Name: Analisi quantitativa di proteomi cromatina nella malattia (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-12-28T12:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 11 s
Description: Impara a isolare proteine cromatina associate dal cuore di topo mediante omogenizzazione e centrifugazione su gradiente di saccarosio. Questo metodo consente l'analisi quantitativa del proteoma nucleare in condizioni fisiologiche diverse.

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Il laboratorio Vondriska è supportato anche da finanziamenti del National Institute Heart, Lung e il Sangue del NIH e la Fondazione Laubisch alla UCLA. EM è destinatario del S. Jennifer Buchwald Graduate Fellowship in Fisiologia presso la UCLA, HC è il destinatario di un American Heart Association Pre-dottorato, MP è il destinatario di un Ruth NIH Kirschstein post-dottorato, e SF è il destinatario di un NIH K99 Award.

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<li>Franklin, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specialized+compartments+of+cardiac+nuclei+exhibit+distinct+proteomic+anatomy%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell.+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Specialized compartments of cardiac nuclei exhibit distinct proteomic anatomy.</a> Mol Cell. Proteomics. 10, (2011).</li>
<li>Paulsson, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Post-translational+regulation+of+calsarcin-1+during+pressure+overload-induced+cardiac+hypertrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+molecular+and+cellular+cardiology%22%5BJournal%5D)">Post-translational regulation of calsarcin-1 during pressure overload-induced cardiac hypertrophy.</a> Journal of molecular and cellular cardiology. 48, 1206-1214 (2010).</li>
<li>Franklin, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+analysis+of+the+chromatin+proteome+in+disease+reveals+remodeling+principles+and+identifies+high+mobility+group+protein+b2+as+a+regulator+of+hypertrophic+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Quantitative analysis of the chromatin proteome in disease reveals remodeling principles and identifies high mobility group protein b2 as a regulator of hypertrophic growth.</a> Mol Cell Proteomics. 11, (2012).</li>
<li>Gramolini, A. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+proteomics+profiling+of+a+phospholamban+mutant+mouse+model+of+dilated+cardiomyopathy+reveals+progressive+intracellular+stress+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Comparative proteomics profiling of a phospholamban mutant mouse model of dilated cardiomyopathy reveals progressive intracellular stress responses.</a> Mol Cell Proteomics. 7, 519-533 (2008).</li>
<li>Singh, H., Warburton, S., Vondriska, T. M., Khakh, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomics+to+Identify+Proteins+Interacting+with+P2X2+Ligand-Gated+Cation+Channels%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Proteomics to Identify Proteins Interacting with P2X2 Ligand-Gated Cation Channels.</a> J. Vis. Exp. (27), e1178(2009).</li>
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<li>Guthals, A., Bandeira, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peptide+identification+by+tandem+mass+spectrometry+with+alternate+fragmentation+modes%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Peptide identification by tandem mass spectrometry with alternate fragmentation modes.</a> Mol. Cell Proteomics. , (2012).</li>
<li>Wu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+protease+for+%27middle-down%27+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">A protease for 'middle-down' proteomics.</a> Nat. Methods. , (2012).</li>
<li>Tran, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+intact+protein+isoforms+in+discovery+mode+using+top-down+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mapping intact protein isoforms in discovery mode using top-down proteomics.</a> Nature. 480, 254-258 (2011).</li>
</ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Due metodi principali per isolamento nucleare sono stati esaminati in precedenza: 27 uno è la tecnica di omogeneizzazione Behrens tessuto liofilizzato in un solvente non acquoso e la seconda, una modifica che usiamo qui, omogeneizzazione di tessuto in una soluzione acquosa di saccarosio / soluzione salina seguita dal differenziale o centrifugazione in gradiente di densità. Subfractionation dei nuclei mediante estrazione acido su campioni di tessuto è uno strumento importante per l...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome del reagente </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td></tr><tr><td> Dulbeco Eagle modificato Media </td><td> Invitrogen </td><td> 11965 </td></tr><tr><td> Proteasi pellet </td><td> Roche </td><td> 04 693 159 001 </td></tr><tr><td> 100 um filtro </td><td> BD Falcon </td><td> 352360 </td></tr><tr><td> Ultracut ultramicrotomo </td><td> Reichert </td><td></td></tr><tr><td> 100CX elettronica a trasmissione Microscopio </td><td> JEOL USA, Inc. </td><td></td></tr><tr><td> Rigogolo </td><td> BioRad </td><td> 161-0496 </td></tr><tr><td> Istone H2A anticorpo </td><td> Santa Cruz </td><td> sc-8648 </td></tr><tr><td> Nucleoporin anticorpo p62 </td><td> BD Biosciences </td><td> 610498 </td></tr><tr><td> Adenina nucleomarea trasportatore anticorpo </td><td> Santa Cruz </td><td> sc-9299 </td></tr><tr><td> BiP anticorpo </td><td> Santa Cruz </td><td> sc-1050 </td></tr><tr><td> Tubulina </td><td> Sigma </td><td> T1568 </td></tr><tr><td> Istone H3 anticorpo </td><td> Abcam </td><td> ab1791 </td></tr><tr><td> Fibrillarina anticorpo </td><td> Segnalazione cellulare </td><td> C12C3 </td></tr><tr><td> SNRP70 anticorpo </td><td> Abcam </td><td> ab51266 </td></tr><tr><td> E2F-1 anticorpo </td><td> Thermo Fisher </td><td> MS-879 </td></tr><tr><td> Retinoblastoma anticorpo </td><td> BD Biosciences </td><td> 554136 </td></tr><tr><td> Ipossia inducibile fattore-1 anticorpo </td><td> Novus Biologicals </td><td> NB100-469 </td></tr><tr><td> BCA proteina test </td><td> Thermo Scientific </td><td> 23227 </td></tr><tr><td> Colonna a fase inversa </td><td> Obj Nuovocace </td><td> PFC7515-B14-10 </td></tr><tr><td> Bioworks Browser </td><td> Thermo Scientific </td><td></td></tr></tbody></table>

