Name: Granulociti-dipendente indotta da autoanticorpi pelle vescicole (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-10-12T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 23 s
Description: Scopri il metodo di induzione di vescicole cutanee nei topi mediante trasferimento passivo di anticorpi specifici per il collagene VII. Questo modello animale riproduce le caratteristiche dell'epidermolisi bollosa acquisita umana.

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Gli autori riconoscono il supporto da finanziamenti della Deutsche Forschungsgemeinschaft SI-1281/4-1 e BIOS della Facoltà di Medicina dell&#39;Università di Friburgo (a CS).

1. Preparazione di anticorpi patogeni Nota: Purificazione e concentrazione degli anticorpi deve essere eseguito lo stesso giorno, come anticorpi non devono essere immagazzinati in 0,1 M glicina pH 2,5-3 (tampone di eluizione) per tutta la notte (ON). Purificazione di affinità di IgG: utilizzare 25 ml di siero di coniglio immune: <ol><li> Scongelare il siero di coniglio ON a 4 ° C, mescolare 1:1 con 1xPBS (tampone di corsa) e centrifugare a 1260 xg per 10 min a 20 ° C. Facoltativamente, una fase di filtrazione con filtro di carta può essere incluso dopo centrifugazione nel caso il siero è grasso. </li><li> Nel frattempo, lavare la proteina G matrice colonna riempita con 10 volumi del letto (volume del letto = volume matrice) di 1XPBS (tampone di corsa). </li><li> Applicare il siero diluito e filtrato alla colonna e incubare per 1 ora sulla piattaforma oscillante a temperatura ambiente (RT). </li><li> Raccogliere il flow-through (FT) in un tubo da 50 ml Flacon. Non gettarlo fino alla concentrazionee titolo del IgG purificata è noto. </li><li> Lavare la matrice con 5 volumi di letto 1XPBS e nel frattempo preparare 50 ml provette Falcon per la raccolta della frazione eluita IgG. Pipettare 1 ml di tampone di neutralizzazione pH: 1 M TRIS pH 10 in ciascun tubo (altrimenti la proporzione di 1:20 tampone TRIS rispetto alla quantità di eluato da raccogliere). </li><li> Applicare 100-150 ml tampone di eluizione: 0,1 M glicina pH 2,5-3 alla colonna e raccogliere 50 ml frazione (s). Capovolgere il tubo 2-3x, misurare il pH e aggiungere tampone neutralizzante fino a quando hai raggiunto il pH 7,2-7,4. </li><li> Raccogliere gocce di eluato IgG e con il tampone di eluizione come etalon misurare la densità ottica a 280 nm. Se le OD è &lt;0,1 raccolta stop. </li><li> Rigenerare la matrice proteina G e conservarlo secondo le istruzioni del produttore. </li></ol> Concentrazione mediante ultrafiltrazione Amicon con tubi: <ol><li> Lavare il Amicon Ultra (15 ml / 30kDa) tubi di ultrafiltrazione con 1XPBS mediante centrifugazione 15-20 mina 3220 xg a 4 ° C. Eliminare il FT dal Amicon. </li><li> Riempire i Amicons con 15 ml di eluito frazione IgG e centrifugare per 25-30 min a 3220 xg e 4 ° C, il tempo di centrifugazione dipende sempre dal contenuto proteico dell&#39;eluato. </li><li> Eliminare FT e ripetere fino a ultrafiltrazione non avete frazione eluita a sinistra. </li><li> Lavare il concentrato IgG ampiamente, per due volte, con 1XPBS 25-30 minuti per centrifugazione. </li><li> Raccogliere il &quot;appiccicoso&quot;, soluzione