegnare 50 microlitri di PBS nella provetta e lasciare a temperatura ambiente fino a quando i campioni di sangue o cappotto buffy sono pronti per l&#39;elaborazione. </li><li> 10 min prima di utilizzare il microprovetta per l&#39;isolamento, disegnare 50 pl PBS che è stato saturato con Ca 2 + (&quot;PBS +&quot;) per attivare le molecole selectina. </li></ol> 4. Preparazione dei campioni per l&#39;isolamento delle cellule <ol><li> Disegnare o ottenere 10 mL di sangue dal paziente in eparinizzatotubo. </li><li> Place 10 mL Ficoll-Paque soluzione di isolamento dei linfociti in tubo da 50 ml centrifuga. Delicatamente sangue intero strato 10 mL sopra Ficoll per non mescolare il sangue e Ficoll. </li><li> Centrifugare a 2000x g per 15 min a 4 ° C con decelerazione minima. </li><li> Rimuovere lo strato di rivestimento buffy e il luogo in nuova provetta. </li><li> Lavare il buffy coat con PBS (centrifugare a 230x g per 10 min, scartare il surnatante). </li><li> Risospendere delicatamente le cellule con 1 ml di tampone di lisi RBC e incubare per 10 min a RT per la lisi degli eritrociti. </li><li> Aggiungere 10 ml di PBS, mescolare delicatamente e centrifugare a 230x g per 10 min. Eliminare il supernatante e risospendere delicatamente il pellet in 3 a 4 mL PBS +. </li></ol> 5. Cella di isolamento <ol><li> Collegare una estremità della provetta funzionalizzato ad una siringa da 5 ml con adattatori IDEX. </li><li> Inserire la siringa su una pompa a siringa. </li><li> Immergere l&#39;estremità aperta della provetta funzionalizzato nella cella suspension. </li><li> Elabora la sospensione cellulare attraverso la provetta a 1 a 4 mL / h. </li><li> Trasferire l&#39;estremità aperta della provetta in una provetta contenente PBS + 300 + e disegnare ul PBS nella siringa a 0,016 mL / min per rimuovere le cellule non legato e vagamente legate dalla provetta. </li><li> Posizionare l&#39;estremità aperta della provetta in una provetta pulita. Staccare la siringa dal microprovetta e allegare una siringa preriempita con Accutase. Delicatamente perfusione Accutase abbastanza in provetta da riempire (~ 50 mL) e lasciar incubare a temperatura ambiente per 10 min. </li><li> Attaccare una siringa preriempita con 1 mL di mezzo di crescita (79% RPMI, FBS 20%, streptomicina 1% di penicillina) e profumato in provetta, raccogliendo effluente in coltura di tessuto trattati bene piastra. </li><li> Cellule di coltura a 37 ° C e 5% CO 2 in condizioni umidificati. </li></ol> 6. Risultati rappresentativi L&#39;obiettivo di questa tecnica è quella di isolare cellule tumorali vitali dal sangue di pazienti affetti da cancro. Esistono diversi metodi per identificare le cellule tumorali in coltura, una verifica necessaria di successo dispositivo. Abbiamo scelto per colorare le cellule in coltura con anticorpi contro porzioni epiteliali come EpCAM (molecola di adesione cellulare epiteliale) o PSMA (antigene di membrana specifico della prostata), oltre a DAPI per identificare nuclei intatti cellule (Fig. 2 e 3). Il numero di cellule tumorali catturato utilizzando questa tecnica è necessariamente una funzione del numero di CTC nel campione iniziale, e la variabilità del paziente può essere elevato. Nel trattamento di campioni prelevati da pazienti con diagnosi di tumori stadio IV, che abitualmente catturano tra 100 e 500 cellule tumorali per provetta di sangue, a purezze&gt; 50%. Immediatamente dopo isolamento, un maggior numero di leucociti contaminanti possono essere presenti. Tuttavia, questi numeri saranno esaurite incubazione seguente terreno di coltura per un massimo di 5 giorni. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/4248/4248fig1.jpg" /> <strong&gt; Figura 1. Schema della provetta funzionalizzata per l&#39;isolamento CTC, mostrando selectina-mediata rotolamento seguito da anticorpo-mediata adesione statica. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/4248/4248fig2.jpg" /> Figura 2. Dati rappresentativi di isolamento CTC da campioni di sangue prelevato da un paziente cancro al seno e un malato di cancro ai polmoni. Il numero di cellule vitali identificabili come CTC base colorazione EpCAM è rappresentato dalle barre solide e riguardano l&#39;ordinata di sinistra e la percentuale di cellule che sono stati identificati come CTC rispetto al numero totale di cellule catturate è rappresentato dalle barre aperte e misurato sulla ordinata di destra. I risultati vengono dopo cinque giorni di coltura. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/4248/4248fig3.jpg" /> Micrografie rappresentativi Figura 3. Da donatori diversi (A e B) della CTC nella cultura 5 giorni successivi alla intercettaza partire da un campione di sangue del paziente cancro. Le cellule sono state colorate per fluorescenza con EpCAM AlexaFluor 488 (verde) e 4 &#39;,6-Diamidino-2-fenilindolo (DAPI) per visualizzare il nucleo (blu).

