Name: Granulociti-dipendente indotta da autoanticorpi pelle vescicole (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-10-12T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 23 s
Description: Scopri il metodo di induzione di vescicole cutanee nei topi mediante trasferimento passivo di anticorpi specifici per il collagene VII. Questo modello animale riproduce le caratteristiche dell'epidermolisi bollosa acquisita umana.

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Gli autori riconoscono il supporto da finanziamenti della Deutsche Forschungsgemeinschaft SI-1281/4-1 e BIOS della Facoltà di Medicina dell&#39;Università di Friburgo (a CS).

1. Preparazione di anticorpi patogeni Nota: Purificazione e concentrazione degli anticorpi deve essere eseguito lo stesso giorno, come anticorpi non devono essere immagazzinati in 0,1 M glicina pH 2,5-3 (tampone di eluizione) per tutta la notte (ON). Purificazione di affinità di IgG: utilizzare 25 ml di siero di coniglio immune: <ol><li> Scongelare il siero di coniglio ON a 4 ° C, mescolare 1:1 con 1xPBS (tampone di corsa) e centrifugare a 1260 xg per 10 min a 20 ° C. Facoltativamente, una fase di filtrazione con filtro di carta può essere incluso dopo centrifugazione nel caso il siero è grasso. </li><li> Nel frattempo, lavare la proteina G matrice colonna riempita con 10 volumi del letto (volume del letto = volume matrice) di 1XPBS (tampone di corsa). </li><li> Applicare il siero diluito e filtrato alla colonna e incubare per 1 ora sulla piattaforma oscillante a temperatura ambiente (RT). </li><li> Raccogliere il flow-through (FT) in un tubo da 50 ml Flacon. Non gettarlo fino alla concentrazionee titolo del IgG purificata è noto. </li><li> Lavare la matrice con 5 volumi di letto 1XPBS e nel frattempo preparare 50 ml provette Falcon per la raccolta della frazione eluita IgG. Pipettare 1 ml di tampone di neutralizzazione pH: 1 M TRIS pH 10 in ciascun tubo (altrimenti la proporzione di 1:20 tampone TRIS rispetto alla quantità di eluato da raccogliere). </li><li> Applicare 100-150 ml tampone di eluizione: 0,1 M glicina pH 2,5-3 alla colonna e raccogliere 50 ml frazione (s). Capovolgere il tubo 2-3x, misurare il pH e aggiungere tampone neutralizzante fino a quando hai raggiunto il pH 7,2-7,4. </li><li> Raccogliere gocce di eluato IgG e con il tampone di eluizione come etalon misurare la densità ottica a 280 nm. Se le OD è &lt;0,1 raccolta stop. </li><li> Rigenerare la matrice proteina G e conservarlo secondo le istruzioni del produttore. </li></ol> Concentrazione mediante ultrafiltrazione Amicon con tubi: <ol><li> Lavare il Amicon Ultra (15 ml / 30kDa) tubi di ultrafiltrazione con 1XPBS mediante centrifugazione 15-20 mina 3220 xg a 4 ° C. Eliminare il FT dal Amicon. </li><li> Riempire i Amicons con 15 ml di eluito frazione IgG e centrifugare per 25-30 min a 3220 xg e 4 ° C, il tempo di centrifugazione dipende sempre dal contenuto proteico dell&#39;eluato. </li><li> Eliminare FT e ripetere fino a ultrafiltrazione non avete frazione eluita a sinistra. </li><li> Lavare il concentrato IgG ampiamente, per due volte, con 1XPBS 25-30 minuti per centrifugazione. </li><li> Raccogliere il &quot;appiccicoso&quot;, soluzione giallastra anticorpo dal filtro Amicon in un volume finale di 1,500-2,000 pl di 1XPBS. </li><li> Misura la concentrazione di preparazione IgG utilizzando uno spettrofotometro o NanoDrop: Conc.. (Mg / ml) = A (280 nm) x fattore di diluizione / 1,4 </li><li> Lavare e conservare i Amicons seguendo le istruzioni del produttore. </li></ol> 2. L&#39;iniezione di collagene VII-IgG specifiche in topi Prima di iniziare la procedura attuale sperimentale, assicurarsi che il pro sperimentaleprotocollo è scritto e tutti i materiali sono preparati per l&#39;esperimento. <ol><li> Preparare i fogli di dati per il punteggio malattia, ELISA, immunofluorescenza (IF), l&#39;analisi e la mieloperossidasi (MPO) test 4. </li><li> Etichettare le provette di sangue e di organi, cryomolds nonché istologia di trasformazione e Cassette per inclusione. </li><li> Le soluzioni di anticorpo deve essere preparato fresco o scongelato dalle scorte e caratterizzato per quanto riguarda la loro reattività (titolo da microscopia IF e / o ELISA). La soluzione filtrata sterile anticorpo deve essere diluito in PBS in modo che la dose richiesta per l&#39;iniezione varia tra 250-1000 microlitri. Assicurarsi di avere abbastanza IgG per eseguire l&#39;intero esperimento. </li><li> Preparare fresco anticoagulante: eparina 20 U / ml e 8,7 mg / ml di ketamina / 1,3 mg / ml miscela xilazina per anestesia. Quando sacrificare i topi hanno etichettato i tubi con il 3,7% di formaldeide preparato. </li><li> Sterilizzare gli strumenti chirurgici (bisturi, forbici, punto fine e Curvforcipes DE) e preparare siringhe (siringhe da insulina, 1 e 2 siringhe ml), aghi, fotocamera digitale e scheda di memoria aggiuntiva. </li></ol> Nota: Eseguire tutte le procedure sui topi narcotizzata ketamina / xilazina o isoflurano isoflurano è l&#39;opzione preferita per l&#39;anestesia dei controlli della pelle ogni giorno, come topi recuperare in fretta.. Tuttavia, quando si scattano fotografie, 87 mg / kg di ketamina e 13 mg / kg di xilazina di solito è iniettato per via sottocutanea. Per l&#39;eutanasia ketamina / xilazina dosaggio viene aumentato a 130 mg / kg e 20 mg di ketamina / xilazina kg. <ol><li> Controllare gli animali già segnalati per la loro condizione di salute generale, la pelle e l&#39;aspetto di pelliccia, li pesare e misurare il loro spessore orecchio (sempre rispettare lo stesso orecchio). </li><li> Registrati valori osservati e dei cambiamenti nella scheda di valutazione clinica. </li><li> Raccogliere 20-30 microlitri (2-3 gocce) sangue dalla vena della coda in una siringa contenente lo stesso volume di anticoagulante. </li><li> Disinfettare la pelliccia epelle utilizzando 80% di etanolo. </li><li> Iniettare la soluzione di anticorpi per via sottocutanea nella schiena utilizzando una siringa da insulina. (Per alcuni siti (ad esempio, le orecchie) solo piccoli volumi (10-50 microlitri) sono realizzabili da iniettare.) </li></ol> Le iniezioni devono essere ripetute ogni due giorni, 4 volte. Balb / c e C57BL6 topi di peso corporeo di circa 20 g iniziare a sviluppare la malattia 3-4 giorni dopo la prima somministrazione di 400-500 fino a 750 mcg / g di peso corporeo / iniezione autoanticorpi. Quando si finisce l&#39;esperimento: <ol><li> Mettere i topi sotto narcosi profonda, iniettando 130 mg / kg e 20 mg / kg di ketamina / xilazina per via sottocutanea, li exsanguinate dalla vena cava posteriore e tagliare il cuore. </li><li> Raccogliere campioni di tessuti / organi come la pelle: coda, l&#39;orecchio, il sangue e l&#39;esofago e metterli in tubi precedentemente etichettati e PBS o 3,7% di formaldeide riempito. </li></ol> Quando si ritorna allaboratorio: <ol><li> Centrifugare il sangue a 1.200 xg, 10 min a RT per separare il plasma, trasferire il plasma per tubi etichettati e conservare di conseguenza. </li><li> Incorporare il biopsia cutanea in ambiente ottimale Temperatura Tagliare con cryomolds correttamente, etichette, e conservarli a -80 ° C. </li><li> Posizionare i campioni di tessuto destinati istologia nelle formelle etichettati e tenerli nel 3,7% di formaldeide fino inclusione in paraffina. </li></ol> 3. La valutazione clinica della gravità della malattia I topi devono essere esaminati tutti i giorni per le lesioni della cute e delle mucose ed i risultati devono essere registrati utilizzando i moduli appropriati. I criteri per eutanasia precoce è lesioni cutanee colpiscono oltre il 20% della superficie del corpo e una perdita di peso del 5-10% del peso corporeo totale in tre giorni consecutivi, contando per un punteggio malattia di 5 (Tabella 1). <ol><li> Posizionare il mouse sul ventre. Inizia con la zona della testa, vale a dire con la destraorecchio e verificare la presenza di bolle, erosioni, crosta su quello interno, nonché sul lato esterno. Proseguire allo stesso modo con l&#39;orecchio sinistro. </li><li> Gli occhi destro e sinistro sono controllati per i segni di eritema, alopecia, erosioni e / o in crosta. </li><li> Fronte e la zona muso sono spazzolati fino al successivo, continuando con la parte ventrale del muso, labbra e la mucosa della bocca. </li><li> Esaminare la gamba anteriore destra a partire dalla zampa, in movimento verso l&#39;alto, passare alla zampa anteriore sinistra. Stessa procedura con le gambe posteriori destro e sinistro. </li><li> Spennellare con il pelo sul collo e sulla schiena zona con una pinza curva punta fine. </li><li> Accendere il mouse sul dorso e controllare la parte ventrale e ai lati ventrali degli arti allo stesso modo come in precedenza. </li><li> Controllare la coda. </li><li> Scattare foto di parti del corpo in questione, qualora i topi sviluppano la malattia. È necessario prestare attenzione alla qualità e quantità delle immagini. </li><li> Calcolare i punteggi clinici di malattia. </li></ol> 4. Analisi di campioni di pelle e Plasma <ol><li> Preparare, archiviare e / o elaborare tutti i tessuti raccolti secondo il piano. </li><li> Tagliare sezioni di tessuto congelato per IF rilevamento di anticorpi di coniglio e mouse componenti del sistema del complemento. </li><li> Analizzare il diverso contenuto di proteine ​​e di enzimi (dosaggio MPO) di tessuti congelati e / o estratti di organi. </li><li> Sezione la paraffina incorporato tessuto e macchia con H &amp; E di visualizzare l&#39;entità del danno tissutale. </li><li> Analizzare il plasma mediante ELISA, immunoblot. </li></ol>

