Name: Saggio di placca per Norovirus Murine (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-08-22T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 53 s
Description: Impara il saggio di placca per quantificare particelle infettive di norovirus murino utilizzando macrofagi murini RAW 264.7. Questo metodo standard supporta la ricerca virologica sulle dinamiche di infezione.

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Ringraziamo i membri del laboratorio Wobus per i commenti critici e suggerimenti. Il lavoro nel laboratorio di CEW è stato finanziato da fondi di start-up presso la University of Michigan, una borsa di sviluppo di carriera dal NIH / NIAID Centro Regionale di Eccellenza per la Bio-difesa e di ricerca emergenti Malattie Infettive (RCE) Programma, Regione V &#39;Grande Laghi &#39;RCE (NIH aggiudicazione 1-U54-AI-057153) e NIH R01 AI080611. MBG-H. è stato finanziato dalla Immunologia Sperimentale (NIH T32 A1007413-16) e dei meccanismi molecolari nella patogenesi microbica (NIH T32 A1007528) borse di formazione per l&#39;Università del Michigan. JBC è stato finanziato dalla coordenação de aperfeiçoamento de Pessoal de Nivel Superior (CAPES), Brasilia, Brasile.

1. Coltura della linea cellulare di macrofago RAW 264,7 <ol><li> Mantenere cellule RAW 264,7 (ATCC, catalogo # TIB-71) in DMEM-10 media, che consiste di glucosio DMEM alto con 10% (v / v) a bassa endotossina siero fetale bovino (&lt;10 EU / ml), 10 mM HEPES , 100 U / ml di penicillina, 100 ug / ml streptomicina, 1 mM aminoacidi non essenziali, 2 mM L-glutammina. Cellule sono tipicamente mantenuti in fiasche tessuto 175 cm 2 coltura contenenti 35 ml di mezzo per pallone e incubate a 37 ° C e 5% di CO 2 in un incubatore di coltura tissutale. Tuttavia, qualsiasi dimensione pallone può essere utilizzato con un volume di mezzi appropriati per la dimensione del pallone. </li><li> Per dividere le celle: aspirare fuori vecchi media, aggiungere 10 ml di DMEM fresco-10 supporto alle cellule, e poi raschiare le cellule dal fondo del pallone utilizzando un raschietto cellula. Avanti, risospendere le cellule in una soluzione omogenea mediante l&#39;elaborazione di celle in una pipetta da 10 ml e con forza spremitura delle cellule attraverso la punta della pipetta pressed contro il fondo del pallone. Ripetere questa operazione almeno 3 volte in modo che le cellule non sono più ammassarsi. Verificare mediante microscopia ottica che una sospensione singola cella è stato generato. Poi trasferire 1 ml (diluizione 1:10 o ~ 1x10 7 cellule) - 2 ml (diluizione 1:5 o ~ 2x10 7 cellule) della sospensione cellulare a un nuovo pallone da 2 175 centimetri, e portare il volume finale di supporti fino a 35 ml. </li><li> Le celle divise quando sono quasi confluenti (~ 1x10 8 celle total/175 cm 2 flaconi): ogni tre giorni se a partire da una diluizione 1:10, o ogni due giorni se a partire da una diluizione 1:5. Utilizzare microscopia ottica per controllare la morfologia cellulare prima divisione delle celle. La maggior parte delle cellule dovrebbe essere rotonda e non attivata. Cellule attivate hanno granuli e / o estese, esile morfologia con appendici. Non lasciate proliferare cellule come quelle cellule in genere non formare placche. Tenere traccia del numero di passaggio e spesso ricominciare da scongelare un&#39;aliquota passaggio inferiore di cellule. (Usiamo passaggio 30 come un cut-off). </li></ol> 2. Infect RAW 264,7 cellule con MNV inoculo <ol><li> Seed RAW 264,7 cellule in piastre da 6 pozzetti (diametro 3,5 cm) ad una densità di 1x10 6 cellule vitali / ml in DMEM-10 media, e aggiungere 2 ml di questa sospensione in ciascun pozzetto. È importante distribuire uniformemente cellule in pozzetti mediante piastre oscillare manualmente almeno 10 volte o utilizzando un apparecchio a dondolo per ~ 10 min. Non agitare il piastre come questo farà sì che le cellule a raggrupparsi al centro del pozzo. Piastre luogo in un incubatore di coltura tissutale (a 37 ° C e 5% CO 2). Permettere alle cellule di allegare notte o per almeno 4 ore a 37 ° C. Cellule dovrebbe essere di 60 - 80% confluenti per il saggio di placca e distribuiti uniformemente in tutto il pozzetto. </li><li> Il giorno successivo, preparare l&#39;inoculo del virus, che può essere da MNV cellule infettate in coltura o da tessuti omogeneizzati o campioni fecali di MNV topi infettati. Quando si utilizzano campioni di tessuto, pisello piECEs di tessuti vengono omogeneizzati in 2 ml con tappo a vite provette sterili contenenti sfere di silice in 1 ml di DMEM-10 usando un omogeneizzatore tessuto (MagnaLyser eg; Roche). Per i campioni di feci, non più di 3 palline fecali devono essere omogeneizzati in 1 dei media ml. Tutti i campioni vengono poi congelati (a -80 ° C) e una volta scongelati prima di effettuare il saggio di placca. </li><li> 10 Preparare diluizioni del virus inoculo in DMEM completo-5 medie, che consiste di DMEM / glucosio Alto, 5% (v / v) a bassa endotossina siero bovino fetale (&lt;10 EU / ml), 10 mM HEPES, 100 U / ml di penicillina, 100 ug / ml streptomicina, 1 mM aminoacidi non essenziali, 2 mM L-glutammina. </li><li> Diluizioni seriali di dieci volte vengono preparati in piastre da 24 pozzetti: Una pipetta ripetitore viene usato per erogare supporto 1,35 ml per pozzetti multipli, la diluizione 10 -1 è ottenuto miscelando 1,35 ml di media e 0,15 ml di campione contenente virus, e poi 0,15 ml della diluizione 10 -1 è aggiunto 1,35 ml