Name: Due-e tridimensionale Live Cell Imaging di proteine danno al DNA di risposta (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-09-28T12:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 24 s
Description: Scopri l'imaging cellulare live 2D e 3D per studiare le relazioni spaziotemporali delle proteine coinvolte nella risposta al danno del DNA, inclusa la dinamica di 53BP1 durante la mitosi.

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Supportato in parte da R01NS064593 e R21ES016636 (KV). Microscopia è stata eseguita presso il VCU - Dipartimento di Neurobiologia e Microscopia strumento Anatomia, sostenuta, in parte, con i fondi NIH NINDS-Centro nucleo concessione 5P30NS047463. Il microscopio confocale disco rotante è stato acquistato con un NIH-NCRR premio (1S10RR027957).

A. Preparazione cellulare <ol><li> Normali fibroblasti umani primari (GM02270) sono stati ottenuti da Repository cella Coriell, Camden, New Jersey, e immortalato con hTERT 6. Le cellule sono state coltivate ed espanse in Cellstar 6 centimetri piatti a mezzi (4 ml) costituiti MEM supplementato con 20% siero fetale bovino (GIBCO), non-essential/essential aminoacidi, vitamine, sodio piruvato, e penicillina / streptomicina (HyClone ). </li><li> Rene embrionale umano 293 (HEK293) cellule sono state ottenute dalla American Type Culture Collection e coltivate ed espanse in Cellstar 6 centimetri piatti. Le cellule sono state mantenute in mezzi (4 ml) costituito da DMEM supplementato con 10% siero bovino fetale, aminoacidi non essenziali, L-glutammina, e penicillina / streptomicina. </li><li> 53BP1 mCherry-(N-Myc-53BP1 PLPC WT-Puro; Addgene plasmide 19.836) e H2B-GFP (pCLNR-H2BG; Addgene plasmide 17735) gene di fusione costrutti anche esprimere puromicina o geni di resistenza G418, rispettivamente, sono state trasdotte (fibroblam) o transfettate (HEK293) utilizzando Superfect (Qiagene) nelle cellule e mantenuto sotto la selezione dei farmaci. Manutenzione di fluorescenza è stata verificata periodicamente. </li><li> 24-48 ore prima acquisizione dell&#39;immagine, le cellule sono state tripsinizzate in una singola cella di sospensione e seminate ad una densità bassa su 3,5 centimetri lastre FluroDish fondo di vetro. </li></ol> B. Configurazione Microscopio e acquisizione di immagini Questo protocollo è stato sviluppato utilizzando il cellulare Zeiss Observer microscopio confocale disco SD filatura dotata di uno stand AxioObserver Z1, un doppio canale Yokagawa CSU-X1A unità disco 5000 la filatura, 2 fotometrici QuantEM 512SC telecamere EMCCD, un 120C HXP a base di fibre illuminatore, 4 laser (un Lasos 100mW multi-linea Argon [458, 488, 514 nm], 50 mW 405 nm diodo, 40 mW 561 nm diodo, e 30 mW 635 nm diodo), AOTF, un Pecon XL sistema multiS1 fase di incubazione, incubazione Zeiss moduli (Modulo S O 2, CO 2 Modulo S, S TempModule, Riscaldamento unità XL S) e un Priore motorized fase XY con un inserto NanoScanZ piezo Z. Per minimizzare le aberrazioni sferiche mentre le cellule vive di imaging supportato in un mezzo acquoso, un C-Apochromat 63x/1.20 Acqua / Corr lente obiettivo e Zeiss Immersol fluido immersione W (con un indice di rifrazione n = 1,334) sono stati utilizzati. Per 2 canali imaging confocale, una RQFT 405/488/568/647 specchio dicroico e BP525/50 (verde) e BP629/62 (rosso) sono stati utilizzati filtri di emissione. Il software di sistema utilizzato era Zeiss AxioVision (ver. 4.8.2.0) con AV4 Multi-channel/Z/T, Fast Imaging, Fisiologia, Mosaix, Mark &amp; ​​Find, doppia fotocamera, interna 4D, autofocus e 3-D moduli di deconvoluzione. <ol><li> Verificare che la CO2 di gas è in esecuzione per il CO 2 modulo del sistema di incubazione. Se il microscopio è supportato da un antivibrante tavolo aria, accendere l&#39;alimentazione dell&#39;aria (o N 2 gas) per la tabella dell&#39;aria. </li><li> Accendere l&#39;alimentazione per il basamento del microscopio, unità disco rotante, macchine fotografiche, i moduli di incubazione, illuminatore HXP, stadio motorizzato, Argonlaser, e il computer. </li><li> Dopo 1 minuto di tempo di riscaldamento, ruotare la chiave di accensione per il laser Argon su &quot;On&quot;. </li><li> Sul pannello di controllo laser Zeiss, attivare gli interruttori per le linee laser da utilizzare. </li><li> Spegnere l&#39;interruttore a bilico per il controller Lasos Argon laser di &quot;stand-by&quot; a &quot;run laser&quot; e regolare il regolatore della luce al livello ottimale (appena al di sotto del punto in cui l&#39;indicatore verde diventa rosso). </li><li> Avviare il software AxioVision. Nota: l&#39;interfaccia utente per AxioVision può essere personalizzato con menu finestre e pull-down che sono specifici per il microscopio particolare e dei componenti che lo controlla. Come tale, ogni sistema ha un&#39;interfaccia potenzialmente