giallastra anticorpo dal filtro Amicon in un volume finale di 1,500-2,000 pl di 1XPBS. </li><li> Misura la concentrazione di preparazione IgG utilizzando uno spettrofotometro o NanoDrop: Conc.. (Mg / ml) = A (280 nm) x fattore di diluizione / 1,4 </li><li> Lavare e conservare i Amicons seguendo le istruzioni del produttore. </li></ol> 2. L&#39;iniezione di collagene VII-IgG specifiche in topi Prima di iniziare la procedura attuale sperimentale, assicurarsi che il pro sperimentaleprotocollo è scritto e tutti i materiali sono preparati per l&#39;esperimento. <ol><li> Preparare i fogli di dati per il punteggio malattia, ELISA, immunofluorescenza (IF), l&#39;analisi e la mieloperossidasi (MPO) test 4. </li><li> Etichettare le provette di sangue e di organi, cryomolds nonché istologia di trasformazione e Cassette per inclusione. </li><li> Le soluzioni di anticorpo deve essere preparato fresco o scongelato dalle scorte e caratterizzato per quanto riguarda la loro reattività (titolo da microscopia IF e / o ELISA). La soluzione filtrata sterile anticorpo deve essere diluito in PBS in modo che la dose richiesta per l&#39;iniezione varia tra 250-1000 microlitri. Assicurarsi di avere abbastanza IgG per eseguire l&#39;intero esperimento. </li><li> Preparare fresco anticoagulante: eparina 20 U / ml e 8,7 mg / ml di ketamina / 1,3 mg / ml miscela xilazina per anestesia. Quando sacrificare i topi hanno etichettato i tubi con il 3,7% di formaldeide preparato. </li><li> Sterilizzare gli strumenti chirurgici (bisturi, forbici, punto fine e Curvforcipes DE) e preparare siringhe (siringhe da insulina, 1 e 2 siringhe ml), aghi, fotocamera digitale e scheda di memoria aggiuntiva. </li></ol> Nota: Eseguire tutte le procedure sui topi narcotizzata ketamina / xilazina o isoflurano isoflurano è l&#39;opzione preferita per l&#39;anestesia dei controlli della pelle ogni giorno, come topi recuperare in fretta.. Tuttavia, quando si scattano fotografie, 87 mg / kg di ketamina e 13 mg / kg di xilazina di solito è iniettato per via sottocutanea. Per l&#39;eutanasia ketamina / xilazina dosaggio viene aumentato a 130 mg / kg e 20 mg di ketamina / xilazina kg. <ol><li> Controllare gli animali già segnalati per la loro condizione di salute generale, la pelle e l&#39;aspetto di pelliccia, li pesare e misurare il loro spessore orecchio (sempre rispettare lo stesso orecchio). </li><li> Registrati valori osservati e dei cambiamenti nella scheda di valutazione clinica. </li><li> Raccogliere 20-30 microlitri (2-3 gocce) sangue dalla vena della coda in una siringa contenente lo stesso volume di anticoagulante. </li><li> Disinfettare la pelliccia epelle utilizzando 80% di etanolo. </li><li> Iniettare la soluzione di anticorpi per via sottocutanea nella schiena utilizzando una siringa da insulina. (Per alcuni siti (ad esempio, le orecchie) solo piccoli volumi (10-50 microlitri) sono realizzabili da iniettare.) </li></ol> Le iniezioni devono essere ripetute ogni due giorni, 4 volte. Balb / c e C57BL6 topi di peso corporeo di circa 20 g iniziare a sviluppare la malattia 3-4 giorni dopo la prima somministrazione di 400-500 fino a 750 mcg / g di peso corporeo / iniezione autoanticorpi. Quando