di mezzi per rendere il 10 -2 dilution e così via. E &#39;importante cambiare gli aghi ogni volta che si effettua una nuova diluizione. Una pipetta multicanale può essere usato per fare le diluizioni di campioni multipli contemporaneamente con due punte raccordo in un pozzetto di una piastra a 24 pozzetti trasferire un volume totale di 0,15 ml per pozzetto (vedi Figura 3A). </li><li> Una gamma di diluizione tipico per omogenati di tessuto e contenuti fecali è 10 -1 a 10 -3. Tuttavia, placche da questi campioni tendono ad essere più piccoli rispetto a quelli da campioni di coltura tissutale. Inoltre, in alcuni casi una diluizione 1:100 di campioni di feci è necessaria per diluire sufficientemente eventuali componenti tossici delle feci che possono disturbare il monostrato di cellule, impedendo la capacità di contare placche. La gamma di diluizione di lisato di coltura tissutale dipende dal punto di tempo di interesse durante il ciclo vitale del virus. Le diluizioni che vanno fino a 10 -9 possono essere necessarie al picco di infezione. </li><li> Dopo le diluizioni seriali vengono preparati, etichettare la piastra da 6 pozzettis contenente RAW 264,7 monostrati (a partire da sezione 2.1) con il nome del campione e diluizioni di essere placcato. Una piastra alla volta, rimuovere tutti i supporti muovendo fuori o aspirazione esso. Subito dopo aggiungere 0,5 ml di un campione diluito a un bene, poi ripetere con un duplicato bene, prima di procedere alla diluizione successiva. Una volta che tutti e 3 diluizioni vengono aggiunti a una piastra, piastra inclinazione in avanti e indietro con le mani per assicurare tutte le cellule sono state coperte. Gestire una piastra alla volta per assicurarsi che le cellule non si secchino. </li><li> Dopo aggiunta di 0,5 ml delle diluizioni in ogni pozzetto, impilare piastre eretta e incubare per 1 ora a temperatura ambiente. Poiché il volume aggiunto a ciascun pozzetto non è sufficiente a coprire completamente il monostrato, le piastre devono essere leggermente inclinato in avanti e indietro manualmente ogni 10-15 minuti o posto su un apparecchio a dondolo (~ 18 oscillazioni al minuto). Questo impedisce alle cellule di essiccazione. </li></ol> 3. Basso punto di fusione agarosio (SeaPlaque) Preparazione Overlay <p class = &quot;jove_content&quot;&gt; Nota: è consigliabile avere diverse bottiglie con autoclavato SeaPlaque agarosio preparato in anticipo. Agarosio può essere rifuso in un forno a microonde prima dell&#39;uso. <ol><li> Calcolare la quantità di sovrapposizione necessaria per il volume totale di piastre prima incubazione 1 ora è completa. Il volume necessario è di 2 ml / pozzetto o 12 piastra ml/6-well. Preparare agarosio (vedi paragrafo 3.2) e dei media (vedi sezione 3.3) a parte. </li><li> Per preparare l&#39;agarosio, 3 g di sospendere SeaPlaque agarosio in un volume totale di 100 ml di acqua distillata (3% w / v) in una bottiglia di vetro. Autoclave per 20-30 min. (Se agarosio è stato già preparato prima mano, re-melt agarosio in microonde.) È importante equilibrare SeaPlaque agarosio a 42 ° C in un bagno di acqua prima dell&#39;uso perché se l&#39;agarosio è troppo caldo, ucciderà le cellule. Assicurarsi che il livello dell&#39;acqua è uguale o superiore al livello di agarosio per evitare la solidificazione indesiderato. </li><li> Preparare il dispositivo: fare 100 ml di MEM 2x supporti, che consiste2x MEM, 10% (v / v) a bassa endotossina siero bovino fetale (&lt;10 EU / ml), 10 mM di HEPES, 100 U / ml di penicillina, 100 ug / ml streptomicina, 4 mM di L-glutammina. Equilibrare supporti a 37 ° C in un bagno d&#39;acqua. </li><li> Mescolare sia il SeaPlaque agarosio ei media MEM 2x insieme in una bottiglia sterile con un rapporto 1:1 immediatamente prima sovrapponendo i monostrati di cellule infette. Se più di 200 ml di sovrapposizione è necessaria, volume diviso in più bottiglie e tenere a 37 ° C in bagno di acqua fino al momento dell&#39;uso. </li><li> Al termine della incubazione 1 ora (vedi sezione 2.7), aspirare l&#39;inoculo off di ciascun pozzetto. Lentamente aggiungere 2 ml di sovrapposizione al bordo di ciascun pozzetto posizionando la punta della pipetta contro la parete di ogni pozzetto. Fino a 5 piastre può essere trattato simultaneamente senza cellule essiccazione. </li><li> Consentire la sovrapposizione solidificare per circa 10 min a temperatura ambiente prima di piastre montante nel tessuto incubatore. Incubare le piastre per 48 ore a 37 ° C in 5% CO 2. </li><li> Dopoil periodo di incubazione, le placche sono debolmente visibili ad occhio nudo, in modo da controllare le piastre non marcate per presenza di placche. Se non placche sono visibili, incubare per ulteriori 4 ore e controllare di nuovo. Tuttavia, il tempo di incubazione massimo non dovrebbe superare 72 ore. </li></ol> 4. Visualizzazione di placche da Neutral colorazione Red <ol><li> Per visualizzare placche, la soluzione neutra colorazione rossa viene preparato aggiungendo 3 ml di rosso neutro (0,33% w / v in DPBS, Sigma, catalogo # N2889) per ogni 97 ml di PBS 1x (coltura tissutale grade, Mg 2 + -, Ca 2 + - gratuito; Gibco, catalogo # 10010). Calcolare il volume di soluzione colorante rosso neutro necessario per l&#39;esperimento: 12 ml di soluzione neutra colorazione rossa sono obbligatori per ogni piastra da 6 pozzetti. Quindi, aggiungere 2 ml a ciascun pozzetto. Sebbene alcuni protocolli placca test richiedono il plug agarosio essere rimosso