unico. Pertanto, le istruzioni generiche per la manipolazione del software sono forniti in fasi successive, piuttosto che indicazioni per le finestre di software specifici, le schede e / o menu a discesa. </li><li> Circa 1 ora prima di imaging, nel software, individuare i controlli per l&#39;incubatrice eaccendere il riscaldamento per la camera superiore e la piastra stadio. Impostare la temperatura a 37 ° C. Accendere la CO 2 di controllo e impostare il livello del 5%. </li><li> Selezionare la lente dell&#39;obiettivo per l&#39;imaging. In questo studio, un NA 63x/1.20 C-Apochromat acqua / Corr lente obiettivo è stato utilizzato. Nota: Per questo obiettivo, un mezzo immersione con un indice di rifrazione simile all&#39;acqua (Zeiss Immersol fluido immersione W) è necessario. </li><li> Se più posizioni sono separati da campionare un lungo periodo di tempo, essere certi di applicare una quantità sufficiente di medie immersione per assicurare che esso venga realizzato da una posizione all&#39;altra. </li><li> Posizionare il piatto sulla scena e portare la lente obiettivo, a contatto con il fondo. </li><li> Utilizzando sia i controlli microscopio o il software, la luce emessa per gli oculari e selezionare l&#39;widefield filtro impostato per il segnale fluorescente di interesse (per questo studio, &quot;Red&quot; filtro impostato per 53BP1 e un &quot;GFP&quot; filtro impostato per H2B ). &lt;/ Li&gt; <li> Guarda attraverso le lenti oculari, fuoco l&#39;immagine, e individuare un opportuno campo delle cellule. </li><li> Utilizzando il software o controlli microscopio, la luce emessa dalla oculari alla porta con l&#39;unità confocale disco che gira. </li><li> Nel software, accendere il laser appropriato (per questo studio, il laser 561 nm per 53BP1 e la 488 linea nm del laser Argon per H2B). </li><li> Per ciascun canale, regolare l&#39;intensità del laser regolando il acusto-ottico sintonizzabile filtro (AOTF) controllo ad un livello appropriato. </li><li> Selezionare lo specchio dicroico appropriato (RQFT 405/488/568/647) e filtri di emissione (BP 629/62 per 53BP1 e Bp 525/50 per H2B). Aprire l&#39;otturatore all&#39;unità disco rotante. </li><li> Selezionare la finestra &quot;Live&quot; per visualizzare il campo di vista corrente. </li><li> Nel software, aprire il controllo &quot;Camera&quot;, selezionare la telecamera da utilizzare (se un sistema di doppia fotocamera) e impostare il tempo di esposizione di circa 100 ms. Regolare il% e EM guadagnare più ncaNota rio:. L&#39;53BP1-mCherry costrutto appare un po &#39;debole. Abbiamo trovato utile per aumentare il guadagno EM. </li><li> Nel software, aprire il controllo per l&#39;unità confocale disco rotante e regolare la velocità di rotazione del disco inserendo il tempo di esposizione della fotocamera che è stato impostato per catturare un&#39;immagine adatta (ad esempio ~ 100 ms). Fare clic su &quot;Set&quot; per bloccare il cambiamento. </li><li> Aprite &quot;multi-dimensionale acquisizione&quot;. Selezionare la scheda di canale e caricare / selezionare i canali appropriati. Per questo studio, stiamo usando i canali definiti per DsRed (561 nm di eccitazione laser e BP 629/62 filtro per le emissioni) e GFP (488 nm linea laser per l&#39;eccitazione e BP525/50 filtro per le emissioni). </li><li> Per garantire la registrazione dell&#39;immagine, uno specchio dicroico comune (RQFT 405/488/568/647) è stato usato per entrambi i canali. Impostare il software per &quot;Autofocus&quot;. Nota: Vai a Strumenti → Impostazioni editor per modificare le impostazioni MDA. Assicurarsi che la potenza del laser adeguata è impostato (&quot;laser di potenza adeguata&quot; si intende un&#39;impostazione che consenteper eccitare il fluoroforo appropriato minimizzando foto-sbiancamento). </li><li> Nella finestra MDA, selezionare la scheda z-stack. Selezionare &quot;Z-stack in posizione del focus corrente&quot;. Impostare l&#39;intervallo di ~ 10 micron Z-Stack e scegliere &quot;ottimale&quot; per il numero di misure per garantire il campionamento di Nyquist con Z. Nota: la dimensione esatta della Z-Stack dipenderà l&#39;altezza delle vostre cellule. Regolare di conseguenza. </li><li> 23. Fare clic su &quot;Start&quot; e analizzare il risultato z-serie di immagini per verificare che le impostazioni siano appropriate per quello che si sta indagando (ad esempio, in questo studio, è stato importante per l&#39;immagine del nucleo intero). </li><li> Selezionare l&#39;opzione &quot;T&quot; (tempo) tab. Per il nostro esperimento con camptotecina, abbiamo impostato l&#39;intervallo tra timepoints imaging per 5 min e la durata complessiva della sessione per 1 ora per un controllo (non trattati cellule) video. Nota: per minimizzare fotometabolismo delle cellule, l&#39;esperimento deve essere configurato in modo tale che l&#39;AOTF