si finisce l&#39;esperimento: <ol><li> Mettere i topi sotto narcosi profonda, iniettando 130 mg / kg e 20 mg / kg di ketamina / xilazina per via sottocutanea, li exsanguinate dalla vena cava posteriore e tagliare il cuore. </li><li> Raccogliere campioni di tessuti / organi come la pelle: coda, l&#39;orecchio, il sangue e l&#39;esofago e metterli in tubi precedentemente etichettati e PBS o 3,7% di formaldeide riempito. </li></ol> Quando si ritorna allaboratorio: <ol><li> Centrifugare il sangue a 1.200 xg, 10 min a RT per separare il plasma, trasferire il plasma per tubi etichettati e conservare di conseguenza. </li><li> Incorporare il biopsia cutanea in ambiente ottimale Temperatura Tagliare con cryomolds correttamente, etichette, e conservarli a -80 ° C. </li><li> Posizionare i campioni di tessuto destinati istologia nelle formelle etichettati e tenerli nel 3,7% di formaldeide fino inclusione in paraffina. </li></ol> 3. La valutazione clinica della gravità della malattia I topi devono essere esaminati tutti i giorni per le lesioni della cute e delle mucose ed i risultati devono essere registrati utilizzando i moduli appropriati. I criteri per eutanasia precoce è lesioni cutanee colpiscono oltre il 20% della superficie del corpo e una perdita di peso del 5-10% del peso corporeo totale in tre giorni consecutivi, contando per un punteggio malattia di 5 (Tabella 1). <ol><li> Posizionare il mouse sul ventre. Inizia con la zona della testa, vale a dire con la destraorecchio e verificare la presenza di bolle, erosioni, crosta su quello interno, nonché sul lato esterno. Proseguire allo stesso modo con l&#39;orecchio sinistro. </li><li> Gli occhi destro e sinistro sono controllati per i segni di eritema, alopecia, erosioni e / o in crosta. </li><li> Fronte e la zona muso sono spazzolati fino al successivo, continuando con la parte ventrale del muso, labbra e la mucosa della bocca. </li><li> Esaminare la gamba anteriore destra a partire dalla zampa, in movimento verso l&#39;alto, passare alla zampa anteriore sinistra. Stessa procedura con le gambe posteriori destro e sinistro. </li><li> Spennellare con il pelo sul collo e sulla schiena zona con una pinza curva punta fine. </li><li> Accendere il mouse sul dorso e controllare la parte ventrale e ai lati ventrali degli arti allo stesso modo come in precedenza. </li><li> Controllare la coda. </li><li> Scattare foto di parti del corpo in questione, qualora i topi sviluppano la malattia. È necessario prestare attenzione alla qualità e quantità delle immagini. </li><li> Calcolare i punteggi clinici di malattia. </li></ol> 4. Analisi di campioni di pelle e Plasma <ol><li> Preparare, archiviare e / o elaborare tutti i tessuti raccolti secondo il piano. </li><li> Tagliare sezioni di tessuto congelato per IF rilevamento di anticorpi di coniglio e mouse componenti del sistema del complemento. </li><li> Analizzare il diverso contenuto di proteine ​​e di enzimi (dosaggio MPO) di tessuti congelati e / o estratti di organi. </li><li> Sezione la paraffina incorporato tessuto e macchia con H &amp; E di visualizzare l&#39;entità del danno tissutale. </li><li> Analizzare il plasma mediante ELISA, immunoblot. </li></ol>

