Due-e tridimensionale Live Cell Imaging di proteine danno al DNA di risposta
September 28th, 2012
Questo protocollo descrive un metodo per la visualizzazione di un DNA a doppio filamento proteina pausa segnalazione attivato in risposta al danno del DNA e la sua localizzazione durante la mitosi.
Questa dimostrazione utilizza l'imaging di cellule vive in 3D per comprendere le relazioni spazio-temporali delle proteine coinvolte nella risposta al danno al DNA. Innanzitutto, trasfetta o trasduce la tua linea cellulare preferita con costrutti di espressione contenenti marcatori fluorescenti appropriati. Qui M Cherry e GFP acquisiscono una serie di video di controllo che mostrano le cellule marcate in fluorescenza in condizioni normali.
Quindi applicare un trattamento appropriato e acquisire i dati degli effetti del trattamento sul processo delle cellule fluorescenti e analizzare i dati video per le relazioni spazio-temporali delle proteine. In definitiva, la microscopia a fluorescenza su cellule vive può dettagliare le dinamiche cellulari come la formazione di 53 BP 1 focolai in risposta ad agenti dannosi per il DNA o 53 BP 1 durante la mitosi. Ci siamo interessati per la prima volta all'imaging a due e 3D dello stile di vita quando volevamo studiare in che modo i vari trattamenti influenzavano la mitosi in alcune linee cellulari.
Questo approccio sperimentale ci permette di studiare la risposta al danno al DNA e il mantenimento della stabilità genomica più facilmente rispetto ai metodi tradizionali. Inoltre, è possibile utilizzare questo metodo per studiare come alcune proteine interagiscono in varie vie di segnalazione e varie linee cellulari. Il vantaggio principale dell'imaging dello stile di vita rispetto alle tecniche tradizionali come la citochimica è che consente lo studio delle proteine di risposta al danno del DNA in tempo reale.
Ottimizzare le giuste condizioni di registrazione può essere difficile. Questa dimostrazione può essere utilizzata per vedere i molti piccoli passi necessari per garantire il successo. Ricorda che la perseveranza ripaga quando si tratta di ridurre al minimo lo sbiancamento delle foto, trovare i giusti intervalli di registrazione e la giusta durata di registrazione, eccetera.
Trasfettare o trasdurre le linee cellulari appropriate con i plasmidi per l'espressione delle proteine di fusione mCherry e GFP. Mantenere le colture sotto selezione farmacologica e controllare periodicamente l'espressione delle proteine fluorescenti il giorno prima dell'acquisizione dell'immagine. Raccogli le cellule usando la tripsina.
Quindi seminare colture a bassa densità su piastre di vetro per piastre di vetro da 3,5 centimetri. Questo protocollo è stato sviluppato utilizzando il microscopio confocale a disco rotante Zeiss cell observer SD, dotato di un axio observer Z one stand Innanzitutto, verificare che il gas CO2 stia correndo verso il modulo CO2 del sistema di incubazione. Se il microscopio è supportato da un Airtable antivibrante, attivare l'alimentazione dell'aria per l'Airtable.
Ora accendi l'alimentazione per il supporto del microscopio, le fotocamere dell'unità a disco rotante, i moduli di incubazione, l'illuminatore HXP, il tavolino motorizzato, il laser argonne e il computer. Accendere gli interruttori per le linee laser da utilizzare. Avviare il software di visione Asio.
Il software Avision può essere personalizzato con finestre e menu a discesa specifici per il microscopio e i componenti che controlla. In quanto tale, ogni interfaccia utente ha un aspetto potenzialmente unico Circa un'ora prima dell'imaging. Individuare i comandi dell'incubatrice e accendere il riscaldamento della camera superiore e della piastra del tavolino.
Imposta la temperatura a 37 gradi Celsius. Attivare il controllo CO2 e impostare il livello su 5%Selezionare la lente dell'obiettivo per l'imaging In questo studio. La lente dell'obiettivo richiede l'uso di un mezzo di immersione che abbia un indice di rifrazione simile all'acqua.
Se è necessario acquisire immagini di più posizioni per lunghi periodi di tempo, assicurarsi di applicare una quantità sufficiente di mezzo di immersione in modo che il cannocchiale non si asciughi. Posizionare il piatto di coltura sul tavolino e portare la lente dell'obiettivo a contatto con il fondo, utilizzando i controlli del microscopio o il software. Dirigere la luce emessa verso gli oculari e selezionare il set di filtri ad ampio campo appropriato per il segnale fluorescente di interesse.
Ora guarda attraverso le lenti oculari. Mettere a fuoco l'immagine e individuare un campo di cellule adatto utilizzando il software o i controlli del microscopio. Dirigere la luce emessa lontano dagli oculari verso la porta con l'unità disco rotante confocale nel software.
