Esplorare arteriosa Muscolo liscio KV7 Funzione canale del potassio con morsetto Elettrofisiologia Patch e Myography pressione

L'obiettivo generale di questa procedura è misurare l'attività dei sette canali del potassio KV nelle cellule muscolari lisce dell'arteria mesenterica appena dissociate e metterla in relazione con le misurazioni del diametro arterioso registrate in condizioni fisiologiche. Ciò si ottiene rimuovendo prima chirurgicamente l'arcata vascolare mesenterica da un ratto. Il secondo passo consiste nel sezionare e pulire i segmenti delle arterie mesenteriche.

Successivamente, alcuni segmenti vengono utilizzati per isolare singole cellule muscolari lisce per misurazioni elettrofisiologiche con patch clamp di KV sette correnti di potassio. La fase finale è l'incannulamento dei segmenti arteriosi intatti per le misurazioni miogeniche della pressione della costrizione o dilatazione arteriosa in risposta ai modulatori farmacologici dei sette canali del potassio KV. In definitiva, la combinazione di elettrofisiologia del patch clamp e miografia a pressione viene utilizzata per mostrare come un aumento o una diminuzione dell'attività dei sette canali del potassio KV influenzi la costrizione arteriosa mesenterica.

Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come l'uso di canali clonali espressi in linee cellulari, è che le correnti vengono registrate da cellule non coltivate che esprimono nativamente i canali e le correnti KV possono essere isolate da altre classi di canali del potassio che possono essere attivati nelle stesse cellule. La miografia a pressione consente di registrare le risposte funzionali dallo stesso tessuto da cui derivano le cellule isolate e il metodo è più sensibile e più fisiologico rispetto ad altri preparati come anelli arteriosi o strisce arteriose. Il Dr.Bareth Mani, un borsista post-dottorato del mio laboratorio, dimostrerà le tecniche di incannulamento arterioso e miografia a pressione e il Dr.Luba Brueggeman, un assistente professore di ricerca nel mio laboratorio, dimostrerà le procedure di isolamento cellulare e patch plan.

Per iniziare questa procedura, usa un paio di forbici chirurgiche per tagliare un segmento da 10 a 12 centimetri su entrambe le estremità dell'intestino tenue di un ratto. Quindi isolare l'intestino insieme al suo sistema vascolare attaccato. Quindi, individua il segmento dell'intestino tenue.

Allargare il mesenario sul lato vicino della camera in modo tale che il ramo primario dell'arteria mesenterica superiore sia al centro e l'ordine successivo dei rami si irradi dal centro. Quindi posizionare i perni solo sui segmenti intestinali visualizzandoli attraverso un microscopio da dissezione illuminato. Pulisci con cura il tessuto adiposo e il tessuto connettivo che circonda le arterie del secondo e quarto ordine vicino all'intestino usando micro pinze e forbici.

Tenere le vene adiacenti per facilitare la pulizia del tessuto adiposo e del tessuto connettivo ed evitare inutili stiramenti delle arterie. Ora trasferisci due o tre segmenti dell'arteria mesenterica in una piastra di coltura tissutale da 35 millimetri contenente due millilitri di soluzione di isolamento ghiacciata. Metti il piatto sul ghiaccio dopo, taglia i segmenti dell'arteria mesenterica in pezzi lunghi tre o quattro millimetri usando un PE la pipetta con una punta lucidata a fuoco.

Trasferire i segmenti arteriosi in una fiala di vetro contenente due millilitri di soluzione di isolamento preriscaldato a 37 gradi Celsius. Quindi incubarlo per 30 minuti a 37 gradi Celsius. Dopo 30 minuti, aspirare con cautela la soluzione di isolamento a 37 gradi Celsius con una pipetta posteriore.

Aggiungi due millilitri di soluzione enzimatica calda, quindi incubala per 35 minuti a 37 gradi Celsius. Immediatamente dopo l'incubazione di 35 minuti nella soluzione enzimatica, posizionare la fiala sul ghiaccio, aspirare la soluzione enzimatica e aggiungere due millilitri di soluzione di isolamento ghiacciata. Ripetere questa procedura quattro volte.

Quindi, in un millilitro di soluzione di isolamento ghiacciata, iterare delicatamente i segmenti arteriosi con la pipetta posteriore lucidata. Da 10 a 20 volte per rilasciare le singole cellule muscolari lisce dell'arteria mesenterica. Verificare periodicamente l'aspetto dei miociti posizionando una goccia della sospensione cellulare su un piatto da 35 millimetri e osservandoli al microscopio.

Le SMC MA sane dovrebbero avere un aspetto liscio e allungato. Quindi, trasferire circa 100-200 microlitri di sospensione cellulare nella camera di registrazione con una pipetta a pasta lucida e lasciare che le cellule aderiscano per 15 minuti. In questa fase, riempire la punta della pipetta per cerotti con amfotericina B, soluzione interna libera, inserendo la punta della pipetta al suo interno.

Quindi applicare l'aspirazione sull'altra estremità utilizzando una siringa da 10 millilitri collegata tramite un pezzo di tubo, aggiungere l'infoterina B contenente la soluzione di pipetta dall'alto. Utilizzando un puntale per pipetta einor micro loader fino a riempire la soluzione per circa metà. Rimuovere eventuali bolle d'aria picchiettando delicatamente la pipetta.