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MRK è un consulente scientifico di CellTraffix, Inc. (Rochester, NY).

E &#39;spesso il caso che i primi passi nella scoperta di nuove terapie contro il cancro utilizzano linee di cellule tumorali, che somigliano discutibile per le cellule tumorali primarie pur rimanendo in uso a causa della loro facilità d&#39;uso in laboratorio. La ricerca lo sviluppo di nuove terapie oncologiche sarebbe accelerato se primarie cellule tumorali umane sono state utilizzate prima nella ricerca romanzo. CTC sono il tipo più facilmente accessibile di cellule del cancro, a causa della loro presenza nel sangue e la facilità di un prelievo di sangue standard. Inoltre, cellule tumorali circolanti rappresentano un passo necessario nel processo di metastasi 5,6, quindi la loro rilevanza per la malattia e l&#39;utilità per il targeting di nuovi farmaci è chiaro. Isolamento di CTC dal sangue in vitro è complicata dal loro basse concentrazioni: dell&#39;ordine di uno per milione leucociti o uno per miliardo eritrociti 7. La maggior parte degli attuali metodi per la rilevazione CTC nel sangue, compreso l&#39;unico approvato dalla FDA Cella tecnica<html> Cerca (Veridex), danneggiare o distruggere le cellule nel processo di rilevamento, escludere l&#39;utilizzo di là di enumerazione. Il metodo sopra descritto non compromette la vitalità cellulare e apre quindi la porta per la futura ricerca clinica sul cancro. Poiché il recupero di cellule intatte è l&#39;obiettivo di questa tecnica, è imperativo che le cellule essere maneggiato con cura, in particolare durante le fasi di separazione sangue. Ci sono un certo numero di parametri regolabili in questo sistema che possa essere modificato per ottenere una resa migliore a seconda delle caratteristiche critiche come tipo di cancro. Nelle fasi sopra descritte, abbiamo scelto di utilizzare EpCAM come CTC anticorpo specifico per tutti i tipi di cancro, tranne quando il trattamento di campioni di cancro della prostata, in cui anti-PSMA è stato usato. Altre sostituzioni di tumore-specifici anticorpi possono certamente essere utilizzato per migliorare le prestazioni per i singoli pazienti. Inoltre, le concentrazioni selectina e anticorpo può essere modificata per migliorare la cattura 8. &quot;&gt; Una caratteristica essenziale del dispositivo è l&#39;incorporazione di E-selectina molecole sulla superficie. E-selectina è normalmente espressa sulla superficie luminale delle cellule endoteliali e la funzione di assumere rapido movimento leucociti ai siti di infiammazione. Leucociti Flowing legano a transitoriamente molecole selectina, causando un più lento, comportamento a rotazione che facilita legame più lento e più forte della cella all&#39;endotelio da integrine. convincente evidenza sperimentale esiste che rende il caso che CTC può travasare da un meccanismo simile 9,10. L&#39;inclusione di selectina anche consente al dispositivo di funzionare a portate maggiori, aliquote che impedirebbero cellule di legarsi ad anticorpi 11. Così il dispositivo imita fisiologicamente uno venule per catturare biomimeticamente fluisce CTC senza causare danno cellulare. Prestazioni del dispositivo migliorato può essere attribuito al aggiunta del rivestimento nanotubo halloysite alla