Accendi il laser appropriato per questo studio. Per ogni canale, regolare l'intensità del laser regolando il controllo del filtro sintonizzabile dell'ottica kuo su un livello appropriato. Quindi, selezionare lo specchio dicroico appropriato e i filtri di emissione.
Aprire l'otturatore dell'unità disco rotante. Ora seleziona la finestra live per visualizzare il campo visivo corrente. Ora apri la finestra di controllo della fotocamera.
Selezionare la fotocamera da utilizzare e impostare il tempo di esposizione su circa 100 millisecondi. Regolare la percentuale e il guadagno EM secondo necessità. Inoltre, aprire il controllo dell'unità disco rotante confocale e regolare la velocità del disco rotante inserendo il tempo di esposizione della fotocamera impostato per acquisire un'immagine adatta.
Fare clic su Imposta per bloccare la modifica. Ora apri la finestra di acquisizione multidimensionale. Selezionare la scheda del canale e caricare o selezionare i canali appropriati definiti per i Flora Fours.
Per garantire la registrazione dell'immagine, utilizzare uno specchio dicroico comune per entrambi i canali. Impostare il software sulla messa a fuoco automatica. Procedi alla finestra MDA e fai clic sulla scheda dello stack ZS.
Selezionare la pila ZS nella posizione di messa a fuoco corrente. Imposta l'intervallo per uno Zack da 10 micron e scegli l'ottimale per il numero di passaggi per garantire il campionamento nyquist tramite Z.Ora fai clic su avvia e analizza l'immagine dello stack Z risultante. Seleziona la scheda dell'ora.
Impostare l'intervallo tra i punti temporali dell'imaging e la durata complessiva della sessione. Per l'imaging multipunto di diverse cellule nella capsula, aprire la finestra MDA. Selezionare la scheda della posizione e verificare che l'impostazione Applica prima o dopo il punto temporale per posizione sia selezionata.
Ora seleziona il segno. Trova utilizzando la visualizzazione in tempo reale, sposta la parabola e seleziona i campi visivi appropriati. Fare clic su Avvia nel menu di acquisizione multidimensionale per iniziare l'esperimento e registrare un video di controllo.
Procedere con l'aggiunta del trattamento appropriato e registrare il video sperimentale a intervalli di tempo determinati per un periodo di tempo definito. Per questa linea cellulare e per il monitoraggio dell'intero processo di mitosi, abbiamo utilizzato un intervallo di sette minuti e mezzo e per quattro o cinque ore. Dovrai determinare le impostazioni particolari per la tua linea cellulare e per ciò che vuoi studiare.
Apri il software di velocità, crea e assegna un nome a una nuova libreria e importa i file video sperimentali per visualizzarli. Prova a utilizzare l'impostazione di messa a fuoco estesa, regola i video secondo necessità. Velocity è dotato di una serie di strumenti che consentono di migliorare la qualità delle immagini acquisite.
Se le impostazioni del microscopio sono appropriate, si risparmierà molto tempo in seguito durante l'editing. Spesso è utile devolvere le immagini e regolare la luminosità e il contrasto, le tue esigenze specifiche varieranno in base al tuo esperimento Per visualizzare le celle in 3D. Passa all'impostazione dell'opacità 3D.
Ciò consente la rotazione delle celle renderizzate in 3D nello spazio, fornendo così prospettive multiple delle strutture di interesse all'interno delle celle. Cinema. Le immagini fisse possono essere esportate in una varietà di tipi di file in base alle preferenze dell'utente rispetto ai controlli. Le cellule di fibroblasti esposte alla CPT hanno formato focolai entro 5-10 minuti e hanno mantenuto questi focolai per tutta la durata della registrazione.
È interessante notare che, nelle cellule renali embrionali umane, 53 BP uno si dissocia dalla cromatina all'inizio della mitosi, formando una sottile foschia attorno ai cromosomi in condensazione. Quando si verifica il teleph e la mitosi volge al termine 53 BP uno, ancora una volta si aggrega in focolai distinti. Ci auguriamo che questo video vi permetta di studiare le relazioni spazio-temporali delle proteine coinvolte nella risposta al danno al DNA e in altri percorsi.
Ad esempio, nel campo della dinamica della cromatina, questa tecnica è stata utilizzata per studiare come il legame di 53 BP one influenzi il movimento delle estremità telomeriche del DNA. Dopo la creazione di cellule geneticamente modificate, è possibile eseguire l'imaging di cellule vive in due e 3D in circa quattro-otto ore. Assicurarsi che le impostazioni del microscopio siano regolate in modo appropriato per ottenere immagini ottimali.