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</ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Il trasferimento passivo di anticorpi in animali sperimentali è un approccio importante per dimostrare la patogenicità 7, -12. Modelli animali ottenuti mediante questo metodo, oltre ad essere la prova indiretta per autoimmunità 13, permettono l&#39;indagine della fase efferente del meccanismo patogenetico. Il modello di trasferimento passivo di anticorpi indotta granulociti-dipendente pelle vescicole di epidermolisi bollosa acquisita (EBA) è stato utilizzato per analizzare i meccanismi di danno tis...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome del reagente </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td><td> Commenti </td></tr><tr><td> antigene ricombinante </td><td></td><td></td><td> La codifica plasmidi per le forme ricombinanti di murino collagene VII sono disponibili presso l&#39;autore corrispondente. </td></tr><tr><td> siero di coniglio immune </td><td> <a href="http://www.eurogentec.com/" target="_blank">www.eurogentec.com</a> </td><td></td><td> Avevamo conigli bianchi New Zealand immunizzati con 200 mg di antigene, 3 volte ad intervalli di 2 settimane. A questo scopo abbiamo utilizzato i servizi di Eurogentec SA, Belgio. </td></tr><tr><td> Proteine ​​G agarosio </td><td> Roche Applied Science </td><td> 11243233001 </td><td></td></tr><tr><td> Topi BALB / c </td><td> Charles River Laboratories </td><td></td><td></td&gt; </tr><tr><td> Ottobre composto, Tissue-Tek </td><td> Sakura Finetek </td><td> 4583 </td><td> Ottobre, temperatura di taglio ottimale </td></tr><tr><td> Cryomold di serie </td><td> Sakura Finetek </td><td> 4557 </td><td> 25 millimetri × 20 mm × 5 mm </td></tr><tr><td> Cryomold intermedio </td><td> Sakura Finetek </td><td> 4566 </td><td> 15 mm × 15 mm × 5 mm </td></tr><tr><td> Uni-Link-Einbettkassette </td><td> R. Langenbrinck </td><td> 09-0503 </td><td> Istologia trasformazione e Cassette per inclusione </td></tr><tr><td> Spezial-Tatowierfarbe Schwarz </td><td> H. Hauptnerund &amp; Richard Herberholz GmbH &amp; Co. KG </td><td> 71492000 </td><td> tatuaggio pasta </td></tr><tr><td> Tatowierzange TZ1 </td><td> EBECO E. Becker GmbH &amp; Co </td><td></td><td> tatuaggio dispositivo </td></tr><tr><td> Eparina </td><td> Carl Roth GmbH &amp; Co. </td><td> 7.692,1 </td><td></td></tr><tr><td> Formaldeide 37% </td><td> Carl Roth GmbH &amp; Co. </td><td> 7386 </td><td></td></tr><tr><td> Cloridrato di ketamina </td><td> Sigma-Aldrich Chemie GmbH </td><td> K2753-1G </td><td></td></tr><tr><td> Xylazina cloridrato </td><td> Sigma-Aldrich Chemie GmbH </td><td> X1251-1G </td><td></td></tr><tr><td> PBS sterile </td><td> Biochrom </td><td> L182-50 </td><td></td></tr><tr><td> macchina fotografica digitale </td><td> Nikon </td><td> Coolpix 5400 </td><td></td></tr><tr><td> Siringa guidato unità filtro da 0,45 micron </td><td> Millipore </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Pinza </td><td> Mitutoyo 7309 </td><td> 1667338 </td><td> Farnell (distributore) </td></tr><tr><td> malattia punteggio foglio </td><td></td><td></td><td> esempio custodie insed </td></tr></tbody></table>

