Name: Tensione sensibile registrazione Dye da assoni, dendriti e spine dendritiche dei singoli neuroni in fettine di cervello (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-11-29T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 51 s
Description: Scopri la registrazione ottica del potenziale di membrana in singoli neuroni con risoluzione sub-micrometrica. Questa tecnica permette di monitorare l'integrazione dei segnali elettrici in assoni, dendriti e spine dendritiche.

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Siamo grati ai nostri collaboratori Knut Holthoff, Arthur Konnerth e Marco Canepari che hanno partecipato allo sviluppo iniziale di questa tecnica e per Leslie M. Loew per la gentile fornitura di coloranti. Supportato da NSF concedere IOS-0817969, sovvenzioni NIH NS068407 e M136043 e Kavli Istituto di Neuroscienze all&#39;Università di Yale.

1. Impostazione dell&#39;apparecchiatura Passo 1.1. Imaging di installazione La chiave per la registrazione dei segnali di tensione colorante sensibili è la progettazione di configurazione appropriato. Usiamo un microscopio in posizione verticale (BX51WI Olympus o AxioExaminer Zeiss) dotato di tre telecamere. L&#39;installazione è stata progettata per l&#39;illuminazione di singoli neuroni in fettine di cervello di luce di eccitazione in epi-fluorescenza, wide-field modalità microscopia utilizzando sia 60X/1.0 Nikon NA o Zeiss 63X/1.0 acqua NA obiettivi immersione. Nostri microscopi sono imbullonati a una tabella di isolamento di vibrazione e dotate motorizzati fasi mobili. Ogni microscopio è dotato di tre porte fotocamera. Una porta fotocamera è dotata di un elevato standard risoluzione spaziale camera CCD per DIC video-microscopia a raggi infrarossi (IR-1000, Dage MTI, USA). La porta ha una seconda fotocamera veloce acquisizione dei dati della telecamera (fino a 20 frame rate kHz) con relativamente bassa risoluzione spaziale (80 x 80 pixel), ma eccezionale gamma dinamica (14 bit) e eccezionalmente basso leggererumore (NeuroCCD-SM, RedShirtImaging LLC, Decatur, GA). La terza porta fotocamera ha una fotocamera CCD ad alta risoluzione spaziale (PixelFly, 1392x1024 pixel, PCO AG, Germania) montato su un disco rotante-scanner confocale (CSU-10, Yokogawa, Giappone) utilizzato per raccogliere z-stacks di immagini confocali per dettagliata ricostruzione morfologica della cellula colorata. Un diodo a frequenza doppia-pompato Nd: YVO4 laser ad onda continua (400 mW) che emette a 532 nm (MLL-III/400 mW; CNI, Changchun, Cina) è la sorgente di luce di eccitazione. Il diametro di 2 millimetri fascio laser gated da un otturatore (LS6; Associates Vincent) è diretta ad una guida di luce accoppiato al microscopio tramite una singola porta condensatore epifluorescenza (TILL Photonics GmbH, Gräfelfing, Germania) progettati per riempire completamente l&#39;apertura posteriore del obiettivo e fornire un&#39;illuminazione uniforme prossimità del piano oggetto. La luce laser viene utilizzato al posto di un convenzionale lampada Xenon ad arco per massimizzare la sensibilità del V m-imaging da: (1) usando un ex monocromaticaluce citazione all&#39;ala rossa dello spettro di assorbimento di massimizzare V m sensibilità del colorante 9, 10 e (2) aumentare l&#39;intensità della luce di eccitazione oltre il livello che può essere raggiunto da una lampada ad arco. La luce di eccitazione è riflessa alla preparazione da uno specchio dicroico con una lunghezza d&#39;onda centrale di 560 nm e la luce di fluorescenza registrata fatto passare attraverso un filtro barriera 610 nm (a Schott RG610). L&#39;effetto combinato di un aumento dell&#39;intensità della luce e l&#39;utilizzo di lunghezze d&#39;onda ottimali vicino eccitazione monocromatiche era un drammatico miglioramento della sensibilità di imaging tensione di un fattore di circa 50 rispetto alle misurazioni precedenti 6. Passo 1,2. Regolare per un&#39;illuminazione uniforme Utilizzare uno standard fluorescenza diapositiva (eccitazione verde / emissione rossa). Inserire opportuni filtri di densità neutri nel percorso del raggio laser in modo