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Panoramica
Questo protocollo descrive un metodo per visualizzare una proteina di segnalazione della rottura del doppio filamento di DNA attivata in risposta al danno del DNA, nonché la sua localizzazione durante la mitosi. La dimostrazione utilizza l'imaging di cellule vive in 2D e 3D per esplorare le relazioni spazio-temporali delle proteine coinvolte nella risposta al danno del DNA.
Componenti principali dello studio
Area di scienza
- Biologia cellulare
- Risposta al danno del DNA
- Imaging di cellule vive
Contesto
- Comprendere la risposta al danno del DNA è cruciale per la regolazione del ciclo cellulare.
- I marcatori fluorescenti aiutano a visualizzare la dinamica delle proteine nelle cellule vive.
- Le tecniche di imaging in 2D e 3D migliorano l'analisi spaziale e temporale.
- 53 BP1 è una proteina chiave coinvolta nella risposta al danno del DNA.
Obiettivo dello studio
- Visualizzare l'attivazione e la localizzazione delle proteine di segnalazione del danno del DNA.
- Analizzare gli effetti degli agenti dannosi per il DNA sulla dinamica cellulare.
- Studiare il comportamento delle proteine durante la mitosi.
Metodi utilizzati
- Trasfettare o trasdurre linee cellulari con costrutti di marcatori fluorescenti.
- Acquisire video di controllo di cellule marcate con fluorofori in condizioni normali.
- Applicare trattamenti e acquisire dati sugli effetti del trattamento.
- Analizzare i dati video per le relazioni spazio-temporali delle proteine.
Principali risultati
- La microscopia a fluorescenza di cellule vive rivela la dinamica della formazione dei foci di 53 BP1.
- Il comportamento delle proteine durante la mitosi è influenzato da agenti dannosi per il DNA.
- L'imaging in 2D e 3D fornisce informazioni sulle risposte cellulari ai trattamenti.
- Le relazioni spazio-temporali delle proteine possono essere analizzate efficacemente.
Conclusioni
- Questo metodo consente un'osservazione dettagliata delle proteine della risposta al danno del DNA.
- L'imaging di cellule vive è uno strumento potente per studiare la dinamica cellulare.
- Comprendere questi processi può fornire informazioni per strategie terapeutiche contro il danno del DNA.
Domande frequenti
Executive Industry Relevance
Live cell 2D and 3D imaging of DNA damage response proteins such as 53BP1 enables direct visualization of spatiotemporal protein dynamics following genotoxic stress. This capability supports mechanistic de-risking and predictive confidence in early discovery, particularly for targets and pathways involved in genomic stability. Integrating these imaging approaches informs target validation and portfolio triage decisions in oncology and genome maintenance programs.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables real-time interrogation of DNA repair pathway activation and protein recruitment.
- Supports functional validation of DDR targets by visualizing protein localization and kinetics.
- Facilitates mechanistic de-risking by clarifying pathway engagement and cellular context.
- Provides predictive confidence for advancing DDR modulators or synthetic lethality strategies.
Screening & Assay Development
- Establishes validated live cell systems for quantitative assessment of DDR protein dynamics.
- Enables reproducible measurement of foci formation and chromatin changes post-treatment.
- Supports assay standardization for compound screening targeting DNA repair pathways.
- Allows for scalable adaptation to multiple cell lines and genetic backgrounds.
Translational & Preclinical Research
- Aligns imaging outputs with disease-relevant models of genomic instability.
- Provides continuity from discovery through preclinical validation of DDR-targeting agents.
- Enables risk-adjusted advancement by linking mechanistic readouts to translational endpoints.
- Supports biomarker development for DDR pathway engagement.
Pipeline & Workflow Integration
This imaging method integrates at the interface of early discovery and lead identification, supporting both hypothesis-driven target validation and downstream assay development for DDR-focused programs.
- Discovery Biology: Visualizes protein recruitment and chromatin remodeling in response to DNA damage, clarifying pathway function.
- Screening: Provides quantitative, reproducible readouts of DDR protein foci for compound evaluation.
- Analytics: Enables measurement of spatiotemporal protein dynamics and comparison across treatments or cell lines.
- Translational Research: Connects mechanistic imaging outputs to disease-relevant models and biomarker strategies.
- Enterprise Reuse: Offers a reusable platform for studying diverse DDR proteins and pathways across multiple projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in DDR target validation.
- Operational Value: Standardizes live cell imaging workflows for reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions and capital allocation by providing robust mechanistic data.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of DDR-targeting assets and translational biomarker strategies.
Implementation Considerations
- Requires expertise in live cell imaging, fluorescent protein engineering, and image analysis.
- Demands access to advanced confocal microscopy and environmental control systems.
- Necessitates cross-team standardization of imaging protocols and data analysis pipelines.
- Adaptable to various cell lines and DDR proteins with appropriate construct design.
- Imaging conditions must be optimized to minimize photobleaching and ensure data quality.