granulociti-dipendente indotta da autoanticorpi pelle vescicole

Granulocyte-dependent Autoantibody-induced Skin Blistering

Fenomeni autoimmuni si verificano in individui sani, ma quando auto-tolleranza non riesce, la risposta autoimmune può portare a patologia specifica. Secondo Witebsky postulati, uno dei criteri di diagnosi di una malattia autoimmune, come è la riproduzione della malattia in animali da esperimento dal trasferimento passivo di autoanticorpi. Per epidermolisi bollosa acquisita (EBA), un prototipo di organo-specifica malattia autoimmune della pelle e le mucose, diversi modelli sperimentali sono stati di recente istituzione. Nel modello animale descritto nel nostro lavoro attuale, purificati anticorpi IgG contro un tratto di 200 aminoacidi (aa 757-967) del collagene VII vengono iniettate più volte in topi che riproducono il fenotipo vesciche così come le caratteristiche del isto-e immunopatologiche caratteristiche per la salute umana EBA 1. Conclamata malattia diffusa è visto solitamente 5-6 giorni dopo la prima iniezione e l&#39;estensione della malattia correla con la dose somministrata di collagen VII-IgG specifiche. Il danno tissutale (formazione di bolle) nel sperimentale EBA dipende il reclutamento e l&#39;attivazione di granulociti da parte del tessuto-bound autoanticorpi 2, -4. Pertanto, questo modello consente la dissezione del granulociti-dipendente percorso infiammatorie coinvolte nel danno tissutale autoimmune, come il modello riproduce soltanto la cellula T-indipendente fase della risposta autoimmune efferente. Inoltre, il suo valore è sottolineata da una serie di studi che dimostrano il blister che inducono potenziale di autoanticorpi in vivo e indagare il meccanismo di formazione in blister EBA 1,3, -6. Infine, questo modello agevolerà notevolmente lo sviluppo di nuove terapie anti-infiammatorie in autoanticorpi malattie dovute al. Nel complesso, il passivo modello animale trasferimento di EBA è un modello di malattia accessibile e istruttivo e consentirà ai ricercatori di analizzare non solo patogenesi EBA, ma di rispondere a fondamentali biologicamente e clinicamenteautoimmunità domande essenziali.

Il trasferimento passivo di anticorpi antigene specifici risultati in una malattia in piena regola nei topi, che assomigliano a livelli clinici, istologici e immunopatologiche l&#39;EBA umano. Blister, croste, erosioni e alopecia sviluppano sulle orecchie, muso, zampe, gambe, schiena e intorno agli occhi dei topi. I primi segni clinici della malattia probabilmente apparirà sulle orecchie e / o della zona testa. Deposizione di specifiche IgG di coniglio, e il mouse del complemento C3 viene rilevato da diretta IF all&#39;...

Nel modello animale descritto nel nostro lavoro attuale, purificati anticorpi IgG contro un tratto di 200 aminoacidi (aa 757-967) del collagene VII vengono iniettate più volte in topi che riproducono il fenotipo vesciche così come le caratteristiche del isto-e immunopatologiche caratteristiche per la salute umana epidermolisi bollosa acquisita (EBA)<sup&gt; 1</sup&gt;.

Granulociti-dipendente indotta da autoanticorpi pelle vescicole

I fenomeni autoimmuni si verificano in individui sani, ma quando la tolleranza del self viene meno, la risposta autoimmune può dare luogo a patologie specifiche. Secondo...