che il CCD non è saturo. Focalizzare l&#39;obiettivo sulla superficiela diapositiva. Regolare la posizione del lato di ricezione della guida di luce quarzo davanti all&#39;obiettivo lanciatore laser, e regolare la posizione della estremità di uscita della guida di luce collegato al microscopio mediante opportuni attuatori sulla epi-fluorescenza condensatore per ottenere centrato ed uniforme illuminazione del campo di vista. Passo 1.3. Determinare il rumore vibrazionale Inserire un segno piccola inchiostro nero sulla superficie del vetrino fluorescenza. Registrare l&#39;intensità della luce con NeuroCCD nella modalità di registrazione continua. Mettere a fuoco l&#39;obiettivo su un bordo scuro del marchio inchiostro nero. Registrare l&#39;intensità luminosa per circa 100 msec a 2 kHz di frequenza di fotogrammi. Visualizzare la media spaziale delle tracce frazionari intensità luminosa (Af / F) di ~ 20 pixel che ricevono luce dalla zona illuminata uniformemente e da circa 20 pixel lungo il bordo del marchio inchiostro. Il rumore in eccesso nelle registrazioni da pixel con bordi ad alto contrasto riflette il rumore vibrazionale inil sistema. Passo 1.4. Vibrazioni isolamento È obbligatorio per ridurre le vibrazioni utilizzando una tavola di isolamento vibrazioni ad un livello inferiore al rumore di sparo con intensità di luce paragonabili a condizioni di registrazione sperimentali. Regolare la tavola di isolamento delle vibrazioni finché il rumore di vibrazione in dell&#39;intensità luminosa da pixel che coprono il bordo tagliente dell&#39;immagine è trascurabile. Nessuna delle apparecchiature con parti mobili (persiane, ventilatori meccanici) può essere montato sulla tavola. I cavi dal materiale sulla tavola allegata ad altri componenti che non sono isolati dalle vibrazioni devono essere allentato in modo che non trasmettono vibrazioni meccaniche al microscopio. 2. Selezione di un Neuron Adeguato per V m-Imaging Passo 2.1. Selezione di neuroni Rendere fettine cerebrali secondo procedure standard. Utilizzare una linea di topi esprimono EGFP in singole cellule nervose di iINTERESSE. Con un sistema di rotazione del disco confocale, visualizzare i neuroni EGFP marcati nella sezione. Selezionare neuroni per V m-imaging con intatte dendritiche / assonale alberi, e con processi parallelo e vicino alla superficie della fetta. Ciò non può essere realizzato in topi selvatici perché assoni e dendriti sottili, per la maggior parte, non sono visibili in modalità microscopia DIC. 3. Neuroni di carico con tensione sensibile Dye Passo 3.1. Riempimento della pipetta di patch Riempire pipette di patch vetro dalla punta con colorante senza soluzione intracellulare applicando pressione negativa per circa 15 s fino a 2/3 del cono dell&#39;elettrodo. La soluzione colorante libero in punta è necessaria per evitare la fuoriuscita del colorante sulla fetta che aumenta la fluorescenza di fondo e riduce drasticamente rapporto segnale-rumore. Back-riempire l&#39;elettrodo con la soluzione contenente il colorante impermeant membrana sensibile tensione JPW3028 discioltoin soluzione intracellulare (0,8 mM). JPW3028, la sonda di tensione di maggior successo per l&#39;applicazione intracellulare, è un analogo doppiamente carica positiva del ANEP serie di coloranti lipofili stirilici ancora sufficientemente solubile in acqua da utilizzare per microiniezione. Il di-etil analogica di questo colorante è praticamente identiche caratteristiche (inclusa la tensione-sensibilità) ed è disponibile in commercio come JPW1114 (vedi Tabella 1). Prepariamo soluzione stock 20 mM in acqua distillata H 2 O. Aliquote di 50 microlitri della soluzione stock sono conservati congelati a -20 ° C. Per la concentrazione di colorante finale di 0,8 mM, 2 ml di soluzione madre viene sciolto in 50 ml di soluzione intracellulare nel giorno dell&#39;esperimento. La soluzione colorante magazzino è stabile e può essere conservato a temperatura ambiente per diversi mesi. Pertanto, manteniamo uno aliquota 50 microlitri a temperatura ambiente fino al suo esaurimento. Passo 3.2. Stabilire una giga-sigillo