dai pozzetti, in questo protocollo soluzione neutra colorazione rossa viene aggiunto direttamente sulla sovrapposizione. </li><li> Dopo un hr uno incubation a 37 ° C, controllare se le placche sono visibili con neutro soluzione colorante rosso ancora in pozzi. Se placche non sono immediatamente evidenti, permettono la colorazione di continuare per un&#39;altra ora. Continuare l&#39;incubazione fino a placche sono visibili. (Nota:. Colorazione per più di 3 ore non è ottimale e se non placche sono visibili nel campione di controllo positivo dopo 3 h di colorazione, il saggio di placca non funzionava correttamente) Dopo la colorazione è completa, aspirare la soluzione di colorazione rosso neutro , garantendo la spina agarosio non è disturbato, e poi procedere a contare le placche. </li><li> Contare placche mettendo piatto a testa in giù su una scatola di luce e segna un punto su placche contati per evitare la conta duplicati. Scegliere la diluizione di contare placche nei pozzi in cui placche sono chiaramente separati (vale a dire senza la prova visiva di fusione placche insieme). Se possibile, contano placche a due diluizioni. È importante notare che la dimensione di placca può variare tra ceppi MNV, inoculo del virus, e dipende dallacondizione delle RAW 264,7 cellule durante il saggio di placca. </li><li> Se non sono visibili placche in un pozzo, o non c&#39;era virus presente nel campione o la quantità di virus è sotto il limite di rilevazione del saggio di placca. In questo caso, i pozzetti macchia rossa con un colore simile a placche contenenti altri pozzetti. In alternativa, l&#39;assenza di placche si osserva anche quando ci sono troppe particelle virali presenti in una data diluizione. Questo porta alla lisi del monostrato intero e pozzi appaiono arancione / colore giallo. </li><li> Calcolare i titoli virali. Aggiungere il numero di placche sia in pozzi a una singola diluizione e moltiplicare per il fattore di diluizione (cioè 1 ml se 2 pozzi sono infettate con 0,5 ml). Ciò produrrà la quantità di unità formanti placche (PFU) nel volume di inoculo di 1 ml. Ad esempio, in figura 4 alla diluizione 10 -2, un pozzetto (marcato &quot;II&quot;) ha 14 placche e ben altra (contrassegnata &quot;V&quot;) ha 17 placche. Così, il titolo virale sarà 14x10 17x10 2 + 2 = 3100 (3.1x10 3) pfu / ml. </li></ol> 5. Risultati rappresentativi Infettive MNV-1 particelle può essere quantificato utilizzando un saggio di placca come illustrato schematicamente nella figura 1. Figura 2A mostra un pozzo con un monostrato di cellule RAW 264,7 poco prima dell&#39;infezione, mentre la figura 2B mostra tre placche visibili indicati dai numeri romani I, II e III in un pozzo. Singole fasi del saggio sono rappresentati nelle figure 3A a F. La Figura 3A mostra la preparazione di 10-fold serie di diluizioni di un campione contenente virus. Figura 3B mostra il trasferimento di diluizioni per duplicare i pozzetti di una piastra da 6 pozzetti. Figura 3C mostra l&#39;apparato dondolo usato per incubare le cellule RAW 264,7 con l&#39;inoculo a temperatura ambiente per 1 ora la figura 3D mostra celle essendo sovrapposto al SeaPlaque:. MEMmiscela. Figura 3E mostra una piastra a temperatura ambiente per permettere la sovrapposizione di solidificare, mentre la figura 3F mostra cellule di essere trattata con un 0,01% soluzione rosso neutro 48 ore più tardi. Dopo colorazione delle cellule per 1-3 ore e aspirando la soluzione neutra colorazione rossa, placche sono visibili e possono essere contati (Figura 4). <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/4297/4297fig1.jpg" /> Figura 1. Schema del protocollo di saggio di placca MNV. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/4297/4297fig2.jpg" /> Figura 2. Immagini rappresentative di un pozzo di un monostrato prima infezione e dopo la formazione di placche. A) RAW 264,7 cellule sono state coltivate durante la notte e con immagini al microscopio ottico a 20x. B) Le cellule sono state colorate con una soluzione allo 0,01% di rosso neutro dopo 48 hr di infezione e visualizzati sotto un microscopio ottico con ingrandimento 4x. Numeri romani I, II, e III indicano tre placche visibili. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/4297/4297fig3.jpg" /> Figura 3. Immagini rappresentative delle varie fasi saggio di placca. A) MNV-1 &#39;inoculo va preparato in 10 diluizioni. B) si aggiunge inoculo monostrati di cellule in pozzetti in duplicato. C) Cellule e inoculo incubate agitando per 1 ora a temperatura ambiente. D) Le cellule sono sovrapposti con una miscela 1:1 di SeaPlaque agarosio e 2x MEM media. E) Le piastre vengono incubate per 10 min a temperatura ambiente per permettere la sovrapposizione di solidificare. F) La colorazione delle cellule con la soluzione di colorazione rosso neutro 48 ore post-infezione. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/4297/4297fig4.jpg" /> Figura 4. Targhe MNV-1 forme in cella monoLayers. Qui è un rappresentante piatto saggio di placca a 48 ore dopo l&#39;infezione, che mostra placche colorate con neutro soluzione colorante rosso dopo 1 ora di incubazione. La tavola mostra i pozzetti in duplicato di tre 10-diluizioni. Wells etichettati con numeri romani I e IV corrispondenti alla diluizione 10-1, II e V corrispondono alla diluizione 10-2, III e VI corrispondono alla diluizione 10-3. Il titolo virale del campione è indicato di seguito (si veda la Sezione 4.5 per i dettagli del calcolo).

