Ingegneria tessuti muscolo scheletrico di cellule murine progenitrici mioblasti e di applicazione di stimolazione elettrica

L'obiettivo generale di questa procedura è generare tessuti muscolari ingegnerizzati. Questo viene raggiunto innanzitutto coltivando cellule satelliti o una linea cellulare di mioblasti per ottenere il numero richiesto di cellule. Il secondo passaggio consiste nel realizzare i punti di ancoraggio.

Successivamente, le cellule vengono mescolate con un gel e la miscela risultante viene colata tra i punti di ancoraggio. L'ultimo passaggio consiste nel differenziare le cellule in tessuto muscolare. In definitiva, una stimolazione elettrica può essere utilizzata per indurre le contrazioni delle cellule e la colorazione fluorescente, insieme alla microscopia fluorescente o confocale, può essere impiegata per rilevare l'organizzazione sarcomerica del citoscheletro nelle cellule muscolari differenziate.

Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti è che le cellule muscolari si allineeranno in un'unica direzione in questi tessuti. Questa tecnica ha inoltre implicazioni per i pazienti che soffrono di perdita muscolare. Se, ad esempio, utilizzassimo in futuro le cellule dello stesso paziente per creare questi tessuti, questi potrebbero essere impiegati a scopo di trapianto.

Questo metodo fornisce informazioni sullo sviluppo muscolare e sui danni muscolari, ma offrirà anche spunti per nuove applicazioni come la medicina rigenerativa e la coltivazione di carne in vitro. A dimostrazione della procedura, verranno illustrati metodi arian per l'isolamento e il congelamento di mirin. Le cellule progenitrici mioblastiche sono state descritte in precedenti pubblicazioni.

Consultare il protocollo scritto per i riferimenti completi. Dopo aver prelevato la provetta contenente le cellule progenitrici mioblastiche di topo dall'azoto liquido, posizionare la provetta in un bagno termico a 37 gradi Celsius per scongelarla.

Quindi aggiungere 10 millilitri di mezzo di crescita riscaldato in un fiasco per colture cellulari da 25 centimetri quadrati rivestito con gel di matrice. Non appena le cellule sono scongelate, aggiungere il contenuto della provetta al mezzo. Incubare le cellule nel fiasco per colture cellulari a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica.

Al terzo giorno di incubazione, raccogliere le cellule mediante tripsina, neutralizzazione e centrifugazione a 1000 g, quindi passare le cellule in un fiasco per colture cellulari da 75 centimetri quadrati rivestito con gel di matrice. Suddividere le cellule ogni tre giorni e, al sesto giorno, passarle in un fiasco per colture cellulari da 150 centimetri quadrati rivestito con gel di matrice. Al nono giorno, trasferire le cellule dal fiasco per colture cellulari da 150 centimetri quadrati rivestito con gel di matrice in un triplo fiasco da 150 centimetri quadrati rivestito con gel di matrice oppure in tre fiaschi da 150 centimetri quadrati.

Al giorno 12 di incubazione, le cellule sono pronte per essere seminate in un costrutto muscolare. Iniziare tagliando segmenti di Velcro di circa cinque millimetri quadrati con un bordo a forma triangolare come illustrato in questo schema; viene utilizzata solo la parte morbida del Velcro. Preparare quindi la colla siliconica mescolando l'elastomero con l'agente indurente in un rapporto di 10 a 1.

Quindi incollare due pezzi di Velcro in ciascun pozzetto di una piastra per colture a sei pozzetti, lasciando circa 12 millimetri di distanza tra i pezzi, e lasciare asciugare tutta la notte. Il giorno successivo, sterilizzare i pozzetti e il Velcro aggiungendo etanolo al 70% nei pozzetti e incubando per 15 minuti. Successivamente, risciacquare i pozzetti tre volte con PBS.

Lasciare il terzo lavaggio nei pozzetti ed esporre la piastra alla luce UV per 15 minuti. Quindi aspirare il PBS e trasferire le piastre nell'incubatore per colture cellulari fino al momento dell'utilizzo. Preparare una soluzione di 3,2 milligrammi per millilitro di collagene in acido acetico sterile allo 0,02%.

Posizionare la soluzione di collagene sul ghiaccio insieme alla soluzione di matrigel, precedentemente scongelata in frigorifero. Successivamente, raccogliere le cellule mediante tripsinizzazione e centrifugazione. Quindi, risospendere il pellet cellulare nel mezzo di crescita ed eseguire un conteggio cellulare seguendo le procedure standard.

Dopo aver contato le cellule, posizionare il tubo contenente le cellule nell'incubatrice per colture cellulari. La soluzione di matrice viene preparata mescolando le soluzioni sul ghiaccio nelle seguenti percentuali: 51,3% soluzione di collagene 0,2%, 0,5 molarità di idrossido di sodio, 8,6% gel di matrice e 39,9% di mezzo di crescita. Assicurarsi che la soluzione finale sia di colore rosa, poiché un aumento del pH può causare una rapida polimerizzazione.