sbozzati il ​​laser tra i punti di tempo di imaging. </li><li> Fo più punti di imaging di cellule diverse nel piatto, nella finestra MDA, selezionare la scheda posizione. Assicurarsi che &quot;&#39;impostazione prima / dopo il punto di tempo&#39; Applica per posizione&quot; sia selezionata. Selezionare &quot;Mark_Find&quot;. Utilizzo della vista &quot;Live&quot;, spostare il piatto intorno e selezionare i campi appropriati di vista. </li><li> Fare clic su &quot;Start&quot; nella multidimensionale acquisizione menu per avviare l&#39;esperimento e registrare un video di controllo (di cellule non trattate). </li><li> Dopo il controllo video, aggiungere il trattamento appropriato (in questo caso, camptotecina 10 pM). Abbiamo registrato sperimentale (farmaco cellule trattate) video ad intervalli 5-10 minuti per 2-4 ore. Nota: Un aspetto importante da considerare è la velocità con cui un dato effetto si verifica dopo il trattamento. Come si vede nel video, 53BP1 foci cominciano a da ~ 5 min dopo l&#39;aggiunta della CPT. Anche se un processo relativamente semplice, l&#39;aggiunta di farmaco per il piatto manualmente e ri-calibrazione del microscopio ci vuole tempo. È necessario tenere conto di questo quando si progetta esperimenti. </li><li> Per il monitoraggio mitosis, abbiamo impostato l&#39;intervallo di 7,5 min e registrati per 4-5 ore (le impostazioni specifiche dipendono dalla linea cellulare utilizzato e la lunghezza del suo ciclo cellulare). Rettifiche di valore potrebbe essere necessario essere fatto per evitare che foto-sbiancamento durante registrazioni più lunghe. </li></ol> C. Image Processing and Analysis Questo protocollo è stato sviluppato utilizzando il software Volocity (PerkinElmer). Il software utilizzato per acquisire questi dati (AxioVision) ha anche la capacità di elaborare e analizzare le immagini. Gli utenti sono incoraggiati a utilizzare il software a loro disposizione, e consultare la documentazione del caso per quanto riguarda la loro applicazione. <ol><li> Aprire il software Volocity. Creare e nominare una nuova libreria, e importare i file video. </li><li> Per visualizzare i file, di solito si trovano più utile usare la &quot;Extended Focus&quot; impostazione. Questo sovrappone i z-stack fette e, per questo protocollo, ci permette di visualizzare 53BP1 focolai in diverse zone del nucleo. </li><li> Regolare i video, se necessario. Volocity è dotato di una serie di strumenti per migliorare la qualità delle immagini acquisite. Garantendo le impostazioni del microscopio erano appropriati, molto tempo possono essere salvati in modifica in seguito. Spesso, è utile deconvolve le immagini, e regolare la luminosità / contrasto. Le vostre esigenze di editing specifici può variare in base dell&#39;esperimento. </li><li> Aggiungi un timbro relativo tempo e barra di scala. </li><li> Per visualizzare le cellule in 3-D, passare alla &quot;3-D opacità&quot; impostazione. Questo consente la rotazione delle cellule resi 3-D nello spazio, fornendo così molteplici prospettive di strutture di interesse all&#39;interno delle cellule. Nota: E &#39;utile visualizzare le cellule su piani diversi per determinare dove le strutture di viaggio interesse. Per esempio, nel &quot;avanzata Focus&quot; impostazione è difficile discernere che il 53BP1 fa, infatti, dissocia dal DNA durante la mitosi. Tuttavia, questo è evidente in 3-D. </li><li> Filmati e immagini fisse possono essere esportati in una varietà di tipi di file in base alle preferenze dell&#39;utente. </l<html> i&gt; </ol> D. Rappresentante Risultati Un esempio di formazione di foci 53BP1 in risposta al CPT è mostrato in Figura 1. Cellule esposte a forma foci CPT entro 5-10 minuti, e mantenere questi focolai tutta la durata della registrazione. Come mostrato in figura 2, 53BP1 dissocia dalla cromatina allo scoppio della mitosi, formando una nebbia sottile intorno cromosomi condensazione. Come telofase si verifica e la mitosi giunge al termine, 53BP1 ancora una volta aggregati in focolai distinti. Mentre le cellule HEK293 non sono stati esposti a CPT, hanno comunque formato abbondante, foci di riparazione spontanea 53BP1 generato dal danno al DNA endogeno. Questa osservazione ci ha permesso di concludere che 53BP1 non forma fuochi durante la mitosi presto, in linea con una precedente relazione che mostra un effetto simile dopo l&#39;esposizione delle cellule a radiazioni ionizzanti e la droga radiomimetici 5. ure 1 &quot;src =&quot; / files/ftp_upload/4251/4251fig1.jpg &quot;/&gt; Figura 1. Camptotecina (10 pM) e provoca DSBs 53BP1 formazione foci in bicicletta fibroblasti entro 30 minuti di aggiunta del farmaco al mezzo. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/4251/4251fig2.jpg" /> Figura 2. 53BP1 non formare foci durante la mitosi fino telophase/G1 in cellule HEK293.