<ol><li>Wobus, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replication+of+Norovirus+in+cell+culture+reveals+a+tropism+for+dendritic+cells+and+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Replication of Norovirus in cell culture reveals a tropism for dendritic cells and macrophages.</a> PLoS Biol. 2, e432(2004).</li>
<li>Wobus, C. E., Thackray, L. B., Virgin, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Murine+norovirus%3A+a+model+system+to+study+norovirus+biology+and+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+virology%22%5BJournal%5D)">Murine norovirus: a model system to study norovirus biology and pathogenesis.</a> Journal of virology. 80, 5104-5112 (2006).</li>
<li>Condit, R. C. Ch. 2. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCondit%2C+RC+%22Fields+Virology%22">Fields Virology</a>. Knipe, D. M., Howley, P. M. 1, Lippincott Williams & Wilkins. 25-58 (2007).</li>
<li>Thackray, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Murine+noroviruses+comprising+a+single+genogroup+exhibit+biological+diversity+despite+limited+sequence+divergence%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+virology%22%5BJournal%5D)">Murine noroviruses comprising a single genogroup exhibit biological diversity despite limited sequence divergence.</a> Journal of virology. 81, 10460-10473 (2007).</li>
<li>Reed, L. J., Muench, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+for+estimating+50%25+endpoints%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Hygiene%22%5BJournal%5D)">A simple method for estimating 50% endpoints.</a> American Journal of Hygiene. 27, 493-497 (1932).</li>
<li>Chachu, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibody+is+critical+for+the+clearance+of+murine+norovirus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+virology%22%5BJournal%5D)">Antibody is critical for the clearance of murine norovirus infection.</a> Journal of virology. 82, 6610-6617 (2008).</li>
<li>Barron, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diversity+of+murine+norovirus+strains+isolated+from+asymptomatic+mice+of+different+genetic+backgrounds+within+a+single+U.S.+research+institute%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Diversity of murine norovirus strains isolated from asymptomatic mice of different genetic backgrounds within a single U.S. research institute.</a> PLoS ONE. 6, e21435(2011).</li>
<li>Cox, C., Cao, S., Lu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+detection+and+study+of+murine+norovirus-1+using+a+more+efficient+microglial+cell+line%5BTitle%5D)+AND+%22Virology+journal%22%5BJournal%5D)">Enhanced detection and study of murine norovirus-1 using a more efficient microglial cell line.</a> Virology journal. 6, 196(2009).</li>
<li>Cooper, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+plaque+assay+of+animal+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Virus+Res%22%5BJournal%5D)">The plaque assay of animal viruses.</a> Adv. Virus Res. 8, 319-378 (1961).</li>
<li>Hyde, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+norovirus+replication+is+associated+with+virus-induced+vesicle+clusters+originating+from+membranes+derived+from+the+secretory+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+virology%22%5BJournal%5D)">Mouse norovirus replication is associated with virus-induced vesicle clusters originating from membranes derived from the secretory pathway.</a> Journal of virology. 83, 9709-9719 (2009).</li>
<li>Simmonds, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioinformatic+and+functional+analysis+of+RNA+secondary+structure+elements+among+different+genera+of+human+and+animal+caliciviruses%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+acids+research%22%5BJournal%5D)">Bioinformatic and functional analysis of RNA secondary structure elements among different genera of human and animal caliciviruses.</a> Nucleic acids research. 36, 2530-2546 (2008).</li>
</ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Il metodo di analisi per la targa MNV-1 qui presentato è un modo di quantificare particelle infettive MNV. Seguendo la procedura del saggio illustrato in figura 3, si possono ottenere i titoli virali riproducibili. Il limite di rilevazione del test dipende dalla diluizione di partenza utilizzato. Quando si inizia con una diluizione 1:10 del campione come descritto sopra, il limite di rilevazione del saggio di placca è 10 pfu (cioè, 1 placca visibile a -1 10 diluizione). Poiché ogni placca rappresenta un singolo virus, il saggio di placca può anche essere usato per purificare popolazioni clonali di MNV sollevando placche isolate e moltiplicazione come descritto in precedenza 1. Inoltre, purificazioni placca può anche essere utilizzato per separare una singola popolazione virus da popolazioni miste virus. Una limitazione di utilizzo di un saggio di placca per la rivelazione di infezione MNV è che non tutti i ceppi MNV formare placche 4. Tuttavia, può essere possibile superare la inabilità di alcuni ceppi MNV, isolati da animali, per formare placche in modo seriale passaging questi virus in coltura 7. In alternativa al saggio di placca è misurare particelle infettive tramite TCID 50 tecnica 3, 4. Questo test quantifica la quantità di virus necessaria per produrre CPE nel 50% delle cellule del tessuto inoculate colture seguenti diluizioni endpoint e prende 1 settimana a