superficie luminaledel dispositivo. Studi precedenti hanno dimostrato che ci sono tre componenti principali del rivestimento nanotubi che permette una migliore funzionalità. In primo luogo, il rivestimento nanotubo fornisce una superficie maggiore, consentendo una maggiore deposizione di proteine ​​sulla superficie 4. In secondo luogo, nell&#39;esecuzione di microscopia a forza atomica sul rivestimento nanotubo abbiamo determinato che i singoli nanotubi sporgono dalla superficie nel flusso. Questo permette molecole selectina essere presentate come una delle molte micron dalla superficie in modo che le cellule possono essere catturato e assunti alla superficie anteriore nella loro traiettoria attraverso il tubo 4. Infine, il rivestimento nanotubo halloysite è in grado di prevenire l&#39;adesione dei leucociti e la diffusione sulla superficie, consentendo un ridotto numero di leucociti catturati insieme al CTC e quindi una maggiore purezza successive CTC 3.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome di reagente </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td></tr><tr><td> 300 tubi ID um </td><td> Braintree Scientific </td><td> MRE025 </td></tr><tr><td> Ingrandita della tubazione per il collegamento a siringa </td><td> IDEX Health &amp; Science </td><td> 1507L </td></tr><tr><td> 5 ml per pompa siringa </td><td> BD </td><td> 309603 </td></tr><tr><td> Piccolo connettore per tubi di grandi dimensioni </td><td> IDEX Health &amp; Science </td><td> P-770 </td></tr><tr><td> Connettore del tubo grande per siringa </td><td> IDEX Health &amp; Science </td><td> F-120 e P-659 </td></tr><tr><td> Siringa per microprovetta (siringa da insulina 3/10cc U-100 29G 1/2 &#39;) </td><td> BD </td><td> 309301 </td></tr><tr><td> Accutase </td><td> MP Biomedicals LLC </td><td> 1000449 </td></tr><tr><td> Ficol-Paque plus </td><td> GE Healthcare Bio-Sciences AB </td><td> 17-1440-03 </td></tr><tr><td> RBC Lysis Buffer (Buffer EL, 1000 ml) </td><td> Qiagen </td><td> 1014614 </td></tr><tr><td> Proteina G, 5 mg </td><td> Calbiochem (calbiochem.com) </td><td> 539303 </td></tr><tr><td> Anticorpo umano EpCAM/TROP-1 </td><td> R &amp; D Systems </td><td> MAB960 </td></tr><tr><td> PSMA anticorpi (GCP-04) </td><td> abcam </td><td> ab66911 </td></tr><tr><td> Piastre a 96 pozzetti (Microtest 96) </td><td> BD Falcon </td><td> 35-3072 </td></tr><tr><td> Blotting Grade Blocker non grasse del latte a secco, 300g </td><td> Bio-Rad Laboratories </td><td> 216005508 </td></tr><tr><td> Nanotubi halloysite </td><td> NaturalNano </td><td> NN-HNT200 </td></tr><tr><td> Carbonato di calcio, 5g </td><td> Aldrich Chimica </td><td> 481807 </td></tr><tr><td> rhE-Selectin/Fc Chimera, 100 ug </td><td> R &amp; D Systems </td><td> 724-ES </td></tr><tr><td> RPMI Media 1640 </td><td> Gibco </td><td> 22400-089 </td></tr><tr><td> DPBS </td><td> Gibco </td><td> 14190-095 </td></tr><tr><td> Poly-L lisina 0,1% w / v in acqua </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P8920-100ML </td></tr><tr><td> Di Sonic Dismembrator </td><td> Fisher Scientific </td><td> Modello 100 </td></tr><tr><td> Siero fetale bovino </td><td> Atlanta Biochemicals </td><td> S11056H </td></tr><tr><td> Penicillina Streptomicina </td><td> Sigma vita Siiences </td><td> P0781 </td></tr></tbody></table>