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</ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Mantenimento dell&#39;integrità genomica è fondamentale per la sopravvivenza delle cellule. La mancata conservare i risultati del genoma in invecchiamento precoce, carcinogenesi o morte 8. C&#39;è forte interesse a discernere come funziona il DDR, derivanti dalla sua importanza per la ricerca di base e clinica. Molte tecniche sono state sviluppate nel corso degli anni per aiutare nello studio di come le cellule di rilevare e riparare i danni del DNA. I metodi tradizionali, quali immunocitochimica e Western bl...

<table border="1"><tbody><tr><td> Prodotto </td><td> Azienda </td></tr><tr><td> Cellstar cultura piatti </td><td> Greiner Bio-One </td></tr><tr><td> FluroDish piatti di vetro con fondo </td><td> Mondo Strumenti di precisione, Inc. </td></tr><tr><td> MEM supporti </td><td> GIBCO </td></tr><tr><td> Aminoacidi non essenziali </td><td> GIBCO </td></tr><tr><td> Amminoacidi </td><td> GIBCO </td></tr><tr><td> Vitamine </td><td> GIBCO </td></tr><tr><td> Sodio piruvato </td><td> Invitrogen </td></tr><tr><td> Penicillina / streptomicina </td><td> HyClone </td></tr><tr><td> Siero fetale bovino </td><td> GIBCO </td></tr><tr><td> N-Myc-53BP1 PLPC WT-Puro; plasmide 19836 </td><td> Addgene </td></tr><tr><td> pCLNR-H2BG; plasmide 17735 </td><td> Addgene </td></tr><tr><td> Superfect </td><td> Qiagen </td></tr><tr><td> Zeiss cellulare Observer SD Imaging sistema </td><td> Zeiss </td></tr><tr><td> AxioVision (versione 4.8.2) </td><td> Zeiss </td></tr><tr><td> Zeiss Immersol W Olio </td><td> Zeiss </td></tr><tr><td> Volocity software (versione 6.0) </td><td> PerkinElmer </td></tr></tbody></table>

