Saggio di placca per Norovirus Murine

L'obiettivo generale di questa procedura è quantificare le particelle di norovirus neurotrofe infettive. Questo viene raggiunto innanzitutto preparando un'inoculo virale diluito in serie di dieci volte. Il secondo passaggio consiste nel trasferire la diluizione dell'inoculo virale su un monocstrato di cellule RAW 264.7 e nell'incubare le piastre con movimento oscillante a temperatura ambiente per un'ora.

Successivamente, aspirare l'inoculo e sovrapporre un rapporto uno a uno di C plaque aros e due XMEM, quindi incubare le piastre per 48 ore in un incubatore per colture cellulari. L'ultimo passaggio consiste nel sovrapporre la soluzione di colorazione con rosso neutro e incubare le piastre da una a tre ore in un incubatore per colture cellulari. Infine, la soluzione di colorazione con rosso neutro viene aspirata con attenzione senza rimuovere il soprastrato di arose e le piastrine vengono conteggiate utilizzando una scatola luminosa.

Questo metodo di quantificazione delle particelle virali infettive può aiutare a rispondere a domande fondamentali nel campo del norovirus, come la quantità di particelle infettive espulse nelle feci o quali tessuti supportano l'infezione. Generalmente, chi si approccia per la prima volta a questo metodo incontra difficoltà nel mantenere le cellule sane e vitali per tutta la durata del saggio. Una dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale, poiché il saggio di placcatura per il norovirus neurotropo può risultare difficile da comprendere per chi non ha esperienza pregressa.

Il corretto completamento di questo saggio è una serie cumulativa di passaggi che richiedono la giusta quantità di cellule, la temperatura corretta e una manipolazione precisa per osservare facilmente le placche. Innanzitutto, esaminare il monostrato cellulare al microscopio ottico per verificare la morfologia delle cellule. La maggior parte delle cellule dovrebbe apparire rotonda.

Non permettere alle cellule di sovraproliferare poiché in genere non formeranno placche; massaggia un fiasco da 175 centimetri quadrati di coltura cellulare quasi confluenziale di cellule RAW 264.7 per il saggio di placca del virus neurotrofico murino. Aspira il terreno dal fiasco e aggiungi 10 millilitri di DMEM 10 fresco alle cellule. Successivamente, raschia le cellule dal fondo del fiasco con uno staccatore cellulare e utilizza una pipetta da 10 millilitri per aspirare ed espellere quindi la sospensione cellulare contro il fondo del fiasco. Ripeti questa operazione almeno tre volte per rompere eventuali aggregati cellulari.

Per adattare una fiala di riserva. Rimuovere uno o due millilitri di sospensione cellulare e trasferirli in una nuova fiala quadrata da 175 centimetri quadrati contenente da 33 a 34 millilitri di DMEM 10. Incubare la fiala in un incubatore per colture cellulari a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica per due o tre giorni, quindi massaggiare nuovamente.

Dopo aver aggiunto il complemento per seminare le piastre per il saggio, regolare la densità della sospensione cellulare a un milione di cellule vitali per millilitro in DMEM 10 e aggiungere due millilitri di questa sospensione in ciascun pozzetto di una piastra da 3,5 centimetri di diametro. Coprire la piastra. Quindi agitare immediatamente la piastra a mano per 10 volte per distribuire uniformemente le cellule nei pozzetti.

Non far gonfiare la piastra poiché ciò causerebbe l'aggregazione delle cellule al centro del pozzetto. Successivamente, posizionare la piastra in un incubatore per colture cellulari per un periodo minimo di quattro ore o, idealmente, durante la notte affinché le cellule si attacchino. L'inoculo virale può essere ottenuto da tessuti omogeneizzati infetti da MNV o da campioni fecali di topi infetti da MNV. Se si utilizzano campioni di tessuto, mettere un pezzo delle dimensioni di un pisello in un tubo con tappo a vite da due millilitri contenente perle di silice sterili e un millilitro di DMEM 10 ed omogeneizzare qui.

Un magnetizzatore viene utilizzato a 6.000 giri al minuto per un minuto. Se si utilizzano campioni fecali, omogeneizzare non più di tre pellet fecali nello stesso modo, congelare i campioni omogeneizzati a meno 80 gradi Celsius e scongelare l'inoculo nel giorno del saggio di placca. Utilizzare una pipetta ripetibile per distribuire 1,35 millilitri di DMEM cinque in ciascun pozzetto di una piastra a 24 pozzetti, quindi pipettare 0,15 millilitri del terzo inoculo virale nel primo pozzetto della piastra.

Eseguire diluizioni seriali di ordine decimale aspirando 0,15 millilitri della prima diluizione 10 alla meno uno e trasferendoli nel secondo pozzetto della piastra per ottenere una diluizione 10 alla meno due. Ripetere quindi il processo utilizzando la diluizione del secondo pozzetto per arrivare a una diluizione 10 alla meno tre. Notare che potrebbe essere necessario effettuare ulteriori diluizioni fino a 10 alla meno nove, a seconda del campione.