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</ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Il trasferimento passivo di anticorpi in animali sperimentali è un approccio importante per dimostrare la patogenicità 7, -12. Modelli animali ottenuti mediante questo metodo, oltre ad essere la prova indiretta per autoimmunità 13, permettono l&#39;indagine della fase efferente del meccanismo patogenetico. Il modello di trasferimento passivo di anticorpi indotta granulociti-dipendente pelle vescicole di epidermolisi bollosa acquisita (EBA) è stato utilizzato per analizzare i meccanismi di danno tis...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome del reagente </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td><td> Commenti </td></tr><tr><td> antigene ricombinante </td><td></td><td></td><td> La codifica plasmidi per le forme ricombinanti di murino collagene VII sono disponibili presso l&#39;autore corrispondente. </td></tr><tr><td> siero di coniglio immune </td><td> <a href="http://www.eurogentec.com/" target="_blank">www.eurogentec.com</a> </td><td></td><td> Avevamo conigli bianchi New Zealand immunizzati con 200 mg di antigene, 3 volte ad intervalli di 2 settimane. A questo scopo abbiamo utilizzato i servizi di Eurogentec SA, Belgio. </td></tr><tr><td> Proteine ​​G agarosio </td><td> Roche Applied Science </td><td> 11243233001 </td><td></td></tr><tr><td> Topi BALB / c </td><td> Charles River Laboratories </td><td></td><td></td&gt; </tr><tr><td> Ottobre composto, Tissue-Tek </td><td> Sakura Finetek </td><td> 4583 </td><td> Ottobre, temperatura di taglio ottimale </td></tr><tr><td> Cryomold di serie </td><td> Sakura Finetek </td><td> 4557 </td><td> 25 millimetri × 20 mm × 5 mm </td></tr><tr><td> Cryomold intermedio </td><td> Sakura Finetek </td><td> 4566 </td><td> 15 mm × 15 mm × 5 mm </td></tr><tr><td> Uni-Link-Einbettkassette </td><td> R. Langenbrinck </td><td> 09-0503 </td><td> Istologia trasformazione e Cassette per inclusione </td></tr><tr><td> Spezial-Tatowierfarbe Schwarz </td><td> H. Hauptnerund &amp; Richard Herberholz GmbH &amp; Co. KG </td><td> 71492000 </td><td> tatuaggio pasta </td></tr><tr><td> Tatowierzange TZ1 </td><td> EBECO E. Becker GmbH &amp; Co </td><td></td><td> tatuaggio dispositivo </td></tr><tr><td> Eparina </td><td> Carl Roth GmbH &amp; Co. </td><td> 7.692,1 </td><td></td></tr><tr><td> Formaldeide 37% </td><td> Carl Roth GmbH &amp; Co. </td><td> 7386 </td><td></td></tr><tr><td> Cloridrato di ketamina </td><td> Sigma-Aldrich Chemie GmbH </td><td> K2753-1G </td><td></td></tr><tr><td> Xylazina cloridrato </td><td> Sigma-Aldrich Chemie GmbH </td><td> X1251-1G </td><td></td></tr><tr><td> PBS sterile </td><td> Biochrom </td><td> L182-50 </td><td></td></tr><tr><td> macchina fotografica digitale </td><td> Nikon </td><td> Coolpix 5400 </td><td></td></tr><tr><td> Siringa guidato unità filtro da 0,45 micron </td><td> Millipore </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Pinza </td><td> Mitutoyo 7309 </td><td> 1667338 </td><td> Farnell (distributore) </td></tr><tr><td> malattia punteggio foglio </td><td></td><td></td><td> esempio custodie insed </td></tr></tbody></table>