due-e tridimensionale live cell imaging di proteine ​​danno al dna di risposta

Two- and Three-Dimensional Live Cell Imaging of DNA Damage Response Proteins

Rotture del doppio filamento (DSB) sono il DNA più deleteria lesioni una cella può incontrare. Se lasciato non riparati, DSB potenziale grande porto per generare mutazioni e aberrazioni cromosomiche 1. Per evitare questo trauma da catalizzare l&#39;instabilità genomica, è fondamentale per le cellule per individuare DSB, attivare la risposta al danno al DNA (DDR), e riparare il DNA. Quando stimolato, il DDR lavora per preservare l&#39;integrità genomica innescando arresto del ciclo cellulare per consentire la riparazione abbia luogo o forzare la cellula a subire apoptosi. I meccanismi predominanti di riparazione DSB avvenire attraverso nonhomologous end-joining (NHEJ) e ricombinazione omologa riparazione (HRR) (recensione in 2). Ci sono molte proteine ​​la cui attività deve essere orchestrato con precisione per la DDR per funzionare correttamente. Qui, si descrive un metodo per 2 - e 3-dimensionale (D) visualizzazione di una di queste proteine, 53BP1. Il p53-binding protein 1 (53BP1) localizza alle aree diDSB legandosi agli istoni modificati 3,4, la formazione di focolai entro 5-15 minuti 5. Le modifiche degli istoni e di assunzione di proteine ​​e di altri 53BP1 DDR a siti DSB si ritiene di facilitare la riorganizzazione strutturale della cromatina intorno alle aree di danno e contribuire alla riparazione del DNA 6. Al di là di partecipazione diretta nella riparazione, altri ruoli sono stati descritti per 53BP1 nella Ddr, quali la regolazione di un intra-S checkpoint, un G2 / M checkpoint, e l&#39;attivazione di proteine ​​a valle DDR 7-9. Recentemente, è stato scoperto che 53BP1 non forma foci in risposta al danno del DNA indotto durante la mitosi, invece attesa cellule a entrare G1 prima localizzazione per la vicinanza DSBs 6. Proteine ​​DDR come 53BP1 sono stati trovati per associare strutture mitotiche (come cinetocori) durante la progressione attraverso la mitosi 10. In questo protocollo si descrive l&#39;uso di 2 - e 3-D imaging cellule vive per visualizzarela formazione di foci 53BP1 in risposta al danno del DNA agente camptotecina (CPT), così come il comportamento 53BP1 durante la mitosi. Camptotecina è un inibitore della topoisomerasi I che causa principalmente DSBs durante la replicazione del DNA. Per fare questo, abbiamo utilizzato un precedentemente descritto 53BP1-mCherry proteina di fusione fluorescente costruire costituito da un dominio 53BP1 proteina in grado di legare DSB 11. Inoltre, abbiamo utilizzato un istone H2B-proteina di fusione GFP fluorescente costrutto in grado di monitorare la dinamica della cromatina durante il ciclo cellulare, ma in particolare durante la mitosi 12. Imaging cellulare Live in molteplici dimensioni è un ottimo strumento per approfondire la nostra comprensione della funzione delle proteine ​​DDR nelle cellule eucariotiche.

