Due-e tridimensionale Live Cell Imaging di proteine ​​danno al DNA di risposta

Questa dimostrazione utilizza l'immagineggiatura di cellule vive in 2D e 3D per comprendere le relazioni spaziotemporali delle proteine coinvolte nella risposta al danno del DNA. Per prima cosa, trasfettare o trasdurre la linea cellulare di interesse con costrutti di espressione contenenti marcatori fluorescenti appropriati. Qui, M Cherry e GFP; successivamente acquisire una serie di video di controllo che mostrano le cellule marcate fluorescentemente in condizioni normali.

Quindi applicare un trattamento appropriato e acquisire dati sugli effetti del trattamento sul processo delle cellule fluorescenti, analizzando i dati video per le relazioni spaziotemporali delle proteine. In definitiva, la microscopia a fluorescenza su cellule vive può descrivere dinamiche cellulari come la formazione di fuochi di 53 BP1 in risposta ad agenti danneggiatori del DNA o il comportamento di 53 BP1 durante la mitosi. Abbiamo sviluppato inizialmente interesse per l'imaging in 2D e 3D quando abbiamo voluto studiare come diversi trattamenti influenzassero la mitosi in determinate linee cellulari.

Questo approccio sperimentale ci permette di studiare la risposta al danno del DNA e il mantenimento della stabilità genomica più facilmente rispetto ai metodi tradizionali. Inoltre, è possibile utilizzare questo metodo per studiare come determinate proteine interagiscono in diverse vie di segnalazione e in diverse linee cellulari. Il principale vantaggio dell'imaging in vita rispetto a tecniche tradizionali come la citochimica è che consente lo studio delle proteine della risposta al danno del DNA in tempo reale.

Ottimizzare le condizioni di registrazione corrette può risultare impegnativo. Questa dimostrazione può essere utilizzata per osservare i numerosi piccoli passaggi necessari per garantire il successo. Ricordare che la perseveranza dà i suoi frutti quando si tratta di minimizzare lo sbiancamento fotoindotto, individuare gli intervalli di registrazione appropriati e la durata ottimale della registrazione, ecc.

Trasfetta o trasduci le linee cellulari appropriate con i plasmidi per l'espressione delle proteine di fusione mCherry e GFP. Mantieni le colture in presenza di antibiotico selettivo e verifica periodicamente l'espressione delle proteine fluorescenti il giorno precedente all'acquisizione delle immagini. Raccogli le cellule utilizzando la tripsina.

Quindi seminare colture a bassa densità su piastre da 3,5 centimetri con fondo in vetro per piatti fluoro. Questo protocollo è stato sviluppato utilizzando il microscopio confocale a disco rotante Zeiss Cell Observer SD, dotato di un supporto Axio Observer Z1. Per prima cosa, verificare che il gas CO2 sia in funzione nel modulo CO2 del sistema di incubazione. Se il microscopio è montato su un tavolo antivibrante Airtable, accendere l'alimentazione d'aria per l'Airtable.

Ora accendere l'alimentazione per l'unità del disco rotante del microscopio, le telecamere, i moduli di incubazione, l'illuminatore HXP, lo stage motorizzato, il laser argonico e il computer. Accendere gli interruttori per le linee laser da utilizzare. Avviare il software Axio Vision.

Il software Avision può essere personalizzato con finestre e menu a discesa specifici per il microscopio e per i componenti che controlla. Di conseguenza, ogni interfaccia utente può avere un aspetto unico. Circa un'ora prima dell'acquisizione delle immagini, individuare i controlli dell'incubatrice e accendere il riscaldamento per la camera superiore e per la piastra del palchetto.

Impostare la temperatura a 37 gradi Celsius. Accendere il controllo CO2 e regolare il livello al 5%. Selezionare l'obiettivo per l'acquisizione delle immagini in questo studio. L'obiettivo richiede l'uso di un mezzo di immersione con un indice di rifrazione simile a quello dell'acqua.

Se è necessario acquisire immagini di più posizioni per lunghi periodi di tempo, assicurarsi di applicare un quantitativo sufficiente di mezzo di immersione in modo che la preparazione non si asciughi. Posizionare la piastra di coltura sul palchetto e portare la lente obiettiva a contatto con il fondo, utilizzando i comandi del microscopio o il software. Indirizzare la luce emessa verso gli oculari e selezionare il set di filtri a campo ampio appropriato per il segnale fluorescente di interesse.

Ora osservare attraverso le lenti oculari. Mettere a fuoco l'immagine e individuare un campo cellulare adatto utilizzando il software o i comandi del microscopio. Deviare la luce emessa lontano dagli oculari verso la porta con l'unità a disco rotante confocale nel software.