isolamento rapido di cellule tumorali circolanti da campioni di sangue del paziente

Rapid Isolation of Viable Circulating Tumor Cells from Patient Blood Samples

Cellule tumorali circolanti (CTC) sono cellule che diffondono da un tumore primario in tutto il sistema circolatorio e che può in ultima analisi, formare tumori secondari in siti distanti. CTC conteggio può essere utilizzata per seguire la progressione della malattia in base alla correlazione tra la concentrazione CTC nel sangue e gravità della malattia 1. Come strumento di trattamento, CTC potrebbe essere studiata in laboratorio per sviluppare terapie personalizzate. A tal fine, isolamento CTC deve provocare alcun danno cellulare, e la contaminazione da altri tipi cellulari, in particolare leucociti, deve essere evitato il più possibile 2. Molte delle tecniche attuali, tra cui l&#39;unico dispositivo approvato dalla FDA per il conteggio CTC, distruggere CTC come parte del processo di isolamento (per maggiori informazioni vedi rif. 2). Un dispositivo microfluidico per catturare vitale CTC è descritto, costituito da una superficie funzionalizzata con E-selectina glicoproteina in aggiunta anticorpi contro marcatori epiteliali 3. Per migliorare prestazioni del dispositivomance un rivestimento di nanoparticelle è stato applicato costituito da nanotubi halloysite, un nanoparticelle alluminosilicato raccolto da argilla 4. Le E-selectina molecole forniscono un mezzo per catturare rapido movimento CTC che sono pompati attraverso il dispositivo, conferendo un vantaggio rispetto alle alternative dispositivi microfluidici cui tempi di trattamento più lunghi sono necessari per fornire cellule bersaglio con il tempo sufficiente per interagire con una superficie. Gli anticorpi a bersagli epiteliali fornire CTC-specificità al dispositivo, nonché fornire un parametro facilmente regolabile per sintonizzare isolamento. Infine, il rivestimento nanotubo halloysite permette di isolare significativamente maggiore rispetto ad altre tecniche, contribuendo a catturare le cellule si muovono veloci, fornendo maggiore area di superficie per l&#39;assorbimento delle proteine, e respingere leucociti contaminanti 3,4. Questo dispositivo è prodotto mediante una tecnica semplice utilizzando off the shelf materiali, ed è stata usata per catturare le cellule tumorali dal sangue di metastaticoPazienti con tumore. Cellule catturate vengono mantenute per un massimo di 15 giorni in coltura, previo isolamento, e questi campioni consistono tipicamente di&gt; 50% delle cellule tumorali vitali primarie di ogni paziente. Questo dispositivo è stato usato per catturare vitali CTC sia da sangue intero diluito e campioni di buffy coat. In definitiva, vi presentiamo una tecnica con la funzionalità in ambito clinico per sviluppare terapie oncologiche personalizzate.

Cellule tumorali circolanti sono isolate dal sangue di pazienti affetti da cancro senza infliggere danni cellulari. Isolamento di cellule tumorali viene eseguita utilizzando una superficie bimolecolare di E-selectina in aggiunta agli anticorpi contro marcatori epiteliali. Un rivestimento nanotubo favorisce espressamente adesione cellulare del cancro con conseguente purezze cattura elevate.