Questo protocollo descrive un metodo per la visualizzazione di un DNA a doppio filamento proteina pausa segnalazione attivato in risposta al danno del DNA e la sua localizzazione durante la mitosi.

Due-e tridimensionale Live Cell Imaging di proteine ​​danno al DNA di risposta

Le rotture a doppio filamento (DSB) sono le lesioni del DNA più deleterie che una cellula possa incontrare. Se non riparate, le DSB possiedono un grande potenziale di generare...

Questa dimostrazione utilizza l'immagineggiatura di cellule vive in 2D e 3D per comprendere le relazioni spaziotemporali delle proteine coinvolte nella risposta al danno del DNA. Per prima cosa, trasfettare o trasdurre la linea cellulare di interesse con costrutti di espressione contenenti marcatori fluorescenti appropriati. Qui, M Cherry e GFP; successivamente acquisire una serie di video di controllo che mostrano le cellule marcate fluorescentemente in condizioni normali.Quindi applicare un trattamento appropriato e acquisire dati sugli effetti del trattamento sul processo delle cellule fluorescenti, analizzando i dati video per le relazioni spaziotemporali delle proteine. In definitiva, la microscopia a fluorescenza su cellule vive può descrivere dinamiche cellulari come la formazione di fuochi di 53 BP1 in risposta ad agenti danneggiatori del DNA o il comportamento di 53 BP1 durante la mitosi. Abbiamo sviluppato inizialmente interesse per l'imaging in 2D e 3D quando abbiamo voluto studiare come diversi trattamenti influenzassero la mitosi in determinate linee cellulari.Questo approccio sperimentale ci permette di studiare la risposta al danno del DNA e il mantenimento della stabilità genomica più facilmente rispetto ai metodi tradizionali. Inoltre, è possibile utilizzare questo metodo per studiare come determinate proteine interagiscono in diverse vie di segnalazione e in diverse linee cellulari. Il principale vantaggio dell'imaging in vita rispetto a tecniche tradizionali come la citochimica è che consente lo studio delle proteine della risposta al danno del DNA in tempo reale.Ottimizzare le condizioni di registrazione corrette può risultare impegnativo. Questa dimostrazione può essere utilizzata per osservare i numerosi piccoli passaggi necessari per garantire il successo. Ricordare che la perseveranza dà i suoi frutti quando si tratta di minimizzare lo sbiancamento fotoindotto, individuare gli intervalli di registrazione appropriati e la durata ottimale della registrazione, ecc.Trasfetta o trasduci le linee cellulari appropriate con i plasmidi per l'espressione delle proteine di fusione mCherry e GFP. Mantieni le colture in presenza di antibiotico selettivo e verifica periodicamente l'espressione delle proteine fluorescenti il giorno precedente all'acquisizione delle immagini. Raccogli le cellule utilizzando la tripsina.Quindi seminare colture a bassa densità su piastre da 3,5 centimetri con fondo in vetro per piatti fluoro. Questo protocollo è stato sviluppato utilizzando il microscopio confocale a disco rotante Zeiss Cell Observer SD, dotato di un supporto Axio Observer Z1. Per prima cosa, verificare che il gas CO2 sia in funzione nel modulo CO2 del sistema di incubazione. Se il microscopio è montato su un tavolo antivibrante Airtable, accendere l'alimentazione d'aria per l'Airtable.Ora accendere l'alimentazione per l'unità del disco rotante del microscopio, le telecamere, i moduli di incubazione, l'illuminatore HXP, lo stage motorizzato, il laser argonico e il computer. Accendere gli interruttori per le linee laser da utilizzare. Avviare il software Axio Vision.Il software Avision può essere personalizzato con finestre e menu a discesa specifici per il microscopio e per i componenti che controlla. Di conseguenza, ogni interfaccia utente può avere un aspetto unico. Circa un'ora prima dell'acquisizione delle immagini, individuare i controlli dell'incubatrice e accendere il riscaldamento per la camera superiore e per la piastra del palchetto.Impostare la temperatura a 37 gradi Celsius. Accendere il controllo CO2 e regolare il livello al 5%. Selezionare l'obiettivo per l'acquisizione delle immagini in questo studio. L'obiettivo richiede l'uso di un mezzo di immersione con un indice di rifrazione simile a quello dell'acqua.Se è necessario acquisire immagini di più posizioni per lunghi periodi di tempo, assicurarsi di applicare un quantitativo sufficiente di mezzo di immersione in modo che la preparazione non si asciughi. Posizionare la piastra di coltura sul palchetto e portare la lente obiettiva a contatto con il fondo, utilizzando i comandi del microscopio o il software. Indirizzare la luce emessa verso gli oculari e selezionare il set di filtri a campo ampio appropriato per il segnale fluorescente di interesse.Ora osservare attraverso le lenti oculari. Mettere a fuoco l'immagine