Accendere il laser appropriato per questo studio. Per ogni canale, regolare l'intensità del laser modificando il controllo del filtro ottico accordabile kuo a un livello adeguato. Successivamente, selezionare lo specchio dicromatico e i filtri di emissione appropriati.

Aprire lo scatto dell'unità a disco rotante. Selezionare ora la finestra live per visualizzare il campo attuale. Aprire ora la finestra di controllo della fotocamera.

Selezionare la fotocamera da utilizzare e impostare il tempo di esposizione a circa 100 millisecondi. Regolare la percentuale e il guadagno EM secondo necessità. Inoltre, aprire il controllo per l'unità confocale a disco rotante e regolare la velocità del disco rotante inserendo il tempo di esposizione della fotocamera che è stato impostato per acquisire un'immagine adeguata.

Fare clic su imposta per confermare la modifica. Aprire ora la finestra di acquisizione multidimensionale. Selezionare la scheda canale e caricare o selezionare i canali appropriati definiti per i Flora Fours.

Per garantire la registrazione delle immagini, utilizzare uno specchio dicromatico comune per entrambi i canali. Impostare il software sulla messa a fuoco automatica. Procedere alla finestra MDA e fare clic sulla scheda ZS stack.

Selezionare lo stack ZS alla posizione attuale del fuoco. Impostare l'intervallo per uno Zack di 10 micron e scegliere il numero ottimale di passi per garantire un campionamento di Nyquist lungo l'asse Z. Ora fare clic su "start" e analizzare l'immagine dello stack Z risultante. Selezionare la scheda temporale.

Impostare l'intervallo tra i punti temporali di acquisizione e la durata complessiva della sessione. Per l'acquisizione multipunto di diverse cellule nella piastra, aprire la finestra MDA. Selezionare la scheda posizione e verificare che l'opzione applica impostazione prima o dopo ogni punto temporale per posizione sia selezionata.

Ora selezionare "mark". Utilizzare la vista in tempo reale, spostare la piastra e selezionare i campi visivi appropriati. Fare clic su "start" nel menu di acquisizione multidimensionale per iniziare l'esperimento e registrare un video di controllo.

Procedere aggiungendo il trattamento appropriato e registrare il video sperimentale a intervalli di tempo determinati per un periodo definito. Per questa linea cellulare e per monitorare l'intero processo di mitosi, abbiamo utilizzato un intervallo di sette minuti e mezzo per una durata di quattro-cinque ore. Dovrete determinare le impostazioni specifiche in base alla vostra linea cellulare e all'aspetto che desiderate studiare.

Aprire il software Velocity, creare e denominare una nuova libreria ed importare i file video sperimentali per visualizzarli. Provare a utilizzare l'impostazione di fuoco esteso, regolando i video secondo necessità. Velocity è dotato di una serie di strumenti per migliorare la qualità delle immagini acquisite.

Se le impostazioni del microscopio sono appropriate, si risparmierà molto tempo successivamente durante la modifica. Spesso è utile elaborare le immagini e regolare la luminosità e il contrasto; le esigenze specifiche varieranno in base al vostro esperimento. Per visualizzare le cellule in 3D, passate all'impostazione di opacità 3D.

Questo consente la rotazione delle cellule rese in 3D nello spazio, fornendo così diverse prospettive delle strutture di interesse all'interno delle cellule. Filmati. Le immagini fisse possono essere esportate in diversi formati di file in base alle preferenze dell'utente Rispetto ai controlli. Le cellule di fibroblasti esposte a CPT hanno formato fuochi entro cinque-dieci minuti e hanno mantenuto tali fuochi per tutta la durata della registrazione.

È interessante notare che, nelle cellule renali embrionali umane, la proteina 53BP1 si dissocia dalla cromatina all'inizio della mitosi, formando un alone tenue attorno ai cromosomi in condensazione. Mentre avviene la telofase e la mitosi volge al termine, la 53BP1 si aggrega nuovamente in fuochi distinti. Speriamo che questo video vi permetta di studiare le relazioni spaziotemporali delle proteine coinvolte nella risposta al danno del DNA, così come in altre vie metaboliche.

Ad esempio, nel campo della dinamica della cromatina, questa tecnica è stata utilizzata per studiare come il legame di 53 BP1 influisce sul movimento delle estremità telomeriche del DNA. Dopo la creazione di cellule geneticamente modificate, l'acquisizione di immagini in tempo reale in due e tre dimensioni può essere eseguita in circa quattro a otto ore. Assicurarsi che le impostazioni del microscopio siano regolate adeguatamente per ottenere un'immagine ottimale.