Name: Analisi quantitativa di proteomi cromatina nella malattia (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-12-28T12:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 11 s
Description: Impara a isolare proteine cromatina associate dal cuore di topo mediante omogenizzazione e centrifugazione su gradiente di saccarosio. Questo metodo consente l'analisi quantitativa del proteoma nucleare in condizioni fisiologiche diverse.

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Il laboratorio Vondriska è supportato anche da finanziamenti del National Institute Heart, Lung e il Sangue del NIH e la Fondazione Laubisch alla UCLA. EM è destinatario del S. Jennifer Buchwald Graduate Fellowship in Fisiologia presso la UCLA, HC è il destinatario di un American Heart Association Pre-dottorato, MP è il destinatario di un Ruth NIH Kirschstein post-dottorato, e SF è il destinatario di un NIH K99 Award.

<ol><li>Li, F., Wang, X., Capasso, J. M., Gerdes, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+transition+of+cardiac+myocytes+from+hyperplasia+to+hypertrophy+during+postnatal+development%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Cell+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Rapid transition of cardiac myocytes from hyperplasia to hypertrophy during postnatal development.</a> J Mol Cell Cardiol. 28, 1737-1746 (1996).</li>
<li>Rumyantsev, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interrelations+of+the+proliferation+and+differentiation+processes+during+cardiact+myogenesis+and+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Int+Rev.+Cytol%22%5BJournal%5D)">Interrelations of the proliferation and differentiation processes during cardiact myogenesis and regeneration.</a> Int Rev. Cytol. 51, 186-273 (1977).</li>
<li>Olson, E. N., Schneider, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sizing+up+the+heart%3A+development+redux+in+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Sizing up the heart: development redux in disease.</a> Genes Dev. 17, 1937-1956 (2003).</li>
<li>Molkentin, J. D., Dorn, G. W. 2nd <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytoplasmic+signaling+pathways+that+regulate+cardiac+hypertrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Cytoplasmic signaling pathways that regulate cardiac hypertrophy.</a> Annu Rev. Physiol. 63, 391-426 (2001).</li>
<li>Fishman, M. C., Chien, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fashioning+the+vertebrate+heart%3A+earliest+embryonic+decisions%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Fashioning the vertebrate heart: earliest embryonic decisions.</a> Development. 124, 2099-2117 (1997).</li>
<li>Rajabi, M., Kassiotis, C., Razeghi, P., Taegtmeyer, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Return+to+the+fetal+gene+program+protects+the+stressed+heart%3A+a+strong+hypothesis%5BTitle%5D)+AND+%22Heart+Fail+Rev%22%5BJournal%5D)">Return to the fetal gene program protects the stressed heart: a strong hypothesis.</a> Heart Fail Rev. 12, 331-343 (2007).</li>
<li>Roger, V. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heart+disease+and+stroke+statistics--2011+update%3A+a+report+from+the+American+Heart+Association%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Heart disease and stroke statistics--2011 update: a report from the American Heart Association.</a> Circulation. 123, e18-e209 (2011).</li>
<li>Schirmer, E. C., Florens, L., Guan, T., Yates, J. R. 3rd, Gerace, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+membrane+proteins+with+potential+disease+links+found+by+subtractive+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Nuclear membrane proteins with potential disease links found by subtractive proteomics.</a> Science. 301, 1380-1382 (2003).</li>
<li>Lambert, J. P., Mitchell, L., Rudner, A., Baetz, K., Figeys, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+proteomics+approach+for+the+discovery+of+chromatin-associated+protein+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">A novel proteomics approach for the discovery of chromatin-associated protein networks.</a> Mol. Cell Proteomics. 8, 870-882 (2009).</li>
<li>Malik, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-specific+and+lamin-dependent+targeting+of+novel+transmembrane+proteins+in+the+nuclear+envelope%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">Cell-specific and lamin-dependent targeting of novel transmembrane proteins in the nuclear envelope.</a> Cell Mol Life Sci. 67, 1353-1369 (2010).</li>
<li>Tweedie-Cullen, R. Y., Reck, J. M., Mansuy, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+mapping+of+post-translational+modifications+on+synaptic%2C+nuclear%2C+and+histone+proteins+in+the+adult+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">Comprehensive mapping of post-translational modifications on synaptic, nuclear, and histone proteins in the adult mouse brain.</a> J. Proteome Res. 8, 4966-4982 (2009).</li>
<li>Chu, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sperm+chromatin+proteomics+identifies+evolutionarily+conserved+fertility+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Sperm chromatin proteomics identifies evolutionarily conserved fertility factors.</a> Nature. 443, 101-105 (2006).</li>
<li>Uchiyama, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteome+analysis+of+human+metaphase+chromosomes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Proteome analysis of human metaphase chromosomes.</a> J. Biol. Chem. 280, 16994-17004 (2005).</li>
<li>Franklin, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specialized+compartments+of+cardiac+nuclei+exhibit+distinct+proteomic+anatomy%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Specialized compartments of cardiac nuclei exhibit distinct proteomic anatomy.</a> Mol. Cell Proteomics. 10, (2011).</li>