Il volume finale dipende dal numero di pozzetti da seminare. Questa tabella mostra i volumi per 10 muscoli. Assicurarsi che le cellule siano completamente risospese e trasferire da 750.000 a 1.250.000 cellule per costrutto in un nuovo tubo da centrifuga; centrifugare a 1000 giri/min per cinque minuti, aspirare il soprannatante e risospendere il pellet cellulare in un volume piccolo ma sufficiente della miscela di matrice.

Quindi, una volta che il pellet è stato completamente risospeso, aggiungere le cellule al volume rimanente della miscela di matrice. A questo punto, dopo aver recuperato le piastre preriscaldate dall'incubatore, pipettare da 0,35 a 0,4 millilitri della miscela cellule-matrice in ogni pezzo di Velcro. Iniziare quindi a pipettare la miscela a partire dal centro tra i siti di attacco, estendendosi verso il Velcro.

Infine, utilizzare il resto del gel per riempire lo spazio tra i due ancoraggi in velcro e pipettare attorno alle parti in velcro. Coprire la piastra e lasciarla a temperatura ambiente per cinque-dieci minuti. Quindi battere leggermente sul piatto e ispezionare visivamente per verificare se il gel è rigido.

Se così è, le piastre possono essere trasferite delicatamente nell'incubatrice per colture cellulari. Dopo un'ora o due di incubazione, sovrapporre delicatamente ciascun gel con quattro millilitri di mezzo di crescita preriscaldato. Quindi reinserire la piastra nell'incubatrice per colture cellulari.

Dopo 24 ore, sostituire il mezzo di crescita con il mezzo di differenziazione. Ripetere il cambio del mezzo ogni due o tre giorni. Le fibre muscolari mature orientate dovrebbero essere evidenti al settimo giorno di coltura.

A questo punto, le fibre possono essere stimolate elettricamente. Innanzitutto, sterilizzare gli elettrodi della piastra di ionica con etanolo al 70% per 15 minuti e asciugarli sotto luce UV per 30 minuti. Successivamente, posizionare gli elettrodi sterilizzati sulla piastra di coltura, assicurandosi che siano disposti parallelamente al costrutto muscolare come mostrato in questa immagine che raffigura il fondo di una piastra; le frecce bianche indicano gli elettrodi che coprono la piastra con il suo coperchio, quindi trasferire nell'incubatrice per colture cellulari.

Collegare l'ion optic C pacer con i cavi appropriati e applicare qui il protocollo di stimolazione. Si utilizzano quattro volt per centimetro. Impulsi di sei millisecondi a una frequenza di due hertz.

La stimolazione elettrica di solito viene effettuata per un periodo di 48 ore. Cambiare il mezzo di coltura ogni 24 ore durante la stimolazione. Questa immagine mostra un esempio tipico di un costrutto muscolare maturo.

La dimensione del tessuto è di circa otto millimetri di lunghezza, due millimetri di larghezza e 0,5 millimetri di spessore. Questa immagine mostra un esempio tipico di una cellula progenitrice muscolare in tessuti muscolari scheletrici ingegnerizzati. Sezioni congelate di muscoli bioartificiali non stimolati o M bms speculari.

All'ottavo giorno di differenziazione, sono state effettuate colorazioni per l'alfa-actinina sarcomerica mostrata in rosso, la miosina sarcomerica mostrata in verde e i nuclei mostrati in blu. I pannelli a destra sono un ingrandimento delle aree racchiuse nel riquadro. Il protocollo può essere utilizzato anche su cellule C two C 12.

Questa immagine mostra cellule C2C12 differenziate colorate nello stesso modo illustrato nell'ultima immagine. L'alfa-actinina sarcomerica è mostrata in rosso. La miosina sarcomerica è mostrata in verde e i nuclei sono mostrati in blu.

Anche in questo caso, i pannelli a destra sono ingrandimenti delle aree riquadrate. Durante l'esecuzione di questa procedura, è importante ricordare di mantenere tutto sul ghiaccio. Dopo aver seguito questo protocollo, è possibile eseguire altri metodi per rispondere a ulteriori domande, come la PCR quantitativa per dimostrare variazioni nei livelli di espressione genica dopo il suo sviluppo.

La tecnica ha aperto la strada ai ricercatori per studiare il ruolo della meccanica nella morfogenesi dei tessuti. Ha inoltre contribuito alla progettazione di modelli di muscolo cardiaco ingegnerizzato. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come generare tessuti muscolari ingegnerizzati utilizzando un impalcatura a base di idrogel.