analisi quantitativa di proteomi cromatina nella malattia

Quantitative Analysis of Chromatin Proteomes in Disease

Nel nucleo risiedono le proteomi le cui funzioni sono più intimamente collegati con regolazione genica. Adulto nuclei cardiomiociti mammiferi sono unici a causa della elevata percentuale di cellule binucleated, 1 lo stato prevalentemente eterocromatico del DNA, e la non divisione natura del cardiomiociti che rende nuclei adulto in uno stato permanente di interfase. 2 Regolazione trascrizionale durante lo sviluppo e la malattia sono stati ben studiati in questo organo, 3-5 ma ciò che rimane relativamente inesplorato è il ruolo svolto dalle proteine ​​nucleari responsabili per il confezionamento del DNA e di espressione, e di come queste proteine ​​controllare i cambiamenti nei programmi trascrizionali che si verificano durante la malattia. 6 Nella sviluppato mondo, la malattia di cuore è la causa numero uno di mortalità sia per gli uomini e le donne. 7 Insight su come proteine ​​nucleari cooperano per regolare la progressione di questa malattia è fondamentale per far progredire l&#39;attuale trattamento opzioni. La spettrometria di massa è lo strumento ideale per affrontare queste domande in quanto permette una annotazione imparziale della quantificazione nucleare proteoma e relativo per come l&#39;abbondanza di queste proteine ​​cambiamenti con la malattia. Mentre ci sono stati diversi studi di proteomica per mammiferi complessi proteici nucleari, 8-13 fino a poco tempo 14 vi è stato un solo studio che esamina la proteoma cardiaco nucleare, ed è considerato il nucleo intero, piuttosto che esplorare il proteoma a livello di compartimenti sub nucleari . 15 In gran parte, questa carenza di lavoro è dovuta alla difficoltà di isolare nuclei cardiaca. Nuclei cardiaca avvenire entro un rigido e denso actina-miosina dell&#39;apparecchio a cui sono collegati tramite estensioni multiple dal reticolo endoplasmatico, nella misura in cui altera contrazione miociti loro forma complessiva. 16 Inoltre, cardiomiociti sono il 40% in volume mitocondri 17 che necessitates arricchimento del nucleo parte le altri organelli. Qui si descrive un protocollo per cardiaca arricchimento nucleare e ulteriore frazionamento in compartimenti biologicamente rilevanti. Inoltre, i metodi di dettaglio per l&#39;etichetta senza dissezione massa quantitativa spettrometria di queste frazioni-tecniche suscettibili di sperimentazione in vivo in vari modelli animali e sistemi di organi in cui marcatura metabolica non è fattibile.