<li>Kislinger, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+survey+of+organ+and+organelle+protein+expression+in+mouse%3A+combined+proteomic+and+transcriptomic+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Global survey of organ and organelle protein expression in mouse: combined proteomic and transcriptomic profiling.</a> Cell. 125, 173-186 (2006).</li>
<li>Moore, D. H., Ruska, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electron+microscope+study+of+mammalian+cardiac+muscle+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biophys+Biochem.+Cytol%22%5BJournal%5D)">Electron microscope study of mammalian cardiac muscle cells.</a> J. Biophys Biochem. Cytol. 3, 261-268 (1957).</li>
<li>Anversa, P., Vitali-Mazza, L., Visioli, O., Marchetti, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+cardiac+hypertrophy%3A+a+quantitative+ultrastructural+study+in+the+compensatory+stage%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Cell+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Experimental cardiac hypertrophy: a quantitative ultrastructural study in the compensatory stage.</a> J. Mol. Cell Cardiol. 3, 213-227 (1971).</li>
<li>Franklin, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specialized+compartments+of+cardiac+nuclei+exhibit+distinct+proteomic+anatomy%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell.+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Specialized compartments of cardiac nuclei exhibit distinct proteomic anatomy.</a> Mol Cell. Proteomics. 10, (2011).</li>
<li>Paulsson, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Post-translational+regulation+of+calsarcin-1+during+pressure+overload-induced+cardiac+hypertrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+molecular+and+cellular+cardiology%22%5BJournal%5D)">Post-translational regulation of calsarcin-1 during pressure overload-induced cardiac hypertrophy.</a> Journal of molecular and cellular cardiology. 48, 1206-1214 (2010).</li>
<li>Franklin, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+analysis+of+the+chromatin+proteome+in+disease+reveals+remodeling+principles+and+identifies+high+mobility+group+protein+b2+as+a+regulator+of+hypertrophic+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Quantitative analysis of the chromatin proteome in disease reveals remodeling principles and identifies high mobility group protein b2 as a regulator of hypertrophic growth.</a> Mol Cell Proteomics. 11, (2012).</li>
<li>Gramolini, A. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+proteomics+profiling+of+a+phospholamban+mutant+mouse+model+of+dilated+cardiomyopathy+reveals+progressive+intracellular+stress+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Comparative proteomics profiling of a phospholamban mutant mouse model of dilated cardiomyopathy reveals progressive intracellular stress responses.</a> Mol Cell Proteomics. 7, 519-533 (2008).</li>
<li>Singh, H., Warburton, S., Vondriska, T. M., Khakh, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomics+to+Identify+Proteins+Interacting+with+P2X2+Ligand-Gated+Cation+Channels%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Proteomics to Identify Proteins Interacting with P2X2 Ligand-Gated Cation Channels.</a> J. Vis. Exp. (27), e1178(2009).</li>
<li>Park, S. K., Venable, J. D., Xu, T., Yates, J. R. 3rd <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+quantitative+analysis+software+tool+for+mass+spectrometry-based+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">A quantitative analysis software tool for mass spectrometry-based proteomics.</a> Nat. Methods. 5, 319-322 (2008).</li>
<li>Lomenick, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Target+identification+using+drug+affinity+responsive+target+stability+%28DARTS%29%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Target identification using drug affinity responsive target stability (DARTS).</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106, 21984-21989 (2009).</li>
<li>Kamleh, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolomic+profiling+using+Orbitrap+Fourier+transform+mass+spectrometry+with+hydrophilic+interaction+chromatography%3A+a+method+with+wide+applicability+to+analysis+of+biomolecules%5BTitle%5D)+AND+%22Rapid+Commun.+Mass+Spectrom%22%5BJournal%5D)">Metabolomic profiling using Orbitrap Fourier transform mass spectrometry with hydrophilic interaction chromatography: a method with wide applicability to analysis of biomolecules.</a> Rapid Commun. Mass Spectrom. 22, 1912-1918 (2008).</li>
<li>Searle, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scaffold%3A+a+bioinformatic+tool+for+validating+MS%2FMS-based+proteomic+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Scaffold: a bioinformatic tool for validating MS/MS-based proteomic studies.</a> Proteomics. 10, 1265-1269 (2010).</li>
<li>Murray, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Basic+Proteins+of+Cell+Nuclei%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev.+Biochem%22%5BJournal%5D)">The Basic Proteins of Cell Nuclei.</a> Annu Rev. Biochem. 34, 209-246 (1965).</li>
<li>Johns, E. W., Phillips, D. M., Simson, P., Butler, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+fractionations+of+arginine-rich+histones+from+calf+thymus%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+J%22%5BJournal%5D)">Improved fractionations of arginine-rich histones from calf thymus.</a> Biochem. J. 77, 631-636 (1960).</li>
<li>Rodriguez-Collazo, P., Leuba, S. H., Zlatanova, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Robust+methods+for+purification+of+histones+from+cultured+mammalian+cells+with+the+preservation+of+their+native+modifications%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Robust methods for purification of histones from cultured mammalian cells with the preservation of their native modifications.</a> Nucleic Acids Res. 37, e81(2009).</li>