completare per MNV 4. Oltre ad essere più lenta di un saggio di placca, la TCID 50 saggio è così sensibile (limite di rilevazione = 200 TCID 50 / ml) a causa della tossicità dei campioni di tessuto di cellule RAW 264,7 4. Anche se i passaggi critici nell&#39;ambito del protocollo sono stati descritti in tutto il protocollo, la sezione seguente fornisce una sintesi per facilitare la risoluzione dei problemi. La fase più critica del protocollo è quello di garantire che RAW 264,7 cellule rimangono vitali durante tutta la seduta di sostenere la replicazione del virus. Questo puòessere monitorato in ogni fase del test tramite microscopia ottica. La vitalità cellulare è assicurata in due modi. In primo luogo, si deve prestare attenzione a non far asciugare le cellule durante la manipolazione di lamiere. Così, le piastre vengono inoculati uno alla volta, scosso durante il periodo di infezione, e deve rimanere chiuso quando non sono stati trattati. In secondo luogo, le soluzioni aggiunto su cellule devono essere equilibrati a ~ 37 ° C. Inoltre, è essenziale per la salute generale delle cellule RAW 264,7 mantenerle in terreni contenenti siero partire endotossina (&lt;10 EU / ml), che limita l&#39;attivazione delle cellule. Inoltre, abbiamo osservato un tasso di fallimento superiore del saggio di placca usando cellule dal passaggio 30 o superiore. Anche se questo probabilmente variano da laboratorio a laboratorio, è importante includere un controllo positivo (ad esempio, un campione con un titolo virale noto) per garantire titoli riproducibili, soprattutto quando si utilizzano più elevati passaggio RAW 264,7 cellule. Per limitare l&#39;uso di cellule di passaggio più elevati, si consiglia di congelare fiale del primo Passacellule ge dopo il ricevimento del RAW 264,7 cellule e iniziare una nuova cultura dai flaconi congelati frequentemente. Si riparte con colture cellulari a basso passaggio sarà anche utile quando le cellule presentano caratteristiche alterate, come ad esempio il mancato rispetto, i cambiamenti della morfologia cellulare (ad esempio, da rotondo a esile ed estesa), o quando la contaminazione da micoplasma è stato rilevato. Un altro punto importante da prestare attenzione è di garantire che i puntali delle pipette sono cambiati tra i campioni e durante le diluizioni. In questo modo garantire l&#39;accuratezza dei diluizioni seriali e prevenire la contaminazione incrociata tra i campioni. Di un passo nel protocollo in cui il puntale stesso può essere utilizzato nuovamente quando diluizioni seriali dello stesso campione vengono aggiunti ai pozzetti. In tal caso, si deve partire da l&#39;inoculo più diluito al minimo, e vigorosamente pipettare su e giù al momento di elaborare una nuova diluizione. Il protocollo del saggio placca è modificabile di numerose modifiche. Una modifica che possono essere effettuate quando tqui non sono cellule sufficienti per vaccinare i pozzi in duplice copia è di inoculare solo un singolo pozzo per ogni diluizione. Tuttavia, poiché il volume dell&#39;inoculo è 0,5 ml, il numero di placche deve poi essere moltiplicato per un fattore di 2 per normalizzare a pfu / ml. Il saggio di placca può anche essere adattato per l&#39;uso con qualsiasi altra linea cellulare aderente che è in grado di supportare la replica di MNV, e questo è stato descritto per la linea murina microglia BV-2 cella 8. Altre modifiche che possono essere attuate sono adattamenti che sono stati descritti per i protocolli di test placca sviluppati per altri virus. In caso di MNV, le seguenti modifiche sono già state realizzate con successo, l&#39;uso di metil cellulosa invece di placca Mare agarosio 9, e la colorazione delle cellule con violetto cristallo o blu di metilene al posto del rosso neutro 10, 11. Nel complesso, questo protocollo può essere facilmente adattato per quantificare altri formanti placca virus o utilizzati per OTHer virus che causano infezioni litiche in RAW 264,7 cellule, che lo rende uno strumento utile per quantificare particelle virali infettive in generale.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome del reagente </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td></tr><tr><td> DMEM / glucosio di alta </td><td> Hyclone </td><td> SH30243.02 </td></tr><tr><td> 2x MEM </td><td> Gibco </td><td> 11935 </td></tr><tr><td> 100x penicillina e streptomicina </td><td> Hyclone </td><td> SV30010 </td></tr><tr><td> 10 mM aminoacidi non essenziali </td><td> Hyclone </td><td> SH30238.01 </td></tr><tr><td> HEPES 1M </td><td> Hyclone </td><td> SH30237.01 </td></tr><tr><td> 200 mm (100x) L-glutammina </td><td> Hyclone </td><td> SH30034.01 </td></tr><tr><td> Siero fetale bovino </td><td> Gibco, Hyclone </td><td> 10437, SH30070.02 </td></tr><tr><td> Sea placca agarosio </td><td> Lonza </td><td> 50100 </td></tr><tr><td> Neutral Red 0,33% </td><td> Sigma </td><td&gt; N2889 </td></tr><tr><td> 1x PBS </td><td> Gibco </td><td> 10010 </td></tr><tr><td> 1,0 millimetri Zirconia / silice perline </td><td> Biospec Prodotti </td><td> 11079110z </td></tr><tr><td> Modello 35 Velocità Rocker </td><td> Labnet </td><td> S2035 </td></tr><tr><td> Lyser strumento Magna </td><td> Roche </td><td> 03358968001 </td></tr><tr><td> Raw 264,7 linea cellulare </td><td> ATCC </td><td> TIB-71 </td></tr><tr><td> Coltura tissutale incubatore </td><td> Sanyo </td><td> MCO-18AIC </td></tr></tbody></table>