e individuare un campo cellulare adatto utilizzando il software o i comandi del microscopio. Deviare la luce emessa lontano dagli oculari verso la porta con l'unità a disco rotante confocale nel software.Accendere il laser appropriato per questo studio. Per ogni canale, regolare l'intensità del laser modificando il controllo del filtro ottico accordabile kuo a un livello adeguato. Successivamente, selezionare lo specchio dicromatico e i filtri di emissione appropriati.Aprire lo scatto dell'unità a disco rotante. Selezionare ora la finestra live per visualizzare il campo attuale. Aprire ora la finestra di controllo della fotocamera.Selezionare la fotocamera da utilizzare e impostare il tempo di esposizione a circa 100 millisecondi. Regolare la percentuale e il guadagno EM secondo necessità. Inoltre, aprire il controllo per l'unità confocale a disco rotante e regolare la velocità del disco rotante inserendo il tempo di esposizione della fotocamera che è stato impostato per acquisire un'immagine adeguata.Fare clic su imposta per confermare la modifica. Aprire ora la finestra di acquisizione multidimensionale. Selezionare la scheda canale e caricare o selezionare i canali appropriati definiti per i Flora Fours.Per garantire la registrazione delle immagini, utilizzare uno specchio dicromatico comune per entrambi i canali. Impostare il software sulla messa a fuoco automatica. Procedere alla finestra MDA e fare clic sulla scheda ZS stack.Selezionare lo stack ZS alla posizione attuale del fuoco. Impostare l'intervallo per uno Zack di 10 micron e scegliere il numero ottimale di passi per garantire un campionamento di Nyquist lungo l'asse Z. Ora fare clic su "start" e analizzare l'immagine dello stack Z risultante. Selezionare la scheda temporale.Impostare l'intervallo tra i punti temporali di acquisizione e la durata complessiva della sessione. Per l'acquisizione multipunto di diverse cellule nella piastra, aprire la finestra MDA. Selezionare la scheda posizione e verificare che l'opzione applica impostazione prima o dopo ogni punto temporale per posizione sia selezionata.Ora selezionare "mark". Utilizzare la vista in tempo reale, spostare la piastra e selezionare i campi visivi appropriati. Fare clic su "start" nel menu di acquisizione multidimensionale per iniziare l'esperimento e registrare un video di controllo.Procedere aggiungendo il trattamento appropriato e registrare il video sperimentale a intervalli di tempo determinati per un periodo definito. Per questa linea cellulare e per monitorare l'intero processo di mitosi, abbiamo utilizzato un intervallo di sette minuti e mezzo per una durata di quattro-cinque ore. Dovrete determinare le impostazioni specifiche in base alla vostra linea cellulare e all'aspetto che desiderate studiare.Aprire il software Velocity, creare e denominare una nuova libreria ed importare i file video sperimentali per visualizzarli. Provare a utilizzare l'impostazione di fuoco esteso, regolando i video secondo necessità. Velocity è dotato di una serie di strumenti per migliorare la qualità delle immagini acquisite.Se le impostazioni del microscopio sono appropriate, si risparmierà molto tempo successivamente durante la modifica. Spesso è utile elaborare le immagini e regolare la luminosità e il contrasto; le esigenze specifiche varieranno in base al vostro esperimento. Per visualizzare le cellule in 3D, passate all'impostazione di opacità 3D.Questo consente la rotazione delle cellule rese in 3D nello spazio, fornendo così diverse prospettive delle strutture di interesse all'interno delle cellule. Filmati. Le immagini fisse possono essere esportate in diversi formati di file in base alle preferenze dell'utente Rispetto ai controlli. Le cellule di fibroblasti esposte a CPT hanno formato fuochi entro cinque-dieci minuti e hanno mantenuto tali fuochi per tutta la durata della registrazione.È interessante notare che, nelle cellule renali embrionali umane, la proteina 53BP1 si dissocia dalla cromatina all'inizio della mitosi, formando un alone tenue attorno ai cromosomi in condensazione. Mentre avviene la telofase e la mitosi volge al termine, la 53BP1 si aggrega nuovamente in fuochi distinti. Speriamo che questo video vi permetta di studiare le relazioni spaziotemporali delle proteine coinvolte nella risposta al danno del DNA, così come in altre vie metaboliche.Ad esempio, nel campo della dinamica della cromatina, questa tecnica è stata utilizzata per studiare come il legame di 53 BP1 influisce sul movimento delle estremità telomeriche del DNA. Dopo la creazione di cellule geneticamente modificate, l'acquisizione di immagini in tempo reale in due e tre dimensioni può essere eseguita in circa quattro a otto ore. Assicurarsi che le impostazioni del microscopio siano regolate adeguatamente per ottenere un'immagine ottimale.