<li>Kuehl, L., Salmond, B., Tran, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concentrations+of+high-mobility-group+proteins+in+the+nucleus+and+cytoplasm+of+several+rat+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Concentrations of high-mobility-group proteins in the nucleus and cytoplasm of several rat tissues.</a> J. Cell Biol. 99, 648-654 (1984).</li>
<li>Gronow, M., Griffiths, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+isolation+and+separation+of+the+non-histone+proteins+of+rat+liver+nuclei%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Rapid isolation and separation of the non-histone proteins of rat liver nuclei.</a> FEBS Lett. 15, 340-344 (1971).</li>
<li>Mischke, B. G., Ward, O. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+tissue+specificity+of+chromatin-associated+proteins+in+Vicia+faba%5BTitle%5D)+AND+%22Can+J.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Isolation and tissue specificity of chromatin-associated proteins in Vicia faba.</a> Can J. Biochem. 53, 91-95 (1975).</li>
<li>Andersen, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+proteomic+analysis+of+the+human+nucleolus%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Directed proteomic analysis of the human nucleolus.</a> Curr. Biol. 12, 1-11 (2002).</li>
<li>Zhao, Y., Jensen, O. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modification-specific+proteomics%3A+strategies+for+characterization+of+post-translational+modifications+using+enrichment+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Modification-specific proteomics: strategies for characterization of post-translational modifications using enrichment techniques.</a> Proteomics. 9, 4632-4641 (2009).</li>
<li>Ahrne, E., Muller, M., Lisacek, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unrestricted+identification+of+modified+proteins+using+MS%2FMS%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Unrestricted identification of modified proteins using MS/MS.</a> Proteomics. 10, 671-686 (2010).</li>
<li>Young, N. L., Plazas-Mayorca, M. D., Garcia, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systems-wide+proteomic+characterization+of+combinatorial+post-translational+modification+patterns%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Rev.+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Systems-wide proteomic characterization of combinatorial post-translational modification patterns.</a> Expert Rev. Proteomics. 7, 79-92 (2010).</li>
<li>Guthals, A., Bandeira, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peptide+identification+by+tandem+mass+spectrometry+with+alternate+fragmentation+modes%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Peptide identification by tandem mass spectrometry with alternate fragmentation modes.</a> Mol. Cell Proteomics. , (2012).</li>
<li>Wu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+protease+for+%27middle-down%27+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">A protease for 'middle-down' proteomics.</a> Nat. Methods. , (2012).</li>
<li>Tran, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+intact+protein+isoforms+in+discovery+mode+using+top-down+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mapping intact protein isoforms in discovery mode using top-down proteomics.</a> Nature. 480, 254-258 (2011).</li>
</ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Due metodi principali per isolamento nucleare sono stati esaminati in precedenza: 27 uno è la tecnica di omogeneizzazione Behrens tessuto liofilizzato in un solvente non acquoso e la seconda, una modifica che usiamo qui, omogeneizzazione di tessuto in una soluzione acquosa di saccarosio / soluzione salina seguita dal differenziale o centrifugazione in gradiente di densità. Subfractionation dei nuclei mediante estrazione acido su campioni di tessuto è uno strumento importante per l...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome del reagente </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td></tr><tr><td> Dulbeco Eagle modificato Media </td><td> Invitrogen </td><td> 11965 </td></tr><tr><td> Proteasi pellet </td><td> Roche </td><td> 04 693 159 001 </td></tr><tr><td> 100 um filtro </td><td> BD Falcon </td><td> 352360 </td></tr><tr><td> Ultracut ultramicrotomo </td><td> Reichert </td><td></td></tr><tr><td> 100CX elettronica a trasmissione Microscopio </td><td> JEOL USA, Inc. </td><td></td></tr><tr><td> Rigogolo </td><td> BioRad </td><td> 161-0496 </td></tr><tr><td> Istone H2A anticorpo </td><td> Santa Cruz </td><td> sc-8648 </td></tr><tr><td> Nucleoporin anticorpo p62 </td><td> BD Biosciences </td><td> 610498 </td></tr><tr><td> Adenina nucleomarea trasportatore anticorpo </td><td> Santa Cruz </td><td> sc-9299 </td></tr><tr><td> BiP anticorpo </td><td> Santa Cruz </td><td> sc-1050 </td></tr><tr><td> Tubulina </td><td> Sigma </td><td> T1568 </td></tr><tr><td> Istone H3 anticorpo </td><td> Abcam </td><td> ab1791 </td></tr><tr><td> Fibrillarina anticorpo </td><td> Segnalazione cellulare </td><td> C12C3 </td></tr><tr><td> SNRP70 anticorpo </td><td> Abcam </td><td> ab51266 </td></tr><tr><td> E2F-1 anticorpo </td><td> Thermo Fisher </td><td> MS-879 </td></tr><tr><td> Retinoblastoma anticorpo </td><td> BD Biosciences </td><td> 554136 </td></tr><tr><td> Ipossia inducibile fattore-1 anticorpo </td><td> Novus Biologicals </td><td> NB100-469 </td></tr><tr><td> BCA proteina test </td><td> Thermo Scientific </td><td> 23227 </td></tr><tr><td> Colonna a fase inversa </td><td> Obj Nuovocace </td><td> PFC7515-B14-10 </td></tr><tr><td> Bioworks Browser </td><td> Thermo Scientific </td><td></td></tr></tbody></table>