in fretta <p class = &quot;jove_content&quot;&gt; Patch un neurone selezionato in precedenza e consentire libera diffusione del colorante da una pipetta di patch somatica al soma in configurazione whole-cell per 20-45 min. È essenziale ottenere una tenuta più velocemente possibile in modo che la quantità di colorante libero in soluzione la punta può essere piccola. Inizia la pratica patch veloce senza il colorante nella elettrodo. Successivo, patch pratica e caricamento neuroni con il colorante con l&#39;obiettivo di utilizzare una quantità minima di colorante libero in soluzione punta senza contaminare il tessuto circostante. Con la pratica, è possibile creare una tenuta entro 1-2 min. Passo 3.3. Monitorare il livello di colorazione Durante la diffusione colorante nella configurazione whole-cell, monitorare lo stato fisiologico del neurone registrando potenziali d&#39;azione evocati in current-clamp mode. Inoltre, controllare la quantità di colorazione registrando l&#39;intensità della luce di riposo (RLI) dal soma cellulare a un frame rate di 2 k<html> Hz e ad una frazione di intensità luminosa piena regolata con filtri a densità neutra (usiamo 0,04% dell&#39;intensità della luce laser da un laser 400 mW). Continuare il processo di tintura carico fino al potenziale di azione inizia ad ampliare, di solito dopo 20-40 minuti, a seconda della dimensione e resistenza dell&#39;elettrodo. L&#39;ampliamento del picco è completamente reversibile e molto probabilmente a causa dell&#39;effetto di carico capacitivo della concentrazione del colorante saturi nella membrana somatica. La forma d&#39;onda del picco viene completamente ripristinata dopo la concentrazione di colorante è equilibrata tutto il neurone. Passo 3.4. Rimuovere l&#39;elettrodo colorante Alla fine del periodo di colorazione, tirare la pipetta cerotto dalla soma in configurazione voltage clamp garantire che la transizione da cellule intere di fuori-out configurazione patch viene raggiunto nel processo. Passo 3,5. Attendere per la diffusione colorante ent &quot;&gt; Incubare la fetta per un ulteriore 1,5-2 ore a temperatura ambiente per permettere la tensione colorante sensibile a diffondersi in processi neuronali. Dopo una notevole quantità di colorante diffonde dal soma in processi dendritiche e assonali, la forma d&#39;onda di l&#39;AP è completamente ristrutturato. 4. Registrazione ottica Passo 4.1. Selezionare un compartimento cellulare per l&#39;imaging Individuare la soma del neurone colorato con fluorescenza a basso livello di luce e ri-patch il neurone con uno standard (senza colorante) elettrodo patch nell&#39;ambiente DIC. Visualizza processi neuronali sotto il livello di scarsa luminosità a un frame rate di 10-40 Hz in modalità di registrazione continua del CCD per tensione-imaging. Ridurre il livello di luce con filtri a densità neutra al minimo richiesto per visualizzare l&#39;oggetto di interesse. Usiamo 0,01% dell&#39;intensità laser 400 mW durante il posizionamento del neurone macchiato. Utilizzando uno stadio XY, posizionare il processo neuronale di interesse in tegli centro l&#39;area di esposizione. Proteggere il soma dalla luce di eccitazione con il diaframma parzialmente chiuso fermata campo del microscopio. Proteggere il soma dalla luce di eccitazione ad alta intensità riduce in modo significativo i danni fotodinamica durante la registrazione. Passaggio 4.2 segnali Record ottiche relative ai transitori potenziale di membrana Registrare segnali ottici relativi a punti di accesso backpropagated nei singoli rami dendritici. Registrare segnali ottici relativi punti di accesso nel assone. Registrare segnali ottici legati alla backpropagating AP in spine dendritiche. Utilizzare frame rate adeguate per la ricostruzione accurata della forma d&#39;onda del segnale e mantenere i periodi di registrazione e l&#39;esposizione alla luce ad alta intensità di eccitazione più corti possibile per ridurre al minimo colorante sbianca e danni fotodinamica. Ad esempio, esaminando la sequenza di iniziazione e propagazione dei potenziali d&#39;azione unico nel assone richiede