Isolamento rapido di cellule tumorali circolanti da campioni di sangue del paziente

Le cellule tumorali circolanti (CTC) sono cellule che si diffondono da un tumore primario attraverso il sistema circolatorio e che possono infine formare metastasi secondarie...

L'obiettivo generale di questa procedura è isolare cellule tumorali circolanti vitali da campioni di sangue. Iniziare con la preparazione delle micro provette di isolamento, quindi isolare il buffy coat dai campioni di sangue. Successivamente, processare il buffy coat attraverso il dispositivo di micro provetta funzionalizzata.Raccogliere le cellule catturate dal microtubo e mantenere la coltura utilizzando un dispositivo che riproduce fisiologicamente un ambiente per catturare biomimeticamente le CTC in flusso senza provocare danni cellulari. Questa tecnica offre funzionalità in un contesto clinico per sviluppare terapie oncologiche personalizzate. I principali vantaggi sono che si tratta di una tecnica semplice che utilizza materiali comunemente disponibili e che ricrea il processo naturale dei tessuti solidi che avviene nei vasi sanguigni.Sono Mike King, professore associato di ingegneria biomedica presso la Cornell University; la procedura verrà dimostrata da Jeff Madison, un tecnico senior del mio laboratorio. Il seguente protocollo riguarda la produzione di un singolo dispositivo microtubolare: sottoporre a sonica 250 microlitri di soluzione al 6,6% di nanotubi Halo site per 30 secondi, raffreddando la soluzione con acqua fredda.Dopo una seconda sonificazione, aspirare la soluzione in una siringa. Filtrare la soluzione attraverso un filtro da siringa da 0,45 micron in un tubo microcentrifuga pulito e vorticosare. La soluzione di nanotubi halo site periodicamente.Per mantenere l'omogeneità, procurarsi un tratto di 50 centimetri di microtubino in micro rehan. Tagliare l'ingresso del microtubino in modo diagonale e inserire un'estremità del microtubino in un piccolo adattatore IDEXX, inserendo un ago da siringa nell'altra estremità del microtubino. Per pulire il microtubino, immergere l'estremità libera del microtubino in etanolo al 70% ed aspirare circa 50 microlitri di etanolo nella siringa, riempiendo così il microtubino per risciacquarlo ed eliminare l'etanolo dal microtubino.Aspirare un volume generoso di acqua distillata nella siringa. Staccare ora la siringa dal microtubo, svuotare la siringa e quindi riattaccarla al microtubo. Aspirare 50 microlitri di 0,02 peso per volume.Aggiungere poliolo lisina nel microtubo e incubare per cinque minuti a temperatura ambiente. Successivamente, aspirare 100 microlitri di soluzione di nanotubi filtrata nel microtubo e incubare per tre minuti a temperatura ambiente. Per rimuovere la soluzione di nanotubi, aspirare 100 microlitri di acqua attraverso il microtubo e incubare tutta la notte a temperatura ambiente; quindi aspirare 50 microlitri di PBS attraverso il microtubo, seguiti da 50 microlitri di 10 microgrammi per millilitro.Equilibrare la soluzione di proteina G per 90 minuti a temperatura ambiente. Successivamente, aspirare 50 microlitri di soluzione di IgG di E-selectina a cinque microgrammi per millilitro e 50 microgrammi per millilitro di soluzione anticorpale nel