Figura 4 mette in evidenza l&#39;utilità di questa forma di quantificazione relativa. Mostrata nel pannello di sinistra sono i singoli picchi peptide monoisotopico (sovrapposto da diversi tipi di mouse), che sono state designate come appartenenti alla proteina HMGB1 (identificato tramite ricerca nel database). Ogni picco, essenzialmente un cromatografo ionico estratta per il dato peptide, proviene da un mouse diverso. I gruppi rappresentano tre diversi stati fisiologici: basale, l&#39;ipertrofia cardiac...

I progressi nella spettrometria di massa hanno permesso l&#39;analisi ad alta velocità di espressione della proteina e la modifica in una miriade di tessuti. In combinazione con frazionamento subcellulare e modelli di malattia, di massa quantitativa spettrometria e bioinformatica può rivelare nuove proprietà nei sistemi biologici. Il metodo qui descritto analizza cromatina proteine ​​associate alla regolazione di malattie cardiache ed è facilmente applicabile ad altre<em&gt; In vivo</em&gt; Modelli di malattie umane.

Analisi quantitativa di proteomi cromatina nella malattia

Nel nucleo risiedono i proteomi le cui funzioni sono più strettamente legate alla regolazione genica. I nuclei dei cardiomiociti di mammifero adulti sono unici a causa di...

L'obiettivo generale di questa procedura è isolare le proteine legate alla cromatina dal cuore del topo. Questo viene ottenuto innanzitutto omogeneizzando il cuore e quindi isolando i nuclei cardiaci mediante un gradiente di densità al saccarosio. Successivamente, il nucleoplasma viene separato dalla frazione cromatinica.Successivamente, le proteine vengono estratte dal pellet di cromatina per arricchire quelle legate debolmente al DNA. Infine, le proteine vengono estratte da un pellet di cromatina differente per arricchire quelle legate strettamente al DNA. In ultima analisi, è possibile ottenere risultati che mostrano le caratteristiche del proteoma nucleare in diverse condizioni fisiologiche mediante analisi spettrometrica di massa quantitativa senza etichette.Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo cardiaco, ad esempio in che modo la rimodellazione della cromatina contribuisce all'ipertrofia e all'insufficienza cardiaca. Dopo aver sacrificato un topo adulto ed escisso il cuore, sciacquarlo in PBS freddo di ghiaccio. Successivamente, posizionarlo in un mortaio di vetro con due millilitri di buffer di lisi contenente una miscela di inibitori di

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Qui stiamo presentando un immunoprecipitazione della cromatina (ChIP) procedura per la genoma analisi posizione di isoforme di proteine ​​che si differenziano in un istone-dominio di legame. Lo stiamo applicando a ChIP-Seq analisi per identificare gli obiettivi del demetilasi KDM5A/JARID1A/RBP2 istoni.