periodi di registrazione di 5-10 msec. L&#39;eccitazione luce intenty durante la registrazione è un compromesso tra il rapporto segnale-rumore, da un lato e il grado di tintura candeggio e danni fotodinamica dall&#39;altro. Usiamo 100% di intensità del laser 400 mW in registrazione da lunghi tratti di assoni quando un&#39;area di 300 micron di diametro è illuminato. Quando la luce di eccitazione è focalizzato ad una zona 30 micron di diametro per l&#39;imaging spina dendritica, usiamo 10-25% dell&#39;intensità della luce laser. La durata della registrazione è un fattore determinante l&#39;intensità ottimale luce di eccitazione; periodi di registrazione più brevi consentono intensità di luce più elevate. L&#39;intensità di illuminazione ottimale è meglio determinata empiricamente per ogni preparazione e le impostazioni di misurazione. 5. Analisi dei dati Passo 5.1. Correggere i dati grezzi per errori noti L&#39;analisi e la visualizzazione dei dati sono state effettuate utilizzando il programma NeuroPlex (RedShirtImaging) scritto in IDL (ITT Visual Information Solutioni, Boulder, Colorado) e personalizzati routine di Visual Basic. Nelle condizioni di scarsa luminosità, la fluorescenza di fondo diventa un fattore determinante della Af / F dimensioni del segnale. I dati grezzi sono stati corretti per questo effetto sottraendo la media intensità di fluorescenza di fondo determinato da una zona non colorato sulla fetta. Successivamente, il software di allineamento dei segnali è stato utilizzato per correggere jitter temporale in AP iniziazione e per eventuali piccoli movimenti della preparazione durante media. Nel dominio temporale, segnali di AP sono stati allineati da cross correlazione degli AP elettricamente registrato in ogni prova al segnale di riferimento acquisita all&#39;inizio della media (Figura 1B). Nel dominio spaziale, le immagini sono state allineate in due dimensioni offline per immagine cross-correlazione per compensare eventuali piccoli movimenti laterali della preparazione. La corretta messa a fuoco dell&#39;immagine nel z-dimensione è stato verificato prima di ogni prova individuale; smal<html> rettifiche l erano spesso necessario. I segnali spazialmente e temporalmente allineati stati mediati come mostrato in figura 1B. Lenti cambiamenti di intensità luminosa dovuta allo sbiancamento del colorante sono stati corretti dividendo i dati da un opportuno duplice funzione esponenziale derivata dagli studi di registrazione senza stimolazione (Figura 1B). La forma d&#39;onda del segnale di AP è stato ricostruito da un insieme di punti di dati utilizzando Cubic Spline interpolazione, una curva continua a tratti passante per ciascun punto di dati. Per confermare che la tensione di segnale sensibile colorante tracce potenziale di membrana senza distorsione significativa alla scala temporale millisecondo, il segnale elettrico dal soma AP è stato confrontato con il segnale ottico AP dal poggio assone adiacente come mostrato in figura 3B. I due segnali si sovrappongono molto da vicino, consentendo il rumore colpo ottico di registrazione. les/ftp_upload/4261/4261fig1.jpg &quot;/&gt; Figura 1. Analisi dei dati (Animazione). (A) Pannello superiore: immagine ad alta risoluzione confocale macchiato di un neurone con assone nella posizione di registrazione. Elettrodo di registrazione allegata alla soma ed extracellulare elettrodo stimolante accanto dendrite basale schematizzato. I potenziali d&#39;azione evocati da extracellulare, la stimolazione sinaptica. Pannello inferiore: immagine a bassa risoluzione spaziale di fluorescenza della assone ottenuta con CCD utilizzata per l&#39;imaging V m (B) registrazioni elettrodo da soma (tracce nere), registrazioni ottiche da AIS (tracce rosse) e dal nodo di Ranvier (tracce verdi). . Tracce Top: i dati grezzi da 9 studi che mostrano il jitter temporale in AP iniziazione. Seconda fila di tracce: allineato temporalmente segnali. Terza fila di tracce: segnale medio. Quarta fila di tracce: correzione candeggina. Tracce di fondo: interpolazione spline cubica con un passaggio di smoothing temporale.