Sono Cassian RO del Dipartimento di Dermatologia dell'Università di Friburgo, Germania. La ricerca del nostro laboratorio si concentra sulla patogenesi delle malattie cutanee autoimmuni. Una delle malattie autoimmuni che ci interessa è l'Epidermolisi BOLLOSA o EBAA, una malattia autoimmune organo-specifica con un sistema di autoanticorpi e antigene ben definito, per la quale sono disponibili modelli complementari es vivo e animali.La formazione di bolle nell'EBA può essere riprodotta trasferendo anticorpi contro il collagene di tipo sette nei topi. Pertanto, in questo articolo video, presenteremo l'induzione e l'analisi della formazione di bolle cutanee nei topi mediante il trasferimento passivo di anticorpi specifici per il collagene sette. Ciao, sono King OBA del gruppo CAS del Dipartimento di Dermatologia dell'Ospedale Universitario di Friburgo.In questo video, vi mostreremo come il modello sperimentale murino di EBA viene indotto tramite il trasferimento passivo di autoanticorpi patogeni. Utilizziamo questa procedura quando esaminiamo i possibili meccanismi patogenetici nei disturbi autoimmuni della pelle o quando cerchiamo epitopi patogeni. Per stabilire il modello di trasferimento passivo per l'EBA, è necessario eseguire alcuni passaggi aggiuntivi prima dell'iniezione di autoanticorpi in topi wild type palp.Come primo passo, conigli bianchi vengono immunizzati per via sottocutanea con l'antigene ricombinante purificato. L'IgG totale proveniente dal siero di coniglio viene isolata mediante cromatografia su colonna ad affinità e successivamente iniettata in topi di tipo selvaggio. Le iniezioni vengono somministrate per via sottocutanea ogni due giorni per quattro volte, e il sangue viene prelevato a intervalli di due giorni.I topi vengono esaminati quotidianamente per valutarne le condizioni generali e la presenza di lesioni cutanee. Durante l'esperimento, vengono calcolati punteggi clinici individuali che riflettono l'attività della malattia e, due settimane dopo la prima iniezione, gli animali vengono sacrificati e vengono prelevati campioni di siero e biopsie cutanee da analizzare ulteriormente. Dopo il tempo di incubazione, posizionare una colonna su un supporto verticale, aprire il fondo, battere leggermente e raccogliere il flusso in uscita.In provette Falcon da 50 millilitri, conservare il flusso in uscita finché non si ottiene la conferma tramite analisi di fluorescenza immunitaria che si tratta di un concentrato privo di anticorpi specifici, diluito di IgG mediante ultrafiltrazione in speciali provette Amicon a 3.220 × g per 30 minuti a quattro gradi. La concentrazione consiste nel far passare l’eluato attraverso un filtro, scartando il flusso in uscita, ricaricando la provetta e ripetendo il procedimento finché non rimane più eluato. Come ultimo passaggio, lavare con PBS 1×, raccogliere l’IgG concentrata di colore giallastro e vischiosa, misurarne la concentrazione e conservarla in provette opportunamente etichettate.Prima di iniziare l'effettiva iniezione degli autoanticorpi, valutarne la specificità e il titolo mediante immunofluorescenza indiretta. Incubare sezioni crioconservate di cute normale di maiale con diluizioni seriali del preparato di IGT e visualizzarne il deposito mediante un anticorpo secondario adeguatamente marcato, documentando i risultati con acquisizione di immagini, prima di recarsi al centro animali. Assicurarsi che il protocollo sperimentale sugli animali sia stato redatto e che tutti i materiali siano pronti.Schede dati per la valutazione clinica dell'attività della malattia, provette etichettate per campioni di sangue e tessuto. Soluzione di anticorpo diluita in modo che il volume corretto possa essere iniettato. Strumenti chirurgici sterilizzati con anticoagulante fresco e siringhe, nonché agenti anestetizzanti.Un calibro e una fotocamera digitale dovrebbero essere inclusi anche nella checklist. Dopo aver pulito la superficie di lavoro e preparato l'installazione con isoflurano, eparinizzare la siringa per il prelievo di sangue e riempire una siringa per insulina con la soluzione anticorpale. Prelevare il topo dalla gabbia, verificarne il numero di identificazione e pesarlo.Scrivere tutti i dati misurati e osservati nel foglio dei dati personali e del punteggio clinico dei topi. Quando il topo è già sotto ssis, misurare lo spessore dell'orecchio, quindi verificare l'aspetto della pelle e del pelo