granulociti-dipendente indotta da autoanticorpi pelle vescicole

Granulocyte-dependent Autoantibody-induced Skin Blistering

Fenomeni autoimmuni si verificano in individui sani, ma quando auto-tolleranza non riesce, la risposta autoimmune può portare a patologia specifica. Secondo Witebsky postulati, uno dei criteri di diagnosi di una malattia autoimmune, come è la riproduzione della malattia in animali da esperimento dal trasferimento passivo di autoanticorpi. Per epidermolisi bollosa acquisita (EBA), un prototipo di organo-specifica malattia autoimmune della pelle e le mucose, diversi modelli sperimentali sono stati di recente istituzione. Nel modello animale descritto nel nostro lavoro attuale, purificati anticorpi IgG contro un tratto di 200 aminoacidi (aa 757-967) del collagene VII vengono iniettate più volte in topi che riproducono il fenotipo vesciche così come le caratteristiche del isto-e immunopatologiche caratteristiche per la salute umana EBA 1. Conclamata malattia diffusa è visto solitamente 5-6 giorni dopo la prima iniezione e l&#39;estensione della malattia correla con la dose somministrata di collagen VII-IgG specifiche. Il danno tissutale (formazione di bolle) nel sperimentale EBA dipende il reclutamento e l&#39;attivazione di granulociti da parte del tessuto-bound autoanticorpi 2, -4. Pertanto, questo modello consente la dissezione del granulociti-dipendente percorso infiammatorie coinvolte nel danno tissutale autoimmune, come il modello riproduce soltanto la cellula T-indipendente fase della risposta autoimmune efferente. Inoltre, il suo valore è sottolineata da una serie di studi che dimostrano il blister che inducono potenziale di autoanticorpi in vivo e indagare il meccanismo di formazione in blister EBA 1,3, -6. Infine, questo modello agevolerà notevolmente lo sviluppo di nuove terapie anti-infiammatorie in autoanticorpi malattie dovute al. Nel complesso, il passivo modello animale trasferimento di EBA è un modello di malattia accessibile e istruttivo e consentirà ai ricercatori di analizzare non solo patogenesi EBA, ma di rispondere a fondamentali biologicamente e clinicamenteautoimmunità domande essenziali.

Il trasferimento passivo di anticorpi antigene specifici risultati in una malattia in piena regola nei topi, che assomigliano a livelli clinici, istologici e immunopatologiche l&#39;EBA umano. Blister, croste, erosioni e alopecia sviluppano sulle orecchie, muso, zampe, gambe, schiena e intorno agli occhi dei topi. I primi segni clinici della malattia probabilmente apparirà sulle orecchie e / o della zona testa. Deposizione di specifiche IgG di coniglio, e il mouse del complemento C3 viene rilevato da diretta IF all&#39;...

Nel modello animale descritto nel nostro lavoro attuale, purificati anticorpi IgG contro un tratto di 200 aminoacidi (aa 757-967) del collagene VII vengono iniettate più volte in topi che riproducono il fenotipo vesciche così come le caratteristiche del isto-e immunopatologiche caratteristiche per la salute umana epidermolisi bollosa acquisita (EBA)<sup&gt; 1</sup&gt;.

Granulociti-dipendente indotta da autoanticorpi pelle vescicole

I fenomeni autoimmuni si verificano in individui sani, ma quando la tolleranza del self viene meno, la risposta autoimmune può dare luogo a patologie specifiche. Secondo...

Sono Cassian RO del Dipartimento di Dermatologia dell'Università di Friburgo, Germania. La ricerca del nostro laboratorio si concentra sulla patogenesi delle malattie cutanee autoimmuni. Una delle malattie autoimmuni che ci interessa è l'Epidermolisi BOLLOSA o EBAA, una malattia autoimmune organo-specifica con un sistema di autoanticorpi e antigene ben definito, per la quale sono disponibili modelli complementari es vivo e animali.La formazione di bolle nell'EBA può essere riprodotta trasferendo anticorpi contro il collagene di tipo sette nei topi. Pertanto, in questo articolo video, presenteremo l'induzione e l'analisi della formazione di bolle cutanee nei topi mediante il trasferimento passivo di anticorpi specifici per il collagene sette. Ciao, sono King OBA del gruppo CAS del Dipartimento di Dermatologia dell'Ospedale Universitario di Friburgo.In questo video, vi mostreremo come il modello sperimentale murino di EBA viene indotto tramite il trasferimento passivo di autoanticorpi patogeni. Utilizziamo questa procedura quando esaminiamo i possibili meccanismi patogenetici nei disturbi autoimmuni della pelle o quando cerchiamo epitopi patogeni. Per stabilire il modello di trasferi

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Dermatite erpetiforme (DH) è una condizione infiammatoria cronica caratterizzata da una reazione autoimmune tra IgA e transglutaminasi epidermica (ETG). DH si sviluppa in una porzione molto piccola di pazienti glutine-sensibile e / o celiaci. I risultati di questo studio indicano che DH può anche svilupparsi in un ospite scimmia rhesus con i sintomi della dermatite idiopatica.