<ol><li>Bischofberger, J., Engel, D., Li, L., Geiger, J. R., Jonas, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patch-clamp+recording+from+mossy+fiber+terminals+in+hippocampal+slices%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Patch-clamp recording from mossy fiber terminals in hippocampal slices.</a> Nature Protocols. 1, 2075-2081 (2006).</li>
<li>Cohen, L. B., Salzberg, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+measurement+of+membrane+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Rev.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Optical measurement of membrane potential.</a> Ann. Rev. Neurosci. 1, 171-182 (1978).</li>
<li>Cohen, L. B. Historical overview and general methods of membrane potential imaging. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCohen%2C+LB+%22Membrane+Potential+Imaging+in+the+Nervous+System%22">Membrane Potential Imaging in the Nervous System</a>. Canepari, M., Zecevic, D. , Springer Neuroscience. New York. (2010).</li>
<li>Canepari, M., Djurisic, M., Zecevic, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+signals+from+rat+hippocampal+CA1+pyramidal+neurons+during+coincident+pre-+and+post-synaptic+activity%3A+a+combined+voltage-+and+calcium+imaging+study%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Dendritic signals from rat hippocampal CA1 pyramidal neurons during coincident pre- and post-synaptic activity: a combined voltage- and calcium imaging study.</a> J. Physiol. 580, 463-484 (2007).</li>
<li>Canepari, M., Popovic, M., Vogt, K., Holthoff, K., Konnerth, A., Salzberg, B. M., Grinvald, A., Antic, S. D., Zecevic, D. Imaging submillisecond membrane potential changes from individual regions of single axons, dendrites and spines. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCanepari%2C+M+%22Membrane+Potential+Imaging+in+the+Nervous+System%22">Membrane Potential Imaging in the Nervous System</a>. Canepari, M., Zecevic, D. , Springer Neuroscience. New York. (2010).</li>
<li>Djurisic, M., Antic, S., Chen, W. R., Zecevic, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Voltage+imaging+from+dendrites+of+mitral+cells%3A+EPSP+attenuation+and+spike+trigger+zones%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Voltage imaging from dendrites of mitral cells: EPSP attenuation and spike trigger zones.</a> J. Neurosci. 24, 6703-6714 (2004).</li>
<li>Holthoff, K., Zecevic, D., Konnerth, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+time-course+of+action+potentials+in+spines+and+remote+dendrites+of+mouse+visual+cortical+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Rapid time-course of action potentials in spines and remote dendrites of mouse visual cortical neurons.</a> J. Physiol. 588, 1085-1096 (2010).</li>
<li>Kole, M. H. P., Letzkus, J. J., Stuart, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axon+initial+segment+Kv1+channels+control+axonal+action+potential+waveform+and+synaptic+efficacy%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Axon initial segment Kv1 channels control axonal action potential waveform and synaptic efficacy.</a> Neuron. 55, 633-647 (2007).</li>
<li>Kuhn, B., Fromherz, P., Denk, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+sensitivity+of+Stark-shift+voltage-sensing+dyes+by+one-+or+two-photon+excitation+near+the+red+spectral+edge%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+J%22%5BJournal%5D)">High sensitivity of Stark-shift voltage-sensing dyes by one- or two-photon excitation near the red spectral edge.</a> Biophysical J. 87, 631-639 (2004).</li>
<li>Loew, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+and+characterization+of+electrochromic+membrane+probes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biochem.+Biophys.+Method%22%5BJournal%5D)">Design and characterization of electrochromic membrane probes.</a> J. Biochem. Biophys. Method. 6, 243-260 (1982).</li>
<li>Loew, L. Design and use of organic voltage sensitive dyes. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLoew%2C+L+%22Membrane+Potential+Imaging+in+the+Nervous+System%22">Membrane Potential Imaging in the Nervous System</a>. Canepari, M., Zecevic, D. , Springer Neuroscience. New York. (2010).</li>
<li>Palmer, L. M., Stuart, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Site+of+action+potential+initiation+in+layer+5+pyramidal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Site of action potential initiation in layer 5 pyramidal neurons.</a> J. Neurosci. 26, 1854-1863 (2006).</li>
<li>Popovic, M. A., Foust, A. J., McCormick, D. A., Zecevic, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+spatio-temporal+characteristics+of+action+potential+initiation+in+layer+5+pyramidal+neurons%3A+a+voltage+imaging+study%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">The spatio-temporal characteristics of action potential initiation in layer 5 pyramidal neurons: a voltage imaging study.</a> J. Physiol. 589, 4167-4187 (2011).</li>
<li>Ross, W. N., Salzberg, B. M., Cohen, L. B., Grinvald, A., Davila, H. V., Waggoner, A. S., Wang, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+in+absorption%2C+fluorescence%2C+dichroism%2C+and+birefringence+in+stained+giant+axons%3A+optical+measurement+of+membrane+potential%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Membr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Changes in absorption, fluorescence, dichroism, and birefringence in stained giant axons: optical measurement of membrane potential.</a> J. Membr. Biol. 33, 141-183 (1977).</li>
<li>Shu, Y., Duque, A., Yu, Y., Haider, B., McCormick, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Properties+of+action+potential+initiation+in+neocortical+pyramidal+cells%3A+evidence+from+whole+cell+axon+recordings%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Properties of action potential initiation in neocortical pyramidal cells: evidence from whole cell axon recordings.</a> J Neurophysiol. 97, 746-760 (2007).</li>
<li>Wu, J. -Y., Cohen, L. B. Fast multisite optical measurement of membrane potential. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWu%2C+J-Y+%22A+practical+guide+to+technology+for+quantitative+real-time+analysis%22">A practical guide to technology for quantitative real-time analysis</a>. Mason, W. T. , Academic. New York. 389-404 (1993).</li>
<li>Yuste, R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aYuste%2C+R+%22Dendritic+Spines%22">Dendritic Spines</a>. , MIT Press. (2010).</li>
</ol>