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Qui viene dimostrato come può essere utilizzato il test di Ligation Proximity (PLA) in situ per rilevare e visualizzare le interazioni proteiche-proteiche dirette tra ATM e p53 nelle colture di cellule di sospensione esposte a stress genotossico.

Rilevamento e visualizzazione di complessi proteici indotti da danni a DNA nelle cellule di cellule di sospensione utilizzando il test di legatura di prossimità

Microirradiation laser è uno strumento utile per gli studi della riparazione del DNA in cellule viventi. È indicato un approccio metodologico per l'utilizzo del laser UVA per indurre varie lesioni del DNA. Abbiamo ottimizzato un metodo per microirradiation locale che mantiene il normale ciclo cellulare; quindi, cellule irradiate procedono attraverso mitosi.

Avanzate tecniche di microscopia confocale per studiare le interazioni proteina-proteina e cinetica alle lesioni del DNA

L'obiettivo del presente protocollo è quello di descrivere come utilizzare laser microirradiation per indurre diversi tipi di danno del DNA, compreso le rotture del filo relativamente semplici e danno complesso, per studiare assieme di fattore DNA danni segnalazione e riparazione presso siti di danno in vivo .

Laser Microirradiation per lo Studio In Vivo delle risposte cellulari al danno al DNA semplici e complesse

Fluorescenza confocale microscopia e laser micro-irradiazione offrire strumenti per indurre il danno del DNA e monitoraggio della risposta delle proteine di riparazione del DNA in determinate aree sub-nucleare. Questa tecnica ha avanzato significativamente la nostra conoscenza di rilevamento dei danni, di segnalazione e di reclutamento. Questo manoscritto viene illustrato queste tecnologie per esaminare riparazione singola e doppia uscita.

Applicazione di Micro-irradiazione del Laser per l'esame di Single e Double Strand Break Repair in cellule di mammifero

Studiare la cinetica di riparazione danni del DNA richiede un sistema di indurre lesioni alle regioni definite sub-nucleare. Descriviamo un metodo per creare interruzioni di double-stranded localizzate utilizzando un microscopio confocale a scansione laser, dotato di un laser di 405 nm e forniscono procedure automatizzate per quantificare la dinamica di fattori di riparazione a queste lesioni.

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In seguito al danno al DNA, le cellule umane attivano percorsi di riparazione essenziali per ripristinare l'integrità del loro genoma. Qui, descriviamo il metodo dell'immunofluorescenza indiretta come mezzo per rilevare le proteine di riparazione del DNA, analizzare il loro reclutamento spaziale e temporale e contribuire a interrogare l'interazione proteina-proteina nei siti di danno al DNA.

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Due-e tridimensionale Live Cell Imaging di proteine ​​danno al DNA di risposta

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