Genoma Analisi mediante ChIP per identificare Isoform obiettivi specifici per Gene

La combinazione di immunoprecipitazione della cromatina e sequenziamento ultra-high-throughput (ChIP-seq) in grado di identificare e mappare le interazioni proteina-DNA in una determinata linea di tessuti o cellule. Delineato è come generare un modello di chip per la successiva sequenza di alta qualità, utilizzando l'esperienza con il fattore di trascrizione TCF7L2 come esempio.

Generazione di immunoprecipitazione della cromatina Template DNA di alta qualità per high-throughput sequencing (ChIP-Seq)

Combinando nativa e reticolazione cromatina immunoprecipitazione con alta risoluzione di Spettrometria di Massa, l'approccio ChroP permette di sezionare il composito dell'architettura proteomica delle modificazioni degli istoni, le varianti e le proteine ​​non istoniche Synergizing a domini di cromatina funzionalmente distinte.

L&#39;approccio ChroP Combina ChIP e Spettrometria di Massa a sezionare Locus-specifiche proteomica Paesaggi della cromatina

Estrazione del sale sequenziale delle proteine della cromatina associata è uno strumento utile per determinare le proprietà di associazione dei complessi della proteina grande. Questo metodo può essere impiegato per valutare il ruolo delle singole subunità o domini dell'affinità complessiva di una proteina complessa di massa della cromatina.

Estrazioni sequenziale sale per l'analisi di massa di cromatina associazione proprietà di complessi di rimodellamento della cromatina

Qui, descriviamo un'immunoprecipitazione della cromatina (ChIP) e il protocollo di preparazione libreria ChIP-seq per generare profili epigenomic globale da campioni di embrionali di pollo di basso-abbondanza.

Protocollo di immunoprecipitazione (ChIP) della cromatina per campioni embrionali bassa-abbondanza

Qui, descriviamo un protocollo di ChIP-sequenziamento high throughput ottimizzato e pipeline di analisi computazionali per la determinazione dei modelli di stato della cromatina genoma da tessuti tumorali congelati e linee cellulari.

Una piattaforma integrata per la mappatura di genoma degli Stati di cromatina usando High-throughput ChIP-sequencing nei tessuti del tumore

Si tratta di un metodo per identificare nuove proteine che interagiscono con DNA loci target specifico, basandosi sull'acquisizione di sequenza-specifico della cromatina reticolato per analisi proteomica successive. Alcuna conoscenza pregressa potenziali proteine leganti, né modifiche di cella non sono necessari. Inizialmente sviluppato per il lievito, la tecnologia ora è stata adattata per cellule di mammifero.

Adattamento di ibridazione catturare delle proteine della cromatina associate per proteomica per cellule di mammifero

Presentiamo un protocollo per identificare le implicazioni funzionali delle varianti non codificanti identificate dagli studi di associazione a livello di genoma (GWAS) utilizzando interazioni tridimensionali della cromatina.

Mappare le varianti della malattia di Alzheimer ai loro geni bersaglio utilizzando l'analisi computazionale della configurazione della cromatina

Questo protocollo si concentra sulla preparazione della cromatina da tessuti congelati a scatto ed è adatto per l'immunoprecipitazione della cromatina reticolante (X-ChIP) seguita da analisi quantitative PCR (X-ChIP-qPCR) o approcci di sequenziamento di nuova generazione (X-ChIP-seq).

Estrazione della cromatina dal tessuto epatico chimerico congelato per l'analisi dell'immunoprecipitazione della cromatina

Utilizzando la PCR quantitativa, ci dimostrano come la consolidata pulcino modello CAM può essere utilizzato per analizzare quantitativamente la metastasi di cellule tumorali in organi distanti.

L&#39;analisi quantitativa delle metastasi del cancro utilizzando un modello di aviaria Embryo

Impara a isolare proteine cromatina associate dal cuore di topo mediante omogenizzazione e centrifugazione su gradiente di saccarosio. Questo metodo consente l'analisi quantitativa del proteoma nucleare in condizioni fisiologiche diverse.

Analisi quantitativa di proteomi cromatina nella malattia

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