Esplorare arteriosa Muscolo liscio KV7 Funzione canale del potassio con morsetto Elettrofisiologia Patch e Myography pressione

L'obiettivo generale di questa procedura è misurare l'attività dei canali del potassio KV sette in cellule muscolari lisce dell'arteria mesenterica dissociate di fresco e correlare tali dati con le misurazioni del diametro arterioso registrate in condizioni fisiologiche. Questo viene realizzato innanzitutto rimuovendo chirurgicamente l'arcata vascolare mesenterica da un ratto. Il secondo passaggio consiste nel dissezionare e pulire i segmenti delle arterie mesenteriche.

In seguito, alcuni segmenti vengono utilizzati per isolare singole cellule muscolari lisce al fine di effettuare misurazioni elettrofisiologiche con la tecnica del patch clamp sulle correnti di potassio KV sette. L'ultimo passaggio consiste nella cannullazione di segmenti arteriosi integri per eseguire misurazioni miografiche sotto pressione della costrizione o dilatazione arteriosa in risposta a modulatori farmacologici dei canali del potassio KV sette. In definitiva, la combinazione di elettrofisiologia con la tecnica del patch clamp e della miografia sotto pressione viene utilizzata per dimostrare come un aumento o una diminuzione dell'attività dei canali del potassio KV sette influisca sulla costrizione delle arterie mesenteriche.

Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come l'uso di canali clonati espressi in linee cellulari, è che le correnti vengono registrate da cellule non coltivate che esprimono naturalmente i canali, e le correnti KV possono essere isolate da altre classi di canali del potassio che potrebbero essere attivati nelle stesse cellule. La micromiografia a pressione permette di registrare le risposte funzionali dallo stesso tessuto da cui sono derivate le cellule isolate, e il metodo è sia più sensibile sia più fisiologico rispetto ad altre preparazioni, come anelli o strisce arteriosi. La dottoressa Bareth Mani, ricercatrice postdottorato del mio laboratorio, dimostrerà le tecniche di cannullazione arteriosa e di micromiografia a pressione, mentre la dottoressa Luba Brueggeman, professore associato di ricerca nel mio laboratorio, illustrerà le procedure di isolamento cellulare e di patch plan.

Per iniziare questa procedura, utilizzare un paio di forbici chirurgiche per tagliare un segmento lungo da 10 a 12 centimetri a entrambe le estremità dell'intestino tenue di un ratto. Successivamente, isolare l'intestino insieme alla vascolarizzazione ad esso associata. Quindi, fissare il segmento di intestino tenue.

Stendere il mesentere sul lato vicino della camera in modo che il ramo principale dell'arteria mesenterica superiore sia al centro e i rami successivi si irradiano dal centro. Quindi posizionare i perni solo sui segmenti intestinali, utilizzando un microscopio stereoscopico illuminato per la visualizzazione. Rimuovere con cura il tessuto adiposo e il tessuto connettivo circostante le arterie del secondo al quarto ordine in prossimità degli intestini, utilizzando pinzette e forbici microchirurgiche.

Tenere ferme le vene adiacenti per facilitare la rimozione del tessuto adiposo e del tessuto connettivo ed evitare un'eccessiva trazione delle arterie. Trasferire ora due o tre segmenti dell'arteria mesenterica in una piastra per colture cellulari da 35 millimetri contenente due millilitri di soluzione di isolamento fredda. Dopo aver posizionato la piastra sul ghiaccio, tagliare i segmenti dell'arteria mesenterica in pezzi lunghi da tre a quattro millimetri utilizzando una pipetta PE con punta levigata a fiamma.

Trasferire i segmenti arteriosi in un vial di vetro contenente due millilitri di soluzione di isolamento preriscaldata a 37 gradi Celsius. Quindi incubare per 30 minuti a 37 gradi Celsius. Dopo 30 minuti, aspirare con attenzione la soluzione di isolamento a 37 gradi Celsius mediante una pipetta posteriore.

Aggiungere due millilitri di soluzione enzimatica tiepida, quindi incubare per 35 minuti a 37 gradi Celsius. Immediatamente dopo l'incubazione di 35 minuti nella soluzione enzimatica, porre la provetta sul ghiaccio, aspirare la soluzione enzimatica e aggiungere due millilitri di soluzione di isolamento fredda. Ripetere questa procedura quattro volte.

Quindi, in un millilitro di soluzione di isolamento ghiacciata, ripetere delicatamente per 10-20 volte il passaggio dei segmenti arteriosi con la pipetta posteriore levigata, al fine di isolare cellule singole del muscolo liscio dell'arteria mesenterica. Verificare periodicamente l'aspetto dei miociti posizionando una goccia della sospensione cellulare in una piastra da 35 millimetri e osservandola al microscopio.

I MLC sani dovrebbero avere un aspetto liscio ed allungato. Successivamente, trasferire circa da 100 a 200 microlitri di sospensione cellulare nella camera di registrazione utilizzando una pipetta Pasteur lucidata e lasciare aderire le cellule per 15 minuti. In questo passaggio, riempire la punta della pipetta per il patch con soluzione interna libera da anfotericina B, immergendo la punta della pipetta nella soluzione.

Quindi applicare aspirazione all'estremità opposta utilizzando una siringa da 10 millilitri collegata tramite un pezzo di tubo, aggiungendo la soluzione per pipetta contenente la terina B dalla parte superiore. Utilizzare una punta per pipetta micro loader einor fino a quando la pipetta non sarà riempita per circa metà con la soluzione. Rimuovere eventuali bolle d'aria picchiettando delicatamente sulla pipetta.

