Tensione sensibile registrazione Dye da assoni, dendriti e spine dendritiche dei singoli neuroni in fettine di cervello

L'obiettivo generale degli esperimenti descritti è il monitoraggio dell'integrazione del segnale del potenziale di membrana e dell'elaborazione delle informazioni da parte di una singola cellula nervosa otticamente con risoluzione submicrometrica e inferiore al millisecondo da più siti su un neurone. Ciò si ottiene costruendo prima una configurazione di imaging con sensibilità appropriata per consentire la registrazione di piccole variazioni frazionarie dell'intensità della luce corrispondente al transitorio del potenziale di membrana. Successivamente, selezionare i neuroni con un'anatomia appropriata per un imaging efficace neuroni con processi lunghi intatti in un unico piano focale vicino alla superficie della fetta.

Quindi caricare i neuroni preselezionati con coloranti sensibili alla tensione per consentire il tracciamento ottico delle variazioni di potenziale di membrana. I risultati mostrano la capacità unica di questo approccio di ottenere informazioni sull'integrazione del segnale elettrico da parte delle singole cellule nervose monitorando i segnali del potenziale di membrana da assoni, dendriti e spine dendritiche. In neurofisiologia cellulare.

Nuovi strumenti sono in fase di sviluppo a causa delle due limitazioni di lunga data dell'elettrofisiologia convenzionale, la bassa risoluzione spaziale delle misurazioni degli elettrodi e l'incapacità di registrare da piccole strutture come i collaterali assonici o le spine dendritiche. Per superare questi inconvenienti, l'approccio dell'elettrodo patch può essere combinato con tecniche ottiche che consentono registrazioni parallele da tutte le parti di un neuro. Qui descriviamo tale tecnica, la registrazione ottica su più lati di transitori di potenziale di membrana con risoluzione a colonna vertebrale singola.

In questo esperimento, vengono utilizzati un microscopio verticale e tre telecamere per regolare l'illuminazione uniforme. Innanzitutto, inserire un filtro a densità neutra appropriato nel percorso del raggio laser. Quindi, focalizzare l'obiettivo sulla superficie del vetrino fluorescente standard.

Durante l'osservazione dell'immagine CCD del campo visivo sullo schermo del monitor, regolare la posizione dell'estremità ricevente della guida di luce al quarzo e la posizione dell'estremità di uscita della guida di luce utilizzando attuatori appropriati sul condensatore a epifluorescenza per ottenere un'illuminazione centrata e uniforme del campo visivo. Per determinare il rumore vibrazionale, utilizzare un vetrino fluorescente standard con un segno non fluorescente sulla superficie. Registra l'intensità della luce con il neuro CCD in modalità continua.

Focalizzare l'obiettivo su un bordo scuro del segno nero e registrare l'intensità della luce per circa 100 millisecondi a un frame rate di due kilohertz. Quindi visualizza la media spaziale delle tracce di intensità della luce frazionaria da circa 20 pixel che ricevono luce dall'area illuminata uniformemente e da circa 20 pixel lungo il bordo del segno nero. L'eccesso di rumore nella media spaziale proveniente dai pixel con bordi ad alto contrasto riflette il rumore vibrazionale nel sistema.

È essenziale che l'otturatore meccanico sia montato fuori dal tavolo di isolamento dalle vibrazioni in modo che l'apertura dell'otturatore non introduca rumore vibrazionale nella registrazione ottica. Questo è un passaggio fondamentale. Montare l'otturatore utilizzando viti in plastica e materiale di isolamento dalle vibrazioni per ridurre il rumore vibrazionale acustico che può essere rilevato dal sistema di registrazione ottica.

Per isolare le vibrazioni, regolare la tabella di isolamento dalle vibrazioni fino a quando il rumore di vibrazione dei pixel che coprono il bordo nitido dell'immagine è inferiore al rumore di scatto. I cavi dell'apparecchiatura sul tavolo devono essere allentati per evitare di trasmettere le vibrazioni meccaniche al cannocchiale del microscopio. In questa procedura, preparare le fette di cervello di 300-400 micron di spessore secondo le procedure standard con una linea di topo che esprime EGFP nelle singole cellule nervose di interesse con un sistema confocale a disco rotante.

Visualizza i neuroni marcati con EGFP nella fetta. Successivamente, selezionare i neuroni con alberi assonali dendritici intatti e con processi che corrono paralleli e vicino alla superficie della fetta per l'imaging del potenziale di membrana. Quindi riempire una pipetta di vetro a cerotto dalla punta con una soluzione intracellulare priva di coloranti fino a due terzi della conicità dell'elettrodo applicando una pressione negativa per circa 15 secondi.

Successivamente, riempire l'elettrodo con la soluzione contenente il colorante sensibile alla tensione del permeato IMP della membrana disciolto nella soluzione intracellulare. Ora, applicare il patch a un neurone precedentemente selezionato entro un minuto dal caricamento del colorante nell'elettrodo. Applicare una bassa pressione positiva di circa 10 millimetri di mercurio prima che la pipetta venga calata nel bagno e, posizionando l'elettrodo nella fetta, si assicura che non fuoriesca colorante dall'elettrodo prima che venga stabilita la tenuta.

Aumentare ad alta pressione circa 100 millimetri di mercurio appena prima che l'elettrodo tocchi la superficie della cella. Stabilendo la tenuta nell'intera configurazione cellulare, consentire la libera diffusione del colorante da una pipetta somatica al soma per 20-45 minuti. Durante la diffusione colorata, monitorare lo stato fisiologico del neurone registrando i potenziali d'azione evocati in modalità current clamp.