analisi quantitativa di proteomi cromatina nella malattia

Quantitative Analysis of Chromatin Proteomes in Disease

Nel nucleo risiedono le proteomi le cui funzioni sono più intimamente collegati con regolazione genica. Adulto nuclei cardiomiociti mammiferi sono unici a causa della elevata percentuale di cellule binucleated, 1 lo stato prevalentemente eterocromatico del DNA, e la non divisione natura del cardiomiociti che rende nuclei adulto in uno stato permanente di interfase. 2 Regolazione trascrizionale durante lo sviluppo e la malattia sono stati ben studiati in questo organo, 3-5 ma ciò che rimane relativamente inesplorato è il ruolo svolto dalle proteine ​​nucleari responsabili per il confezionamento del DNA e di espressione, e di come queste proteine ​​controllare i cambiamenti nei programmi trascrizionali che si verificano durante la malattia. 6 Nella sviluppato mondo, la malattia di cuore è la causa numero uno di mortalità sia per gli uomini e le donne. 7 Insight su come proteine ​​nucleari cooperano per regolare la progressione di questa malattia è fondamentale per far progredire l&#39;attuale trattamento opzioni. La spettrometria di massa è lo strumento ideale per affrontare queste domande in quanto permette una annotazione imparziale della quantificazione nucleare proteoma e relativo per come l&#39;abbondanza di queste proteine ​​cambiamenti con la malattia. Mentre ci sono stati diversi studi di proteomica per mammiferi complessi proteici nucleari, 8-13 fino a poco tempo 14 vi è stato un solo studio che esamina la proteoma cardiaco nucleare, ed è considerato il nucleo intero, piuttosto che esplorare il proteoma a livello di compartimenti sub nucleari . 15 In gran parte, questa carenza di lavoro è dovuta alla difficoltà di isolare nuclei cardiaca. Nuclei cardiaca avvenire entro un rigido e denso actina-miosina dell&#39;apparecchio a cui sono collegati tramite estensioni multiple dal reticolo endoplasmatico, nella misura in cui altera contrazione miociti loro forma complessiva. 16 Inoltre, cardiomiociti sono il 40% in volume mitocondri 17 che necessitates arricchimento del nucleo parte le altri organelli. Qui si descrive un protocollo per cardiaca arricchimento nucleare e ulteriore frazionamento in compartimenti biologicamente rilevanti. Inoltre, i metodi di dettaglio per l&#39;etichetta senza dissezione massa quantitativa spettrometria di queste frazioni-tecniche suscettibili di sperimentazione in vivo in vari modelli animali e sistemi di organi in cui marcatura metabolica non è fattibile.

Figura 4 mette in evidenza l&#39;utilità di questa forma di quantificazione relativa. Mostrata nel pannello di sinistra sono i singoli picchi peptide monoisotopico (sovrapposto da diversi tipi di mouse), che sono state designate come appartenenti alla proteina HMGB1 (identificato tramite ricerca nel database). Ogni picco, essenzialmente un cromatografo ionico estratta per il dato peptide, proviene da un mouse diverso. I gruppi rappresentano tre diversi stati fisiologici: basale, l&#39;ipertrofia cardiac...

I progressi nella spettrometria di massa hanno permesso l&#39;analisi ad alta velocità di espressione della proteina e la modifica in una miriade di tessuti. In combinazione con frazionamento subcellulare e modelli di malattia, di massa quantitativa spettrometria e bioinformatica può rivelare nuove proprietà nei sistemi biologici. Il metodo qui descritto analizza cromatina proteine ​​associate alla regolazione di malattie cardiache ed è facilmente applicabile ad altre<em&gt; In vivo</em&gt; Modelli di malattie umane.

Analisi quantitativa di proteomi cromatina nella malattia

Nel nucleo risiedono i proteomi le cui funzioni sono più strettamente legate alla regolazione genica. I nuclei dei cardiomiociti di mammifero adulti sono unici a causa di...