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Il trasferimento di linfociti bm12 in un ricevente C57BL/6 è un modello consolidato di lupus eritematoso sistemico. Qui descriviamo come iniziare la malattia utilizzando questo modello e come caratterizzare le cellule T follicolari helper, le cellule B del centro germinale e le plasmacellule mediante citometria a flusso.

Il BM12 inducibile modello di Lupus Eritematoso Sistemico (LES) in C57BL / 6 Mice

Qui, forniamo una dimostrazione del modello cutaneo richiamo della bolla di aspirazione. Il modello consente un semplice accesso a studiare umano in vivo risposte immunitarie, per esempio nel contesto di sviluppo di un vaccino.

Un protocollo di aspirazione Blister per studiare T-cellula umana richiamo Responses In Vivo

Questo protocollo descrive la generazione di chimere di midollo osseo murino misto con i centri germinali autoimmune spontanei, in cui autoreattive linfociti trasportano un reporter di proteina fluorescente verde (GFP-PA) fuse. Questo fornisce la possibilità di collegare posizione cellulare nei tessuti con analisi molecolari e funzionali a valle.

Interrogando i centri germinali autoreattive individuali di fotoattivazione in un modello misto chimerico dell'autoimmunità

Il test di attivazione dei basofili è un test diagnostico complementare in vitro per la valutazione delle reazioni allergiche IgE-mediate basato sulla rilevazione dell'attivazione dei basofili in presenza di uno stimolo specifico attraverso la misura dei marcatori di attivazione mediante citometria a flusso.

Test di attivazione dei basofili per la diagnosi di allergia

Lo studio dimostra il ruolo della pelle nella modulazione delle risposte immunitarie nei topi attraverso l'immunizzazione epicutanea (EC). L'immunizzazione EC con un antigene proteico può sopprimere le risposte immunitarie nell'ipersensibilità da contatto o invertire la soppressione indotta dalla pelle se combinata con modelli molecolari associati a patogeni. L'immunizzazione EC si dimostra promettente come approccio efficace e senza ago all'immunoterapia.

Modello murino di immunomodulazione indotta per via epicutanea

Le lesioni cutanee sono caratteristiche comuni e importanti in molte malattie reumatiche e la biopsia con analisi patologica svolge un ruolo fondamentale nella diagnosi. Questo articolo fornisce una panoramica dettagliata della procedura standardizzata di biopsia cutanea e, utilizzando come esempio il lupus eritematoso discoide, evidenzia il ruolo essenziale della dermatopatologia nella diagnosi delle malattie reumatiche.

Biopsia cutanea per la diagnosi di lupus eritematoso discoide

Ottimizzazione del modello sperimentale per criceto leishmaniosi cutanea da iniezione intradermica...

Leishmaniosi cutanea nella pelle dorsale di criceti: ​​un modello utile per lo screening delle droghe Antileishmanial

Questo articolo descrive un metodo per visualizzare la formazione di una sinapsi HIV-1 busta-indotta virologici vetro bistrati planari supportate da fluorescenza riflessione interna totale (TIRF) microscopia. Il metodo può anche essere combinato con immunofluorescenza per rilevare l'attivazione e ridistribuzione di molecole di segnalazione che si verificano durante HIV-1 busta indotta la formazione di sinapsi virologica.

Imaging di HIV-1 Envelope indotta Synapse virologica e segnalazione sui doppi strati lipidici sintetici

Scopri il metodo di induzione di vescicole cutanee nei topi mediante trasferimento passivo di anticorpi specifici per il collagene VII. Questo modello animale riproduce le caratteristiche dell'epidermolisi bollosa acquisita umana.

Granulociti-dipendente indotta da autoanticorpi pelle vescicole

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