Allevamento e iniezione di

L'obiettivo generale di questa procedura è valutare la patogenicità batterica nei confronti delle larve di insetto utilizzando manduka seca come organismo modello. Questo viene ottenuto innanzitutto allevando le larve di insetto a partire da uova sterili fino alla fase di sviluppo del quarto stadio larvale. Nel secondo passaggio, i campioni batterici vengono preparati per l'iniezione.

Successivamente, i batteri vengono iniettati nelle larve di manduca seca al quarto stadio. Nell'ultima fase, viene monitorata la morte degli insetti nel tempo successivamente all'iniezione. Infine, il tempo necessario alla morte degli insetti viene registrato e utilizzato per valutare la virulenza batterica.

Questo metodo può contribuire a indagare aspetti fondamentali nel campo della simbiosi, tra cui la scoperta di nuovi patogeni degli insetti e la determinazione delle differenze di virulenza tra specie o ceppi batterici. Iniziare autoclavando 15 grammi di trivella in 900-1000 millilitri di acqua. Immediatamente dopo l'autoclavatura.

Mescolare la farina con 166 grammi di dieta a base di germe di grano. In un frullatore da laboratorio, versare la dieta per insetti frullata in una pietanza. Una volta raffreddata, trasferire la dieta dalla pietanza a un pezzo di carta d'alluminio.

Avvolgerlo strettamente e conservarlo a quattro gradi Celsius. Al ricevimento, posizionare le uova di M sex in un supporto per filtro di vetro e un impianto con imbuto a vuoto dotato di carta da filtro da 90 millimetri. Quindi versare 250 millilitri di soluzione di ipoclorito al 0,6% sulle uova per due o tre minuti, mescolando occasionalmente.

Ora accendere il vuoto per drenare la soluzione di candeggina, quindi lavare le uova sterilizzate da tre a quattro volte con 250 millilitri di acqua distillata sterile per ogni lavaggio. Successivamente, posizionare un nuovo pezzo di carta da filtro da 90 millimetri nel coperchio di una piastra di Petri, quindi trasferire le uova sulla carta da filtro per farle asciugare in una cappa a flusso laminare fino a quando non aderiscono più tra loro. Ora posizionare la dieta per insetti recentemente preparata sopra un tappo di gomma fissato in diversi contenitori di plastica e trasferire circa 40 uova in ciascun contenitore, separando le uova dalla dieta per prevenire contaminazioni fungine indotte dall'umidità.

Mantenere le uova a 26 gradi Celsius con un fotoperiodo di 16 ore di luce e 8 ore di buio. Le uova diventeranno più chiare, assumendo un colore bianco giallastro, poco prima della schiusa, che a quel punto sarà completa. Utilizzando pinze, prendere ciascun larva dall'appendice nera allungata e trasferire con attenzione circa 25 larve in ciascun nuovo contenitore con l'alimento sul fondo.

Incubare le larve per due giorni nelle stesse condizioni previste per le uova; sebbene la morte larvale sia insolita in questa fase, potrebbero essere osservate alcune larve morte o più probabilmente con sviluppo arrestato. Trasferire ora le larve in contenitori individuali con piccoli pezzi di cibo per evitare comportamenti cannibalistici e incubarle nuovamente. Sostituire il cibo ed eliminare le feci dai contenitori ogni due giorni fino a quando gli insetti non subiscono la terza muta larvale.

La terza muta larvale corrisponde alla quarta fase larvale caratterizzata dall'aspetto di uncini neri simili a ganci su ciascun prolo e da una maggiore evidenza delle strisce lungo il corpo dell'insetto. Dopo aver coltivato i ceppi batterici da testare, centrifugare 500 microlitri di ciascun ceppo batterico per due minuti in una microcentrifuga a 17.000 ×g a temperatura ambiente. Successivamente, lavare i pellet in un millilitro di PBS sterile nelle stesse condizioni.