L'obiettivo generale di questa procedura è isolare le proteine legate alla cromatina dal cuore del topo. Questo viene ottenuto innanzitutto omogeneizzando il cuore e quindi isolando i nuclei cardiaci mediante un gradiente di densità al saccarosio. Successivamente, il nucleoplasma viene separato dalla frazione cromatinica.Successivamente, le proteine vengono estratte dal pellet di cromatina per arricchire quelle legate debolmente al DNA. Infine, le proteine vengono estratte da un pellet di cromatina differente per arricchire quelle legate strettamente al DNA. In ultima analisi, è possibile ottenere risultati che mostrano le caratteristiche del proteoma nucleare in diverse condizioni fisiologiche mediante analisi spettrometrica di massa quantitativa senza etichette.Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo cardiaco, ad esempio in che modo la rimodellazione della cromatina contribuisce all'ipertrofia e all'insufficienza cardiaca. Dopo aver sacrificato un topo adulto ed escisso il cuore, sciacquarlo in PBS freddo di ghiaccio. Successivamente, posizionarlo in un mortaio di vetro con due millilitri di buffer di lisi contenente una miscela di inibitori di proteasi e fosfatasi ed omogeneizzarlo.Versare i lisati attraverso un setaccio da 100 micron e raccogliere il filtrato in una provetta da 1,5 millilitri; da questo punto in avanti, a meno che non sia diversamente specificato, mantenere il campione sul ghiaccio. Centrifugare il campione a 4.000 giri al minuto per cinque minuti a quattro gradi Celsius. Raccogliere il soprannatante contenente il citosol e conservarlo a meno 80 gradi Celsius.Si ricostituisce il pellet in 200 microlitri di tampone di lisi. Si aggiunge un millilitro di tampone al saccarosio in un nuovo tubo e si sovrappone delicatamente il pellet ricostituito sul cuscinetto di saccarosio utilizzando una pipetta trasferibile; si centrifuga a 5.000 giri/min per 10 minuti a quattro gradi Celsius. Si rimuove la pellicola superficiale e il cuscinetto di saccarosio, che contiene la membrana.Risciacquare il pellet residuo contenente i nuclei con 200 microlitri di tampone P-B-S-E-D-T-A freddo di ghiaccio, quindi risospendere il pellet contenente i nuclei in 200 microlitri di tampone di estrazione con detergente e sottoporre il campione a vortex due volte per 10 secondi ciascuna. Lasciare il campione in ghiaccio per 10 minuti, quindi centrifugare a 13.000 giri/min per cinque minuti a quattro gradi Celsius. Rimuovere il soprannatante contenente le proteine nucleoplasmatiche e conservarlo a meno 80 gradi Celsius.Risciacquare i pellet con P-B-S-E-D-T-A freddo di ghiaccio e risospendere in 300 microlitri di buffer Tris, S-D-S-E-D-T-A. Sonicare il campione da tre a sei volte per 10 secondi ciascuna. Per frammentare il DNA, mantenere il campione sul ghiaccio tra una sonicazione e l'altra, quindi centrifugare a 13.000 giri/min per cinque minuti a quattro gradi Celsius.Mantenere il soprannatante contenente la proteina isolata e conservarlo a meno 80 gradi Celsius per arricchire proteine come le istoni, strettamente legate al DNA. Eseguire una frazionamento separato per isolare il cromosoma, partendo da un cuore adulto isolato o da cardiomiociti di ratto PARPs. Triturare il pellet di cromatina in 400 microlitri di acido solforico 0,4 N ed eseguire un vortex. Per rimuovere gli aggregati, ruotare il campione a quattro gradi Celsius per 30 minuti o durante la notte; dopo l'incubazione, rimuovere i detriti nucleari centrifugando a 16.000 G per 10 minuti a quattro gradi Celsius.Trasferire il soprannatante in una provetta pulita e aggiungere goccia a goccia 132 microlitri di acido tricloroacetico al campione. Capovolgere la