Dejan Zecevic dichiara che si tratta di un co-proprietario della RedShirtImaging LLC., Una società specializzata in alta velocità, a basso rumore telecamere CCD utilizzati in voltaggio-dipendenti registrazione colorante. Tutti gli altri autori non riportano interessi finanziari o potenziali conflitti di interesse legati allo studio corrente.

Questo articolo descrive un voltaggio-dipendenti metodo di registrazione colorante per monitorare l&#39;attività elettrica dei neuroni individuali con sub-micrometrica e sub-millisecondo risoluzione spazio-temporale. Eccitazione laser a lunghezza d&#39;onda quasi ottimale (considerando le dimensioni segnale) migliorato la sensibilità di registrazione di un fattore ~ ​​50 rispetto agli approcci precedenti. La sensibilità attuale consente il monitoraggio dei segnali elettrici da tutte le parti di neuroni individuali, tra ...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome del componente </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td><td> Commenti (opzionale) </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Installazione componenti </td></tr><tr><td> Microscopio verticale </td><td> Olympus Inc. </td><td> BX51WI </td><td> Con tre porte della fotocamera </td></tr><tr><td> Motorizzato mobile stage </td><td> Siskiyou </td><td> MXOPi.2 </td><td></td></tr><tr><td> Epi-fluorescenza condensatore per Olympus BX51 </td><td> TILL Photonics </td><td> 0000-560-11659 </td><td></td></tr><tr><td> Microscopio verticale </td><td> Carl Zeiss, LLC </td><td> AxioExaminer D1 </td><td> Con tre porte della fotocamera </td></tr><tr><td> Motorizzato piastra superiore </td><td> Scientifica limitata </td><td> MMBP </td><td></td> &lt;/ Tr&gt; <tr><td> Epi-fluorescenza a condensatore per Zeiss AxioExaminer </td><td> TILL Photonics </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Acquisizione Dati Camera </td><td> RedShirtImaging LLC </td><td> NeuroCCD-SM </td><td> Ad alta velocità, a basso rumore di lettura </td></tr><tr><td> CCD per IR-DIC </td><td> Dage-MTI </td><td> IR-1000 </td><td></td></tr><tr><td> Spinning-Disc scanner confocale </td><td> Yokogawa </td><td> CSU-10 </td><td></td></tr><tr><td> CCD ad alta risoluzione spaziale nello scanner confocale </td><td> PCO AG </td><td> PixelFly </td><td> 1392x1024 pixel </td></tr><tr><td> DPSS laser CW (532 Nm) </td><td> CNI Optoelettronica Tech. Co., Ltd </td><td> MLL-III-532 400mW </td><td> Eccitazione sorgente di luce </td></tr><tr><td> Fibra multi-mode Launcher </td><td> Siskiyou </td><td> SM-CFT </td><td></td></tr><tr><td> Light Guide </td><td> FINO Fotonic </td><td> 0000-515-11524 </td><td></td></tr><tr><td> Otturatore </td><td> Vincent Associates </td><td> LS6 </td><td></td></tr><tr><td> Vibrazioni isolamento Tabella </td><td> Minus k Tecnologia </td><td> MK26 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Reagenti specifici </td></tr><tr><td> Di-2-ANEPEQ (JPW 1114) </td><td> Life Technologies </td><td> D-6923 </td><td> Tensione colorante sensibile </td></tr><tr><td> Crym-EGFP mouse Linea </td><td> GENSAT (MMRRC) </td><td> STOCK Tg (Crym-EGFP) GF82Gsat/Mmcd </td><td> Scarsamente esprimere EGFP nel livello 5 neuroni corticali </td></tr></tbody></table>