microtubo. Incubare per due ore a temperatura ambiente, bloccando l'adesione cellulare non specifica con proteina del latte al 5%.Quindi incubare il PBS a temperatura ambiente fino a quando i campioni di sangue o di strato buffo sono pronti per l'elaborazione, 10 minuti prima di utilizzare il microtubo per l'isolamento cellulare. Aspirare 50 microlitri di PBS saturato di calcio per attivare le molecole di selectina in un tubo eparinizzato. Prelevare un campione di sangue di 10 millilitri da un paziente per l'isolamento dei linfociti.Aggiungere 10 millilitri di soluzione Fol Pack in un tubo da centrifuga da 50 millilitri. Sovrapporre delicatamente il campione di 10 millilitri di sangue intero e centrifugare a 2000 ×g per 15 minuti a 4 °C con decelerazione minima. Successivamente, trasferire lo strato del buffy coat in un nuovo tubo.Lavare il buffy coat con PBS e centrifugare per lisare gli eritrociti. Ri-sospendere delicatamente i pellet cellulari in un millilitro di buffer per la lisi dei globuli rossi e incubare per 10 minuti a temperatura ambiente. Quindi aggiungere 10 millilitri.Mescolare delicatamente i globuli rossi e le cellule del palato in PBS mediante centrifugazione. Risospendere delicatamente le cellule in PBS aggiuntivo utilizzando adattatori IDEXX. Collegare un'estremità del microtubo funzionalizzato a una siringa da cinque millilitri.Inserire la siringa su una pompa per siringhe e immergere l'estremità libera del microtubo funzionalizzato nella prevenzione delle cellule. Far passare la sospensione cellulare attraverso il microtubo per rimuovere le cellule non legate e quelle legate in modo debole. Trasferire l'estremità libera del microtubo in un tubo contenente PBS più.Aspirare 300 microlitri di PBS nel siringa. Successivamente, posizionare l'estremità aperta del microtubo in un tubo pulito. Scollegare la siringa dal microtubo e attaccare una siringa contenente acuate, quindi effettuare una perfusione delicata con acuate per riempire il microtubo.Dopo un'incubazione di 10 minuti a temperatura ambiente, fissare una siringa contenente un millilitro di terreno di crescita, perfondere il microtubo e raccogliere l'effluente in piastre di coltura appropriate. Procedere quindi alla coltivazione. Le cellule tumorali circolanti isolate sono state ottenute da campioni di sangue di un paziente affetto da cancro al seno e di un paziente affetto da cancro al polmone dopo cinque giorni.In coltura. Questi preparati sono stati caratterizzati per l'isolamento delle CTC in base alla colorazione per la molecola cellulare epiteliale epican, e la purezza dell'isolamento del nucleo è stata calcolata come percentuale di cellule identificate come CTC rispetto al numero totale di cellule isolate. Questa immagine mostra microfotografie rappresentative di CTC isolate dai donatori A e B. Dopo cinque giorni di coltura, le cellule sono state colorate in modo fluorescente per EPAM con Alexa Fluor 488.I nuclei sono stati visualizzati mediante colorazione con DPI. Dopo questa procedura, le CTC vitali e la coltura possono essere utilizzate per ottenere informazioni specifiche per il paziente, come la suscettibilità ai farmaci o l'espressione dei marcatori cellulari. Grazie per aver guardato e buona fortuna.