provetta diverse volte e incubare sul ghiaccio per 30 minuti. Dopo la centrifugazione, scartare il soprannatante e utilizzare acetone freddo di ghiaccio per risciacquare delicatamente il pellet contenente le istoni, quindi centrifugare.Ripetere nuovamente il lavaggio con acetone, quindi lavare ed essiccare il pellet all'aria prima di risospendendolo in 100 microlitri di buffer Tris-S-DS-EDTA. Utilizzare Tris 1 M per aggiustare il pH a otto.Sonicare il campione in un bagno ad ultrasuoni per 15 minuti. Conservare il campione a meno 80 gradi Celsius. Utilizzare la spettrometria di massa per eseguire analisi finalizzate a determinare la purezza e a identificare le proteine mostrate in questo caso.I cromatogrammi estratti delle ionizzazioni sovrapposti per un singolo peptide mappato sulla proteina HMGB1. Ogni cromatogramma proviene da un campione di cromatina diverso ed è codificato con colori differenti per rappresentare lo stato fisiologico del topo da cui il campione è stato ottenuto. Sono stati analizzati tre replicati biologici per ciascuna delle condizioni fisiologiche, stato basale, ipertrofia cardiaca e scompenso cardiaco, con ogni campione analizzato due volte, per un totale di 18 cromatogrammi.Integrando l'area sotto la curva, è possibile determinare l'abbondanza relativa per ciascun replicato. In questo pannello, i sei replicati sono stati mediati per ciascuna delle tre condizioni fisiologiche al fine di ottenere valori complessivi di abbondanza. Da questa analisi risulta evidente che l'abbondanza di HGB uno cambia nel corso della malattia, come mostrato qui.Lo spettro di frammentazione per questo peptide conferma la sua sequenza di aminoacidi e permette di mapparlo alla proteina HMGB1. In contrasto, la quantificazione di un peptide diverso della proteina istonica H4 mostra che la sua abbondanza non cambia con la malattia. Possiamo analizzare la riproducibilità delle variazioni nell'abbondanza dei peptide osservate tra gli diversi stati fisiologici mediante analisi statistica.Innanzitutto, l'abbondanza di tutti i peptidi identificati in ogni replica viene sottoposta ad anova, seguita da un'analisi delle componenti principali o PCA. Il raggruppamento sia delle repliche tecniche che biologiche in questo grafico conferma che le variazioni di abbondanza rilevate mediante spettrometria di massa sono coerenti e riproducibili tra i diversi stati patologici. Basale in blu, ipertrofia in rosso, scompenso in verde. Di uguale importanza rispetto alla quantificazione e riproducibilità dei risultati è l'aumento della copertura del proteoma nucleare reso possibile dalla sottofrazionamento nucleare.Questa figura illustra che l'analisi dell'intero nucleo da solo non riesce a identificare nemmeno la maggioranza delle proteine nucleari rilevate combinando l'analisi individuale dei singoli compartimenti. Inoltre, l'overlap moderato tra le diverse frazioni dimostra la rilevanza biologica del considerare tali compartimenti singolarmente, per ottenere ulteriori informazioni sulla funzione nucleare e sulla regolazione genica. Infine, la capacità di frazionare in modo specifico i cromosomi estratti con acido o con detergenti arricchisce per proteine strutturali chiave della cromatina, come le istoni, consentendo così un'analisi più mirata mediante spettrometria di massa su un gruppo di proteine senza richiedere anticorpi specifici per ciascuna variante e isoforma. Durante l'esecuzione di questa procedura, è importante ricordare di mantenere liberi da contaminazione da cheratina tutti i campioni che verranno analizzati mediante spettrometria di massa.Questo è particolarmente importante nei passaggi successivi dopo l'isolamento della proteina.