In seguito, inserire la pipetta nel porta-elettrodo. Utilizzare un micromanipolatore per abbassare la pipetta fino alla superficie di un miocita allungato. Quando la resistenza della pipetta aumenta a sei-dieci megaohm, applicare un'aspirazione per ottenere un sigillo giga.

Nello stesso momento, impostare la tensione di mantenimento a zero millivolt in attesa della perforazione della membrana. Successivamente, applicare passi di tensione di 100 millisecondi a più 10 millivolt e poi a meno 10 millivolt. Utilizzare l'amplificatore per compensare il transitorio di capacità della pipetta rapido contemporaneo all'insorgenza della capacità della cellula intera.

Correnti positive transitorie, piccole e sostenute, da due a 10 picoampere, pure e di ampiezza, indicano la presenza di canali KV7 funzionali. La perforazione riuscita con anfotericina B ridurrà la resistenza di accesso a 35 megaohm o meno. Per registrare la relazione corrente-tensione dei canali KV7, applicare passi di tensione della durata di cinque secondi a valori compresi tra -84 millivolt, condizione in cui la probabilità di apertura dei canali KV7 è minima, e +16 millivolt, condizione in cui la probabilità di apertura dei canali KV7 raggiunge un plateau. Dopo cinque secondi a ciascuna tensione di prova, tornare alla tensione di mantenimento di -4 millivolt per 10 secondi.

In questo procedimento, posizionare in modo allentato due suture fini in nylon già pronte su ciascun lato. Accanto alla cannula di vetro, trasferire con attenzione il segmento di arteria mesenterica dissezionato dalla camera di dissezione alla camera del miografo a pressione, tenendo un'estremità del segmento con una pinzetta microchirurgica. Successivamente, osservando attraverso un microscopio stereoscopico illuminato, afferrare un'estremità del segmento arterioso e farlo scivolare delicatamente sulla cannula di vetro sinistra.

Fissare l'estremità utilizzando i punti di sutura in nylon. Quindi, lavare delicatamente il lume del fluido attraverso il vaso montato per rimuovere il sangue e i detriti. La valvola della siringa sinistra deve quindi essere chiusa in modo che questo lato presenti una colonna statica di fluido contro la quale la pressione viene regolata dal lato destro; utilizzando il micromanipolatore, posizionare la cannula di vetro mobile di destra più vicina al segmento arterioso e tirare l'estremità destra del segmento sopra di essa.

Infine, fissare il segmento arterioso con suture in nylon e tagliare i fili eccedenti. Ora montare l'unità del grafico della pressione sullo stage sopra il microscopio per micrografie di pressione. Collegare la colonna della pressione al lato destro della camera del grafico, quindi posizionare il coperchio sulla camera.

Aumentare gradualmente la siringa da 10 millilitri nell'arco di 15 minuti e verificare la presenza di eventuali perdite nel vaso fino a quando il trasduttore di pressione P1 non indica 80 millimetri di mercurio; regolare la distanza tra la cannula quando necessario, in modo che il segmento arterioso pressurizzato sia approssimativamente dritto e formi un andamento a spalla nei punti in cui vengono effettuati i legature. Verificare la vitalità del vaso montato mediante superfusione transitoria con cloruro di potassio 60 millimolare per 30 secondi. Un vaso vitale si contrae rapidamente con l'aggiunta di cloruro di potassio e si dilata immediatamente al momento del lavaggio.

Successivamente, aggiungere la sostanza di prova concentrata direttamente alla soluzione del bagno, pipettandola delicatamente avanti e indietro vicino all'estremità della camera per mescolare la sostanza di prova nella soluzione, ottenendo la concentrazione finale appropriata nella camera da 10 millilitri. Le variazioni di volume nel diametro del vaso dopo l'aggiunta della sostanza di prova possono essere monitorate in tempo reale nell'immagine video e anche riportate graficamente nella finestra di analisi delle immagini durante lo svolgimento dell'esperimento. Questa figura mostra una serie di tracce di corrente sequenziali registrate in risposta a passi di tensione prima del trattamento, mostrati in nero, e dopo la stabilizzazione in presenza di 100 nanomolar di zinco perion in un singolo miocita arterioso mesenterico, mostrati in rosso; qui sono riportate le correnti rappresentative per il controllo e per 100 nanomolar di zinco perion.

Le barre grigie indicano l'intervallo di tempo in cui sono state misurate le ampiezze medie della corrente. Per i grafici corrente-tensione, le tensioni a gradino sono indicate a destra dalle punte delle frecce. Questo è l'andamento temporale del potenziamento della corrente KV7 indotto da 100 nanomolar di ione zinco, misurato mediante clampage continuo della tensione a -20 millivolt. Qui sono mostrate le curve medie corrente-tensione derivate dalle densità di corrente KV7 registrate prima e durante il trattamento con 100 nanomolar di ione zinco e durante il trattamento con 10 micromolar del bloccante del canale KV7 XC 991. Indotta dall'ione zinco, la rilassazione dell'arteria mesenterica pre-costritta con 100 picomolar di arginina vasopressina.

Questa figura mostra l'andamento temporale delle variazioni del diametro esterno del vaso in risposta all'applicazione di 100 picomolari di arginina vasopressina, seguita dall'applicazione di ioni zinco 100 nanomolari. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come preparare le arterie per l'isolamento di singole cellule o per la misurazione miografica sotto pressione della costrizione arteriosa e delle risposte dilatatorie. Inoltre, si dovrebbe sapere come registrare le correnti KV7 isolandole da altre correnti nei miociti arteriosi frescamente isolati.