saggio di placca per norovirus murine

Plaque Assay for Murine Norovirus

Norovirus murino (MNV) è l&#39;unico membro del genere Norovirus che cresce in modo efficiente nella coltura del tessuto 1, 2. Lisi cellulare e l&#39;effetto citopatico (CPE) sono osservate durante MNV-1 infezione di cellule dendritiche murine o macrofagi 1. Questa proprietà di MNV-1 può essere utilizzato per quantificare il numero di particelle infettive in un dato campione eseguendo un saggio di placca 1. Il saggio di placca si basa sulla capacità di MNV-1 per lisare le cellule e per formare i fori in un monostrato di cellule confluenti, che sono chiamati placche 3. Molteplici tecniche possono essere utilizzate per rilevare infezioni virali in coltura tissutale, tessuto raccolto, clinica, e campioni ambientali, ma non tutti misura del numero di particelle infettive (es qRT-PCR). Un modo per quantificare particelle virali infettive è quello di eseguire un saggio di placca 3, che sarà descritto in dettaglio nel seguito. Una variazione del saggio di placca MNV è la fluorfuoco saggio escent, dove è immunostained antigene MNV in monostrati cellulari 4. Questo test può essere più veloce, in quanto espressione di antigene virale precede la formazione della placca. E &#39;anche utile per titolazione virus incapaci di formare placche. Tuttavia, il saggio fuoco fluorescente richiede risorse aggiuntive rispetto a quelle del saggio di placca, come anticorpi e un microscopio per contare fuoco unità formanti. MNV infettiva può anche essere quantificato determinando il 50% della dose infettante Tissue (TCID 50) 3. Questo saggio misura la quantità di virus necessaria per produrre CPE nel 50% delle cellule del tessuto inoculate coltura mediante titolazione finale 5. Tuttavia, il suo limite di rilevamento è più alto rispetto ad un saggio di placca 4. In questo articolo, si descrive un protocollo di saggio di placca che può essere utilizzato per determinare efficacemente il numero di particelle infettive MNV presenti in campioni biologici o ambientali 1, 4, 6. Questo metodo è based sulla preparazione di diluizioni seriali di 10 volte di MNV contenenti campioni, che vengono utilizzati per inoculare un monostrato di cellule permissive (RAW 264,7 macrofagi murini). Virus è consentito collegarsi al monostrato cellulare per un dato periodo di tempo e quindi aspirata prima di coprire cellule con una miscela di agarosio e mezzo di coltura. L&#39;agar permette la diffusione della progenie virale alle cellule vicine, limitando la diffusione di cellule situate lontano. Di conseguenza, le cellule infettate vengono lisate e fori formano nel monostrato noto come placche. Alla diffusione del virus sufficiente, placche diventano visibili seguente colorazione delle cellule con coloranti, come il rosso neutro, blu di metilene, o viola cristallo. A basse diluizioni, ogni placca proviene da una particella infettiva virale e la sua progenie, che si è diffusa a cellule vicine. Così, contando il numero di placche permette di calcolare unità formanti placca (PFU) presenti nel campione non diluito 3.

Qui si descrive un metodo per quantificare particelle infettive di norovirus murino (MNV), che è l&#39;unica norovirus che replica efficiente in coltura cellulare. Il saggio di placca sfrutta MNV tropismo per i macrofagi murini e può essere adattato all&#39;uso con campioni biologici o ambientali contenenti MNV.

Saggio di placca per Norovirus Murine

Il norovirus murino (MNV) è l'unico membro del genere Norovirus in grado di crescere efficientemente in colture tissutali 1, 2. La lisi cellulare e l'effetto citopatico (CPE) sono ...