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Questo video descrive un protocollo dettagliato per isolare le cellule tumorali circolanti dal campione di sangue intero di un modello murino di tumore colorettale soppresso. Queste CTC isolate possono essere coltivate e utilizzate per l'analisi a valle prevista.

Isolamento CTC da un campione di sangue intero: un metodo per ottenere CTC da un modello di cancro colorettale murino

È stato dimostrato che le cellule tumorali circolanti (CTC) svolgono un ruolo importante nelle metastasi tumorali. Qui, viene descritto un metodo per l'isolamento e la propagazione di CTC dal sangue intero di un modello di tumore murino singenico di metastasi da carcinoma epatocellulare (HCC).

Isolamento e propagazione di cellule tumorali circolanti da un mouse cancro modello

Un protocollo di utilizzare un poli (N--ISO propylacrylamide) (PIPAAm) microfiltro rivestito per la cattura e il rilascio efficace thermoresponsive delle cellule tumorali circolanti vitali (CTC) è presentato. Questo metodo permette la cattura di CTC dal sangue dei pazienti e il successivo rilascio di valida CTC per la cultura a valle off-chip, analisi e caratterizzazione.

Cattura e rilascio di vitali circolanti cellule tumorali del sangue

Descriviamo la creazione di tumori colorettali ortotopici attraverso l'iniezione di cellule tumorali o organoidi nel cecum dei topi e il successivo isolamento di cellule tumorali circolanti (CTC) da questo modello.

Isolamento delle cellule tumorali circolanti in un modello di topo ortotopico del tumore del colon-retto

Questo protocollo è quello di recuperare e preparare cellule bersaglio rara da una miscela con cellule non-bersaglio della priorità bassa per la caratterizzazione genetica molecolare a livello di singola cellula. Qualità del DNA è uguale a cellule singole non trattata e permette per cella singola applicazione (entrambi screening basato e analisi mirate).

Amplificazione dell'obiettivo delle cellule pre-arricchimento e intero genoma per singola cella a valle caratterizzazione

Qui, presentiamo un flusso di lavoro integrato per identificare le caratteristiche fenotipiche e molecolari che caratterizzano le cellule tumorali circolanti (CTC). Combiniamo l'immunocolorazione dal vivo e la micromanipolazione robotica di CTC singoli e cluster con tecniche a singola cellula per l'analisi a valle e la valutazione dell'abilità di metastasi-semina.

Micromanipolazione delle cellule tumorali circolanti per l'analisi molecolare a valle e la valutazione del potenziale metastatico

La caratterizzazione delle cellule tumorali circolanti (CTC) è un argomento popolare nella ricerca traslazionale. Questo protocollo descrive un test di immunofluorescenza semi-automatica (IF) per la caratterizzazione PD-L1 e l'enumerazione dei CTC in campioni di pazienti affetti da cancro del polmone non a piccole cellule (NSCLC).

Caratterizzazione semiautomatica PD-L1 ed enumerazione delle cellule tumorali circolanti da pazienti affetti da cancro del polmone a cellule non piccole mediante immunofluorescenza

La coltura di CTC consente una caratterizzazione funzionale più profonda del cancro, attraverso l'analisi dell'espressione di marcatori specifici e la valutazione della resistenza ai farmaci e della capacità di colonizzare il fegato tra le altre possibilità. Nel complesso, la cultura CTC potrebbe essere uno strumento clinico promettente per la medicina personalizzata per migliorare l'esito del paziente.

Linee cellulari tumorali circolanti: uno strumento innovativo per la ricerca fondamentale e traslazionale

Il chip microfluidico clinico è un'importante tecnica di analisi biomedica che semplifica la pre-elaborazione del campione di sangue del paziente clinico e colora immunofluorescentmente le cellule tumorali circolanti (CTC) in situ sul chip, consentendo la rapida rilevazione e identificazione di un singolo CTC.

Piattaforma di chip microfluidici clinici per l'isolamento di cellule tumorali circolanti versatili

Le cellule tumorali circolanti (CTC) sono fondamentali per lo studio della progressione e delle metastasi del cancro. Questo articolo presenta un protocollo integrato ad alta produttività per l'arricchimento di CTC e il sequenziamento di CTC singolo, migliorando l'efficienza di cattura e la purezza delle CTC riducendo al contempo i costi di contaminazione e sequenziamento, facendo progredire la ricerca oncologica di precisione e le applicazioni cliniche.

Tecnologia di selezione delle cellule tumorali circolanti ad alto rendimento e sequenziamento di singole cellule basata sulla microfluidica

Scopri l'isolamento di cellule tumorali circolanti vitali da campioni di sangue utilizzando un dispositivo di microtubo funzionalizzato con E-selectin. Questa tecnica biomimetica permette di catturare CTC senza danneggiarle per terapie personalizzate.

Isolamento rapido di cellule tumorali circolanti da campioni di sangue del paziente

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