dell'animale. Prestare particolare attenzione alla zona posteriore della testa, all'addome e agli arti.Prelevare il sangue dalla vena della coda attraverso una piccola incisione praticata nel suo terzo superiore, disinfettare il pelo e sollevare la pelle. Iniettare con attenzione la soluzione di IgG per via sottocutanea sulla parte dorsale. Al rientro in laboratorio, centrifugare il sangue per 10 minuti a 1.200 ×g a temperatura ambiente per ottenere il siero. Trasferire il campione in provette opportunamente etichettate e conservarle secondo il piano stabilito.Esaminare i topi quotidianamente per rilevare segni di malattia quando iniziano a sviluppare eritema alopecia e lesioni cutanee. Oltre a misurare il loro peso, valutare l'attività della malattia. Iniettare sottocute una miscela di chetamina cila per indurre l'anestesia nel topo.Misurare lo spessore dell'orecchio e successivamente iniziare il controllo generale del corpo. Utilizzare pinzette fini curve per spostare il pelo in direzione opposta a quella della crescita, al fine di esporre eventuali aree interessate. Procedere intorno al viso.L'occhio del muso si sposta verso la parte esterna e interna dell'orecchio, quindi controllare anche l'altro lato della testa. Proseguire con la mucosa della cavità orale, la parte ventrale del muso e la zona addominale. La zona dorsolaterale, dorsale e del collo, così come gli arti anteriori e le zampe.Quantificare l'estensione delle lesioni nel registro, riportando i risultati nel modulo in base alla superficie cutanea interessata, alla percentuale di determinate parti e regioni corporee in confronto alla superficie cutanea totale del topo. Un punteggio clinico della malattia viene calcolato in base alla superficie totale di cute e mucose interessata. Infine, scattare fotografie delle parti corporee rilevanti e delle aree malate.Al termine dell'esperimento, sacrificare gli animali in condizioni di profonda anestesia e raccogliere campioni di sangue e tessuti. Le orecchie, la coda e l'esofago sono i tessuti più frequentemente prelevati in questo contesto sperimentale. Tagliare le biopsie della pelle lesa in strisce più piccole.Posizionarli in cassette per l'elaborazione e l'inclusione istologica e mantenerli in formaldeide al 3,7% fino all'inclusione in paraffina. Successivamente, processare i campioni per la colorazione ematossilina ed eosina (h e e) per l'analisi di immunofluorescenza. Includere le strisce di pelle periale nel mezzo ottimale per la temperatura di taglio e utilizzare un criostato per tagliare sezioni di sei micrometri.Eseguire un'analisi di immunofluorescenza diretta per visualizzare gli anticorpi specifici di coniglio legati al tessuto e i componenti del complemento murino; come saggio aggiuntivo, eseguire un Elisa utilizzando piastre di microtitolazione rivestite con antigene ricombinante e sieri murini diluiti in serie al fine di misurare i livelli di autoanticorpi circolanti. Il trasferimento passivo di anticorpi specifici per il collagene VII provoca una malattia completa nei topi, simile a livello clinico, istologico e immunopatologico. Le bolle, le croste, le erosioni e l'alopecia tipiche dell'EBA umana si sviluppano sulle orecchie, intorno agli occhi, sul muso, zampe, gambe e dorso dei topi.L'attività della malattia, che mostra una tendenza crescente durante tutto l'esperimento, viene calcolata in base all'area interessata della pelle e delle membrane mucose. Risultati rappresentativi che mostrano il deposito di IgG specifiche di coniglio e del complemento C3 di topo, rilevati mediante immunofluorescenza indiretta alla giunzione dermo-epidermica in sezioni crioconservate di pelle perilesionale sono mostrati qui.Né IgG né complemento C3 sono stati rilevati nei controlli. L'analisi istologica successiva della cute lesa rivela vesciche sottopidermiche e infiltrato infiammatorio. Tuttavia, la formazione di vesciche sottopidermiche non si osserva nel controllo quando viene eseguito.Come mostrato qui, il modello di autoanticorpo utilizzato per il distacco sottopidermico contribuirà notevolmente allo studio delle vie infiammatorie dipendenti da ROY attivate dagli autoanticorpi, che portano al danno tissutale. La sua progettazione robusta e il protocollo semplice lo rendono adatto anche allo sviluppo e alla sperimentazione di nuove terapie antinfiammatorie nelle malattie indotte da autoanticorpi.

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