tensione sensibile registrazione dye da assoni, dendriti e spine dendritiche dei singoli neuroni in fettine di cervello

Voltage-sensitive Dye Recording from Axons, Dendrites and Dendritic Spines of Individual Neurons in Brain Slices

Comprendere le proprietà biofisiche e l&#39;organizzazione funzionale dei neuroni singoli e come informazioni di processo è fondamentale per capire come funziona il cervello. La funzione primaria di qualsiasi cellula nervosa è di elaborare i segnali elettrici, solitamente da più fonti. Proprietà elettriche dei processi neuronali sono straordinariamente complessa, dinamica, e, nel caso generale, impossibile prevedere in assenza di misurazioni dettagliate. Per ottenere tale misurazione si sarebbe, idealmente, come essere in grado di monitorare, in più siti, eventi sottosoglia mentre viaggiano dai siti di origine sui processi neuronali e sommare in posizioni particolari di influenzare iniziazione potenziale d&#39;azione. Questo obiettivo non è stato raggiunto in un neurone a causa di limitazioni tecniche di misurazioni che utilizzano elettrodi. Per superare questo inconveniente, è altamente desiderabile per integrare la patch-elettrodo approccio con tecniche di imaging che permettono ampia Recordin parallelogs da tutte le parti di un neurone. Qui, descriviamo una tecnica - ottico di registrazione dei transitori potenziale di membrana con organici tensione coloranti sensibili (V m-imaging) - caratterizzati da sub-millisecondo e sub-micrometrica risoluzione. Il nostro metodo si basa sul lavoro pionieristico di sonde molecolari tensione-sensibili 2. Molti aspetti della tecnologia iniziale sono stati continuamente migliorati per decenni 3, 5, 11. Inoltre, lavoro precedente documentato due caratteristiche essenziali di V m-imaging. In primo luogo, i segnali di fluorescenza sono linearmente proporzionale al potenziale di membrana su tutta la gamma fisiologica (-100 mV a +100 mV, 10, 14, 16). In secondo luogo, i neuroni di carico con la tensione di colorante sensibile usato qui (JPW 3028) non ha effetti farmacologici rilevabili. L&#39;ampliamento del picco registrato durante il caricamento del colorante è completamente reversibile 4, 7. Inoltre, prove sperimentali mostrano che è possibile ottenereun numero significativo (fino a centinaia) di registrazioni prima di eventuali effetti rilevabili fototossiche 4, 6, 12, 13. Attualmente, sfruttare la luminosità eccezionale e stabilità di una sorgente di luce laser a lunghezza d&#39;onda quasi ottimale per massimizzare la sensibilità della m-imaging tecnica V. La sensibilità attuale consente registrazioni di più siti di ottica di V transitori m da tutte le parti di un neurone, tra assoni e assoni collaterali, rami terminali dendritiche, e spine dendritiche individuali. Le informazioni acquisite sulle interazioni di segnale possono essere analizzati quantitativamente e direttamente visualizzati sotto forma di un film.

Successo microscopia confocale dovrebbe consentire una chiara identificazione dei processi neuronali intatti che sono vicino alla superficie della fetta e situato in un piano di messa a fuoco. La selezione delle cellule nervose che sono appropriate per l&#39;imaging di tensione prima della voltaggio-dipendenti carico colorante è fondamentale. Un esempio di immagini confocali di L5 neuroni piramidali esprimono EGFP in una fetta corticale (Crym transgenico linea mouse) è mostrato in Figura 2. Gli assoni d...

Una tecnica di imaging per il monitoraggio dei cambiamenti potenziale di membrana con una risoluzione spaziale sub-micrometrica e sub-millisecondo temporale è descritta. La tecnica, sulla base di eccitazione del laser di tensione-sensibili coloranti, consente misure di segnali in assoni e assoni collaterali, rami terminali dendritiche, e singoli spine dendritiche.

Tensione sensibile registrazione Dye da assoni, dendriti e spine dendritiche dei singoli neuroni in fettine di cervello

Comprendere le proprietà biofisiche e l'organizzazione funzionale dei singoli neuroni e il modo in cui elaborano le informazioni è fondamentale per comprendere ...

L'obiettivo generale degli esperimenti descritti è il monitoraggio dell'integrazione del segnale del potenziale di membrana e dell'elaborazione delle informazioni da parte di una singola cellula nervosa, in modo ottico, con risoluzione submicrometrica e submillisecondi, in diversi punti di un neurone. Questo risultato si ottiene innanzitutto costruendo un sistema di imaging con sensibilità adeguata per consentire la registrazione di piccole variazioni percentuali dell'intensità luminosa corrispondenti al transitorio del potenziale di membrana. Successivamente, si selezionano i neuroni con un'adeguata anatomia per un efficace imaging, dotati di prolungamenti lunghi e integri in un singolo piano focale vicino alla superficie della sezione.Quindi caricare i neuroni preselezionati con coloranti sensibili al voltaggio per consentire il tracciamento ottico delle variazioni del potenziale di membrana. I risultati mostrano la capacità unica di questo approccio di ottenere informazioni sull'integrazione del segnale elettrico da parte di singole cellule nervose monitorando i segnali del potenziale di membrana provenienti da assoni, dendriti e spine dendritiche. In neurofisiologia cellulare.S

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Questa relazione dimostra una tecnica per isolamento meccanico di singoli neuroni vitali mantenendo attaccato boutons presinaptica. Vibrodissociated neuroni hanno il vantaggio di una produzione rapida, eccellente controllo farmacologico e migliorato lo spazio-clamp senza influenza dalle cellule vicine. Questo metodo può essere utilizzato per l'imaging di elementi sinaptica e di patch-clamp registrazione.

Vibrodissociation di neuroni da fettine di cervello di roditore studio di trasmissione sinaptica e Immagine terminali presinaptici

Questo video mostra una tecnica per la registrazione patch-clamp dalla superficie della membrana dendritica. Questo aiuta a esaminare direttamente le proprietà elettriche dei dendriti e dei canali ionici voltaggio-dipendenti sottostanti nei neuroni dopaminergici.