L'obiettivo generale di questa procedura è quantificare le particelle di norovirus neurotrofe infettive. Questo viene raggiunto innanzitutto preparando un'inoculo virale diluito in serie di dieci volte. Il secondo passaggio consiste nel trasferire la diluizione dell'inoculo virale su un monocstrato di cellule RAW 264.7 e nell'incubare le piastre con movimento oscillante a temperatura ambiente per un'ora.Successivamente, aspirare l'inoculo e sovrapporre un rapporto uno a uno di C plaque aros e due XMEM, quindi incubare le piastre per 48 ore in un incubatore per colture cellulari. L'ultimo passaggio consiste nel sovrapporre la soluzione di colorazione con rosso neutro e incubare le piastre da una a tre ore in un incubatore per colture cellulari. Infine, la soluzione di colorazione con rosso neutro viene aspirata con attenzione senza rimuovere il soprastrato di arose e le piastrine vengono conteggiate utilizzando una scatola luminosa.Questo metodo di quantificazione delle particelle virali infettive può aiutare a rispondere a domande fondamentali nel campo del norovirus, come la quantità di particelle infettive espulse nelle feci o quali tessuti supportano l'infezione. Generalmente, chi si approccia per la prima volta a questo metodo incontra difficoltà nel mantenere le cellule sane e vitali per tutta la durata del saggio. Una dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale, poiché il saggio di placcatura per il norovirus neurotropo può risultare difficile da comprendere per chi non ha esperienza pregressa.Il corretto completamento di questo saggio è una serie cumulativa di passaggi che richiedono la giusta quantità di cellule, la temperatura corretta e una manipolazione precisa per osservare facilmente le placche. Innanzitutto, esaminare il monostrato cellulare al microscopio ottico per verificare la morfologia delle cellule. La maggior parte delle cellule dovrebbe apparire rotonda.Non permettere alle cellule di sovraproliferare poiché in genere non formeranno placche; massaggia un fiasco da 175 centimetri quadrati di coltura cellulare quasi confluenziale di cellule RAW 264.7 per il saggio di placca del virus neurotrofico murino. Aspira il terreno dal fiasco e aggiungi 10 millilitri di DMEM 10 fresco alle cellule. Successivamente, raschia le cellule dal fondo del fiasco con uno staccatore cellulare e utilizza una pipetta da 10 millilitri per aspirare ed espellere quindi la sospensione cellulare contro il fondo del fiasco. Ripeti questa operazione almeno tre volte per rompere eventuali aggregati cellulari.Per adattare una fiala di riserva. Rimuovere uno o due millilitri di sospensione cellulare e trasferirli in una nuova fiala quadrata da 175 centimetri quadrati contenente da 33 a 34 millilitri di DMEM 10. Incubare la fiala in un incubatore per colture cellulari a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica per due o tre giorni, quindi massaggiare nuovamente.Dopo aver aggiunto il complemento per seminare le piastre per il saggio, regolare la densità della sospensione cellulare a un milione di cellule vitali per millilitro in DMEM 10 e aggiungere due millilitri di questa sospensione in ciascun pozzetto di una piastra da 3,5 centimetri di diametro. Coprire la piastra. Quindi agitare immediatamente la piastra a mano per 10 volte per distribuire uniformemente le cellule nei pozzetti.Non far gonfiare la piastra poiché ciò causerebbe l'aggregazione delle cellule al centro del pozzetto. Successivamente, posizionare la piastra in un incubatore per colture cellulari per un periodo minimo di quattro ore o, idealmente, durante la notte affinché le cellule si attacchino. L'inoculo virale può essere ottenuto da tessuti omogeneizzati infetti da MNV o da campioni fecali di topi infetti da MNV. Se si utilizzano campioni di tessuto, mettere un pezzo delle dimensioni di un pisello in un tubo con tappo a vite da due millilitri contenente perle di silice sterili e un millilitro di DMEM 10 ed omogeneizzare qui.Un magnetizzatore viene utilizzato a 6.000 giri al minuto per un minuto. Se si utilizzano campioni fecali, omogeneizzare non più di tre pellet fecali nello stesso modo, congelare i campioni omogeneizzati a meno 80 gradi Celsius e scongelare l'inoculo nel giorno del saggio di placca. Utilizzare una pipetta ripetibile per distribuire 1,35 millilitri di DMEM cinque in ciascun pozzetto di una piastra a 24 pozzetti, quindi pipettare 0,15 millilitri del terzo inoculo virale nel primo pozzetto della piastra.Eseguire diluizioni seriali di ordine decimale aspirando 0,15 millilitri della prima diluizione 10 alla meno uno e trasferendoli nel secondo pozzetto della piastra per ottenere una diluizione 10 alla meno due. Ripetere quindi il processo utilizzando la diluizione del secondo pozzetto per arrivare a una diluizione 10 alla meno tre. Notare che potrebbe essere necessario effettuare ulteriori diluizioni fino a 10 alla meno nove, a seconda del campione.Dopo aver preparato le diluizioni seriali, etichettare le piastre con cellule RAW 264.7 al 60-80% di confluenza con i nomi dei campioni e le diluizioni da utilizzare. Rimuovere quindi tutto il mezzo da una delle piastre aspirando o svuotando con un colpetto e aggiungere 0,5 millilitri di un campione diluito in una pozzetta. Ripetere l'operazione in una pozzetta duplicata, quindi passare alla diluizione successiva più bassa.Dopo aver aggiunto tutte e tre le diluizioni su una piastra in duplicato, inclinare la piastra avanti e indietro per