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Qui stiamo presentando un immunoprecipitazione della cromatina (ChIP) procedura per la genoma analisi posizione di isoforme di proteine ​​che si differenziano in un istone-dominio di legame. Lo stiamo applicando a ChIP-Seq analisi per identificare gli obiettivi del demetilasi KDM5A/JARID1A/RBP2 istoni.

Genoma Analisi mediante ChIP per identificare Isoform obiettivi specifici per Gene

La combinazione di immunoprecipitazione della cromatina e sequenziamento ultra-high-throughput (ChIP-seq) in grado di identificare e mappare le interazioni proteina-DNA in una determinata linea di tessuti o cellule. Delineato è come generare un modello di chip per la successiva sequenza di alta qualità, utilizzando l'esperienza con il fattore di trascrizione TCF7L2 come esempio.

Generazione di immunoprecipitazione della cromatina Template DNA di alta qualità per high-throughput sequencing (ChIP-Seq)

Combinando nativa e reticolazione cromatina immunoprecipitazione con alta risoluzione di Spettrometria di Massa, l'approccio ChroP permette di sezionare il composito dell'architettura proteomica delle modificazioni degli istoni, le varianti e le proteine ​​non istoniche Synergizing a domini di cromatina funzionalmente distinte.

L&#39;approccio ChroP Combina ChIP e Spettrometria di Massa a sezionare Locus-specifiche proteomica Paesaggi della cromatina

Estrazione del sale sequenziale delle proteine della cromatina associata è uno strumento utile per determinare le proprietà di associazione dei complessi della proteina grande. Questo metodo può essere impiegato per valutare il ruolo delle singole subunità o domini dell'affinità complessiva di una proteina complessa di massa della cromatina.

Estrazioni sequenziale sale per l'analisi di massa di cromatina associazione proprietà di complessi di rimodellamento della cromatina

Qui, descriviamo un'immunoprecipitazione della cromatina (ChIP) e il protocollo di preparazione libreria ChIP-seq per generare profili epigenomic globale da campioni di embrionali di pollo di basso-abbondanza.

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Qui, descriviamo un protocollo di ChIP-sequenziamento high throughput ottimizzato e pipeline di analisi computazionali per la determinazione dei modelli di stato della cromatina genoma da tessuti tumorali congelati e linee cellulari.

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