Registrazioni Patch-Clamp dal dendrite di un neurone dopaminergico in una fetta di cervello

Questo video mostra una procedura per osservare i cambiamenti nell'attività neuronale in una fetta di cervello colorata con un colorante sensibile al voltaggio. Il colorante riflette i cambiamenti nel potenziale di membrana del neurone alterandone l'intensità della fluorescenza. Attraverso l'applicazione di stimoli elettrici e tecniche di imaging avanzate, questo processo consente il tracciamento visivo dei cambiamenti in tempo reale nel potenziale della membrana neuronale in base alla...

Registrazione ottica dell'attività neuronale in fette di cervello colorate con un colorante sensibile alla tensione

Questo video delinea un metodo per l'imaging e la registrazione simultanea dell'attività elettrica da fette di cervello transgenico che contengono proteine fluorescenti specifiche per i neuroni. La procedura prevede il mantenimento della fetta di cervello in una camera di perfusione con liquido cerebrospinale artificiale aerato, l'utilizzo di una sorgente luminosa per eccitare le cellule marcate con fluorescenza e la registrazione dei segnali elettrici con una sonda multicanale e un patch clamp.

Monitoraggio ottico ed elettrofisiologico simultaneo delle cellule neuronali in fette di cervello

Questo video dimostra la procedura per studiare l'efficienza sinaptica nella corteccia entorinale laterale (LEC) stimolando optogeneticamente gli assoni della corteccia prefrontale mediale (mPFC) e registrando le risposte dei neuroni piramidali nella LEC. Questo metodo combina le registrazioni patch-clamp con l'attivazione sinaptica mediante stimolazione luminosa per studiare la plasticità sinaptica.

Stimolazione optogenetica e registrazione elettrofisiologica di eventi sinaptici in fette di cervello di ratto

In questo articolo, si descrive un metodo utile per lo studio ligando funzione di canale ionico in neuroni di fettine di cervello acuto isolato. Questo metodo comporta l'uso di un farmaco-riempita micropipetta per applicazione locale di farmaci per neuroni registrati utilizzando tecniche standard di patch clamp.

Applicazione locale di farmaci allo studio delle funzioni recettore nicotinico in fettine di cervello del mouse

Qui, viene presentata una procedura per attivare selettivamente una proteina neuronale con un breve impulso di luce codificando geneticamente un amminoacido innaturale foto-reattivo in una proteina neuronale bersaglio espressa in neuroni in coltura o in vivo.

Controllo ottico di una proteina neuronale Utilizzando un acido Innaturale Amino geneticamente codificata in neuroni

Presentiamo un metodo che unisce le registrazioni della intero-cellula patch-clamp e due-fotone imaging per registrare transitori di Ca2 + nei dendriti neuronali nelle fette del cervello acuto.

Imaging del due-fotone calcio nei dendriti neuronali nelle fette del cervello

Qui, descriviamo i passi essenziali per le registrazioni di cellule intere patch-clamp fatta da neuroni di sostanza gelatinosa (SG) nella fetta di midollo spinale in vitro . Questo metodo consente la proprietà intrinseca della membrana, la trasmissione sinaptica e la caratterizzazione morfologica dei neuroni di SG per essere studiato.

Preparazione delle fette Acute del midollo spinale per la registrazione di cellule intere Patch-clamp in neuroni di sostanza Gelatinosa

Introduciamo un metodo di registrazione ottica riproducibile e stabile per le fette cerebrali usando coloranti sensibili alla tensione. L'articolo descrive la colorazione sensibile alla tensione e la registrazione di segnali ottici utilizzando preparazioni convenzionali di fette ippocampali.

Registrazione ottica a singolo fotone a campo largo nelle sezioni cerebrali utilizzando Colorazione sensibile alla tensione

Le fette di cervello ex vivo possono essere utilizzate per studiare gli effetti degli anestetici volatili sulle risposte evocate agli input afferenti. L'optogenetica è impiegata per attivare indipendentemente afferenze talamocorticali e corticocorticali alla neocorteccia non primaria, e le risposte sinaptiche e di rete sono modulate con isoflurano.

Attivazione optogenetica delle vie afferenti nelle fette cerebrali e modulazione delle risposte mediante anestetici volatili

Scopri la registrazione ottica del potenziale di membrana in singoli neuroni con risoluzione sub-micrometrica. Questa tecnica permette di monitorare l'integrazione dei segnali elettrici in assoni, dendriti e spine dendritiche.

Tensione sensibile registrazione Dye da assoni, dendriti e spine dendritiche dei singoli neuroni in fettine di cervello

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