Inoltre, monitorare la quantità di colorazione registrando l'intensità della luce a riposo dal soma cellulare a una frequenza di fotogrammi di due kilohertz e a una frazione dell'intensità luminosa completa regolata con filtri a densità neutra. Continuare il processo di download fino a quando il potenziale d'azione inizia ad ampliarsi. Al termine della colorazione, estrarre con cautela la pipetta per patch dal soma in configurazione voltage clamp per garantire che nel processo si raggiunga la transizione dalla configurazione del patch a quella esterna della cellula.

S quindi incubare la fetta per altre 1,5-2 ore a temperatura ambiente per consentire al colorante sensibile alla tensione di diffondersi nei processi neuronali. Dopo che una quantità significativa di colorante si è diffusa dal soma nei processi dendritici e assonali, la forma d'onda del potenziale d'azione dovrebbe essere completamente ripristinata. Nella fase successiva, individuare il soma del neurone della macchia sotto la fluorescenza a bassa intensità.

Ridurre l'intensità della luce con filtri a densità neutra al minimo necessario per visualizzare l'oggetto di interesse utilizzando uno stadio XY Scansionare l'area della fetta contenente il neurone fluorescente fino a identificare il soma fluorescente. Posizionare il soma della cellula colorata al centro del microscopio e attaccare il neurone con un elettrodo patch standard senza colorante sotto il DIC. Quindi visualizza i processi neuronali sotto la fluorescenza a bassa intensità a un frame rate da 10 a 40 hertz nella modalità di registrazione continua del CCD per l'imaging della tensione.

Utilizzando una posizione scenica XY, il processo neuronale di interesse al centro dell'area di imaging. Inoltre, proteggere il SOMA dalla luce di eccitazione utilizzando l'iride di arresto del campo parzialmente chiusa del microscopio per ridurre il danno fotodinamico. Successivamente, registrare i segnali ottici relativi ai potenziali d'azione di propagazione posteriore nei singoli rami dendritici.

Quindi registrare i segnali ottici relativi ai potenziali d'azione nell'assone. Successivamente, registrare i segnali ottici relativi ai potenziali d'azione di propagazione posteriore nelle spine dendritiche. Utilizzare la frequenza dei fotogrammi appropriata per una ricostruzione accurata della forma d'onda del segnale.

Allo stesso tempo, mantenere i periodi di registrazione e l'esposizione alla luce di eccitazione ad alta intensità il più brevi possibile per ridurre al minimo lo sbiancamento del colorante e i danni fotodinamici. Qui viene mostrata la registrazione dei segnali ottici. Qui. Il pannello superiore mostra l'immagine confocale ad alta risoluzione di un neurone colorato con il suo assone nella posizione di registrazione.

Mentre il pannello centrale mostra l'immagine a fluorescenza a bassa risoluzione spaziale dell'assone ottenuta dal CCD utilizzato per l'imaging del potenziale di membrana, il pannello inferiore presenta le registrazioni degli elettrodi dal soma e le registrazioni ottiche dall'A IS e dal nodo di rvi. Vengono visualizzati i dati grezzi e i segnali elaborati. Questa figura mostra i segnali del potenziale d'azione provenienti dall'assone di un neurone corticale L cinque caricato con l'azione del colorante sensibile alla tensione.

I potenziali segnali correlati sono stati registrati a un frame rate di 10 kilohertz. Queste tracce indicano il potenziale d'azione transitorio da tre posizioni. Uno, la registrazione dell'elettrodo dal soma.

Due, le registrazioni ottiche dalla collinetta dell'assone, e tre, la registrazione ottica dalla prima nota di vie, e qui ci sono i segnali sovrapposti dalle stesse tre posizioni. Questa figura mostra una raffica di quattro segnali di potenziale d'azione che si propagano all'indietro da più posizioni sull'albero dendritico di un neurone corticale L cinque avviato da brevi impulsi di corrente depolarizzante a 100 hertz. Qui sono mostrati i segnali del potenziale d'azione provenienti da una singola spina dendritica.

Ecco la ricostruzione anatomica ottenuta da una pila di immagini confocali a disco rotante, ed ecco l'immagine a fluorescenza della stessa regione ottenuta con la camera CCD. Per l'imaging del potenziale di membrana, le tracce di intensità della fluorescenza corrispondenti all'azione di retropropagazione I potenziali dalle posizioni uno a tre, come indicato nell'immagine CCD, sono mostrati nel pannello di destra. La traccia inferiore indica la registrazione dell'elettrodo dal soma.

La preparazione della preregistrazione richiede circa tre ore, compreso il periodo di attesa per la diffusione dei dadi ai processi distali. Il tempo di registrazione è limitato dal normale rundown del preparato e dal danno fotodinamico PO. L'entità del danno fotodinamico è proporzionale all'intensità della luce di eccitazione, alla durata e al numero di prove di registrazione individuali.

In alcuni esperimenti, è possibile effettuare più di 50 prove di registrazione nell'arco di una o due ore. Altre misurazioni richiedono un'elevata eccitazione, intensità luminose e registrazioni più lunghe, e sono limitate dal danno fotodinamico a solo diverse prove di registrazione. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come eseguire l'imaging del voltaggio dall'intera struttura assonale e terminale dei singoli neuroni nelle fette di cervello.