Dopo aver risospeso le cellule in un altro mezzo millilitro di PBS sterile, misurare la densità ottica delle sospensioni prima di iniziare le iniezioni, utilizzando una punta di pipetta nuova per ogni diluizione; preparare sei diluizioni seriali decimali del primo ceppo batterico in PBS sterile in una piastra microtitolata da 96 pozzetti. Ora depositare 10 microlitri di ciascuna diluizione, da 10 alla meno due a 10 alla meno sei, lungo il bordo superiore di una piastra di Petri contenente il mezzo di crescita appropriato. Successivamente, inclinare la piastra in modo che le gocce si espandano verso il centro.

Successivamente, dopo aver rimosso l'alimento e le feci degli insetti, posizionare i contenitori degli insetti sul ghiaccio per circa cinque minuti, mentre gli insetti si raffreddano. Sciacquare un ago per siringa tre volte in ciascuna di due provette contenenti etanolo al 70-100%, seguito da una provetta di acqua sterile. Quindi utilizzare un citometro ematico per quantificare le sospensioni cellulari diluite al microscopio.

A seconda dell'inoculo desiderato, prelevare 10 microlitri dal microtiter appropriato. Quindi strofinare la superficie dell'insetto da iniettare con etanolo al 95%. Risulta particolarmente difficile mantenere l'insetto nella posizione corretta per l'iniezione, mentre si manovra l'ago e si fa attenzione a non perforare l'intestino dell'insetto.

Inoltre, lavorare con rapidità per evitare che l'insetto si riscaldi e cominci a divincolarsi mentre lo si tiene per l'iniezione. Iniettare la sospensione cellulare di 10 microlitri nell'insetto con un angolo inferiore a 45 gradi dietro una delle zampe pro-toraciche addominali. Facendo attenzione a non perforare l'intestino, iniettare il contenuto appena al di sotto del livello epidermico.

Dopo aver iniettato ciascun insetto con il primo ceppo batterico, piastrare nuovamente le diluizioni da 10 alla meno due a 10 alla meno sei, questa volta al centro della piastra. Lasciarle scorrere verso il fondo della piastra. Incubare quindi le piastre alla temperatura appropriata e successivamente contare le colonie per enumerare l'inoculo.

Dopo aver ripetuto il processo di diluizione, semina su piastra e iniezione per ogni ceppo batterico, inoculare da tre a cinque insetti con PBS sterile per il gruppo di controllo negativo. Successivamente, incubare tutti gli insetti a 26 gradi Celsius con un fotoperiodo di 16 ore di luce e 8 ore di buio. Infine, monitorare la sopravvivenza degli insetti nel tempo dopo le iniezioni; gli insetti spesso manifestano perdita di appetito, diarrea acquosa di colore giallo, escrezioni e/o perdita di acqua durante l'infezione, prima della morte.

La morte dell'insetto è definita come l'assenza di movimento volontario in risposta a uno stimolo. In questo saggio, gli insetti sono stati iniettati con circa 50 unità formanti colonie di ceppi selvatici oppure mutanti attenuati di Xer Haus NLA groan in fase di crescita da iniziale a logaritmica. Gli insetti sono stati osservati per circa 72 ore e la percentuale di insetti iniettati ancora vivi in ogni punto temporale è stata registrata.

In questo esperimento, il ceppo attenuato ha mostrato un evidente ritardo nell'uccisione degli insetti, mentre il ceppo di tipo selvaggio ha ucciso tutti e sei i larvi entro 30 ore dal trattamento, prima ancora che si verificasse la morte di qualsiasi larva infettata con il mutante. I dati sono statisticamente distinti seguendo questa procedura. Altri metodi, come l'estrazione di RNA e la reazione a catena della polimerasi quantitativa in tempo reale, possono essere eseguiti per rispondere ad ulteriori domande, ad esempio determinare se il batterio sia in grado o meno di manipolare la risposta immunitaria dell'insetto.