assicurarsi che tutte le cellule siano state ricoperte. Ripetere la procedura con la successiva piastra di cellule. Una volta trattate tutte le piastre, posizionarle su un agitatore orbitale regolato a circa 18 oscillazioni al minuto per un'ora a temperatura ambiente e scaldare al microonde un flacone di agarosio precedentemente preparato o sterilizzato fino a completa fusione.Quindi posizionare gli aros fusi in un bagno d'acqua a 42 gradi Celsius per raggiungere l'equilibrio termico. Successivamente, mescolare gli agros fusi con mezzo sterile XMEM 2X in una bottiglia sterile in rapporto uno a uno. Posizionare la bottiglia contenente questa soluzione di sovrapposizione in un bagno d'acqua a 37 gradi Celsius fino al momento dell'utilizzo.Al termine dell'incubazione di un'ora, aspirare l'inoculo da ogni pozzetto e aggiungere lentamente due millilitri della soluzione di rivestimento in ciascun pozzetto, assicurandosi che la punta della pipetta sia appoggiata alla parete di ogni pozzetto. Per evitare di staccare le cellule, coprire le piastre e lasciare solidificare il rivestimento per circa 10 minuti a temperatura ambiente. Successivamente, trasferire le piastre nell'incubatore per colture cellulari per 48 ore.Trascorso il periodo di incubazione, verificare la presenza di placche sulle piastre. Se non sono visibili placche, rimettere le piastre nell'incubatore e controllare nuovamente dopo quattro ore. Ripetere la procedura se necessario, ma l'incubazione non deve superare le 72 ore.Preparare innanzitutto la soluzione colorante al rosso neutro. Successivamente, aggiungere due millilitri di soluzione di rosso neutro in ogni pozzetto; per questo protocollo, non è necessario rimuovere il tappo aros. Incubare le piastre a 37 gradi Celsius per un'ora.Trascorso il tempo di incubazione, verificare la presenza di placche sulle piastre mantenendo la soluzione di rosso neutro nei pozzetti. Se non è visibile alcuna colorazione, incubare le piastre per un'ulteriore ora, per un massimo di tre ore. Una volta che le placche diventano visibili, aspirare la soluzione di rosso neutro, assicurandosi di non disturbare il tappo formato, quindi procedere al conteggio delle placche.Esaminare le piastre e individuare il diluizione in cui le placche sono chiaramente separate. Posizionare la piastra su una scatola luminosa e contare le placche segnando un punto sulle placche già contate, per evitare doppioni.Quindi ripetere il conteggio su un pozzetto con una diversa diluizione del virus e calcolare il titolo virale in unità formanti placche per millilitro. Secondo le istruzioni riportate nel protocollo scritto, questa immagine rappresentativa mostra un monolayer prima dell'infezione. Le cellule raw 2 6 4 0.7 sono state coltivate durante la notte e analizzate al microscopio ottico con un ingrandimento di 20 volte.Questa immagine mostra lo stesso monocstrato dopo la formazione delle placche. Le cellule sono state colorate con una soluzione di rosso neutro allo 0,01% dopo 48 ore di infezione e osservate al microscopio ottico con un ingrandimento di quattro volte. I numeri romani uno, due e tre indicano tre placche visibili.Questa immagine mostra una piastra al termine del protocollo del saggio delle placche, con pozzetti duplicati di tre diluizioni decrescenti indicate con numeri romani. I numeri uno e quattro corrispondono alla diluizione 10 alla meno uno. I numeri due e cinque corrispondono alla diluizione 10 alla meno due, e i numeri tre e sei corrispondono alla diluizione 10 alla meno tre.Il titolo virale del campione è indicato di seguito. Durante l'esecuzione di questa procedura, è importante ricordare di cambiare i pipet tip tra una diluizione e l'altra per evitare contaminazioni incrociate tra i campioni, di equilibrare le soluzioni alla temperatura corretta e di non far asciugare i monoc strati cellulari. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come eseguire un saggio di placcatura e quantificare le particelle infettive di mi neurovirus.Non dimenticare che quando si lavora con il Mira Norovirus in una cappa a sicurezza biologica, è sempre necessario adottare precauzioni come indossare guanti e camice durante l'esecuzione di questa procedura, e i rifiuti devono essere smaltiti correttamente seguendo le linee guida stabilite dal comitato locale di sicurezza biologica.

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JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia e Infezioni

I Norovirus sono una delle principali cause di gastroenterite ancora tecniche molecolari per la loro caratterizzazione sono ancora relativamente nuovi. Riportiamo due diversi approcci di genetica inversa per il recupero efficiente dei norovirus murino (MNV), l'unico membro di questo genere che possono essere propagate in coltura cellulare.

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Assessing Rotavirus Growth Curve by Plaque Assay

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È stata sviluppata e valutata una metodologia di campionamento basata su macroschiuma per il rilevamento e la quantificazione del norovirus su superfici dure ambientali.

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Impara il saggio di placca per quantificare particelle infettive di norovirus murino utilizzando macrofagi murini RAW 264.7. Questo metodo standard supporta la ricerca virologica sulle dinamiche di infezione.

Saggio di placca per Norovirus Murine

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