Successivamente, inserire la pipetta nel portaelettrodo. Utilizzare un micromanipolatore per abbassare la pipetta sulla superficie di un miocita allungato. Quando la resistenza della pipetta aumenta da sei a 10 mega ohm, applicare l'aspirazione per ottenere una tenuta giga.

Allo stesso tempo, impostare la tensione di mantenimento a zero millivolt in attesa della perforazione della membrana. Quindi, applicare incrementi di tensione di 100 millisecondi a più 10 millivolt e poi a meno 10 millivolt. Utilizzare l'amplificatore per compensare il transitorio di capacità della pipetta veloce in concomitanza con l'aspetto della capacità dell'intera cella.

Piccole correnti positive sostenute transitorie da due a 10 ampere PICO, pure e amplitude indicano la presenza di KV funzionale a sette canali. La perforazione riuscita con amfotericina B ridurrà la resistenza di accesso a 35 mega ohm o meno. Per registrare la relazione di tensione di corrente KV sette, applicare passi di tensione di cinque secondi a tensioni che vanno da meno 84 millivolt in cui la probabilità di apertura di KV sette canali è minima a più 16 millivolt in cui la probabilità di apertura di KV sette canali raggiunge un plateau Dopo cinque secondi ad ogni tensione di prova, tornare alla tensione di mantenimento a meno quattro millivolt per 10 secondi.

In questa procedura, sospendere liberamente due suture di nylon sottili prefabbricate su ciascun lato. Adiacente alla cannula di vetro, ha trasferito con cura il segmento dell'arteria mesenterica sezionato dalla camera di dissezione alla camera di innesto miogenico a pressione tenendo un'estremità del segmento utilizzando un paio di micro pinze. Successivamente, visualizzando attraverso un microscopio da dissezione illuminato, tenere un'estremità del segmento arterioso e farlo scorrere delicatamente sulla cannula di vetro sinistra.

Fissare l'estremità utilizzando le suture di nylon. Quindi sciacquare delicatamente il fluido del lume attraverso il vaso montato per rimuovere sangue e detriti. La valvola della siringa sinistra deve quindi essere chiusa in modo che questo lato presenti una colonna statica di fluido contro la quale la pressione viene regolata dal lato destro, utilizzando il micromanipolatore posizionare la cannula di vetro destra mobile più vicino al segmento dell'arteria e tirare l'estremità destra del segmento su di essa.

Infine, fissare il segmento dell'arteria con suture di nylon e tagliare i fili di sutura in eccesso. Montare ora l'unità del grafico della pressione sul tavolino sopra il microscopio a micrografo della pressione. Collegare la colonna di pressione al lato destro della camera del grafico, quindi posizionare il coperchio sopra la camera.

Sollevare gradualmente la siringa da 10 millilitri per un periodo di 15 minuti e verificare la presenza di eventuali perdite nel recipiente fino a quando il trasduttore di pressione P one legge 80 millimetri di mercurio regolare la distanza tra la cannula quando necessario, la distanza deve essere regolata in modo tale che il segmento dell'arteria pressurizzata sia approssimativamente dritto e formi un modello simile a una spalla dove vengono realizzati i legami. Controllare la vitalità del recipiente montato mediante la superfusione transitoria con 60 millimolari di cloruro di potassio per 30 secondi. Un vaso vitale si restringe rapidamente con l'aggiunta di cloruro di potassio e si dilata immediatamente dopo il suo lavaggio.

Quindi, aggiungere direttamente la sostanza in esame concentrata alla soluzione del bagno, pipettarla delicatamente avanti e indietro vicino all'estremità della camera per miscelare la sostanza in esame nella soluzione del bagno, ottenendo la concentrazione finale appropriata nella camera da 10 millilitri. Le variazioni di volume del diametro del recipiente in seguito all'aggiunta della sostanza in esame possono essere monitorate nell'immagine video in diretta e anche tracciate nella finestra di analisi dell'immagine mentre l'esperimento è in corso. Questa figura mostra una famiglia di tracce di corrente sequenziali registrate in risposta a gradini di tensione prima del trattamento come mostrato in nero e dopo la stabilizzazione in presenza di 100 perione di zinco nanomolare in un singolo miocita dell'arteria mesenterica come mostrato in rosso, ecco le correnti rappresentative per il controllo e per il perione di zinco 100 nanomolari.

Le barre grigie indicano l'intervallo di tempo in cui sono state misurate le ampiezze medie di corrente Per i grafici della tensione di corrente, le tensioni a gradini sono indicate a destra da punte di freccia. Questo è l'andamento temporale dell'aumento di corrente di KV sette da parte di 100 perion di zinco nanomolare misurato con morsetto di tensione continuo a meno 20 millivolt. Mostrato. Ecco le curve di tensione di corrente media derivate dalle densità di corrente KV sette registrate in precedenza durante il trattamento con perione di zinco 100 nanomolari e durante il trattamento con 10 micromolari del bloccante a sette canali KV XC 9 9 1 rilassamento indotto da ioni di zinco dell'arteria mesenterica pre ristretto con 100 arginina picomolare vasopressina.

Questa figura mostra l'andamento temporale delle variazioni del diametro esterno del recipiente in risposta all'applicazione di 100 arginina picomolare vasopressina, seguita dall'applicazione di 100 nanomolari di ioni zinco. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come preparare le arterie per l'isolamento di singole cellule o per la misurazione miografica della pressione della costrizione arteriosa, delle risposte dilatatrici. Inoltre, dovresti sapere come registrare le correnti KV sette isolate da altre correnti nei miociti arteriosi appena isolati.