Dopo aver preparato le diluizioni seriali, etichettare le piastre con cellule RAW 264.7 al 60-80% di confluenza con i nomi dei campioni e le diluizioni da utilizzare. Rimuovere quindi tutto il mezzo da una delle piastre aspirando o svuotando con un colpetto e aggiungere 0,5 millilitri di un campione diluito in una pozzetta. Ripetere l'operazione in una pozzetta duplicata, quindi passare alla diluizione successiva più bassa.

Dopo aver aggiunto tutte e tre le diluizioni su una piastra in duplicato, inclinare la piastra avanti e indietro per assicurarsi che tutte le cellule siano state ricoperte. Ripetere la procedura con la successiva piastra di cellule. Una volta trattate tutte le piastre, posizionarle su un agitatore orbitale regolato a circa 18 oscillazioni al minuto per un'ora a temperatura ambiente e scaldare al microonde un flacone di agarosio precedentemente preparato o sterilizzato fino a completa fusione.

Quindi posizionare gli aros fusi in un bagno d'acqua a 42 gradi Celsius per raggiungere l'equilibrio termico. Successivamente, mescolare gli agros fusi con mezzo sterile XMEM 2X in una bottiglia sterile in rapporto uno a uno. Posizionare la bottiglia contenente questa soluzione di sovrapposizione in un bagno d'acqua a 37 gradi Celsius fino al momento dell'utilizzo.

Al termine dell'incubazione di un'ora, aspirare l'inoculo da ogni pozzetto e aggiungere lentamente due millilitri della soluzione di rivestimento in ciascun pozzetto, assicurandosi che la punta della pipetta sia appoggiata alla parete di ogni pozzetto. Per evitare di staccare le cellule, coprire le piastre e lasciare solidificare il rivestimento per circa 10 minuti a temperatura ambiente. Successivamente, trasferire le piastre nell'incubatore per colture cellulari per 48 ore.

Trascorso il periodo di incubazione, verificare la presenza di placche sulle piastre. Se non sono visibili placche, rimettere le piastre nell'incubatore e controllare nuovamente dopo quattro ore. Ripetere la procedura se necessario, ma l'incubazione non deve superare le 72 ore.

Preparare innanzitutto la soluzione colorante al rosso neutro. Successivamente, aggiungere due millilitri di soluzione di rosso neutro in ogni pozzetto; per questo protocollo, non è necessario rimuovere il tappo aros. Incubare le piastre a 37 gradi Celsius per un'ora.

Trascorso il tempo di incubazione, verificare la presenza di placche sulle piastre mantenendo la soluzione di rosso neutro nei pozzetti. Se non è visibile alcuna colorazione, incubare le piastre per un'ulteriore ora, per un massimo di tre ore. Una volta che le placche diventano visibili, aspirare la soluzione di rosso neutro, assicurandosi di non disturbare il tappo formato, quindi procedere al conteggio delle placche.

Esaminare le piastre e individuare il diluizione in cui le placche sono chiaramente separate. Posizionare la piastra su una scatola luminosa e contare le placche segnando un punto sulle placche già contate, per evitare doppioni.

Quindi ripetere il conteggio su un pozzetto con una diversa diluizione del virus e calcolare il titolo virale in unità formanti placche per millilitro. Secondo le istruzioni riportate nel protocollo scritto, questa immagine rappresentativa mostra un monolayer prima dell'infezione. Le cellule raw 2 6 4 0.7 sono state coltivate durante la notte e analizzate al microscopio ottico con un ingrandimento di 20 volte.

Questa immagine mostra lo stesso monocstrato dopo la formazione delle placche. Le cellule sono state colorate con una soluzione di rosso neutro allo 0,01% dopo 48 ore di infezione e osservate al microscopio ottico con un ingrandimento di quattro volte. I numeri romani uno, due e tre indicano tre placche visibili.

Questa immagine mostra una piastra al termine del protocollo del saggio delle placche, con pozzetti duplicati di tre diluizioni decrescenti indicate con numeri romani. I numeri uno e quattro corrispondono alla diluizione 10 alla meno uno. I numeri due e cinque corrispondono alla diluizione 10 alla meno due, e i numeri tre e sei corrispondono alla diluizione 10 alla meno tre.

Il titolo virale del campione è indicato di seguito. Durante l'esecuzione di questa procedura, è importante ricordare di cambiare i pipet tip tra una diluizione e l'altra per evitare contaminazioni incrociate tra i campioni, di equilibrare le soluzioni alla temperatura corretta e di non far asciugare i monoc strati cellulari. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come eseguire un saggio di placcatura e quantificare le particelle infettive di mi neurovirus.

Non dimenticare che quando si lavora con il Mira Norovirus in una cappa a sicurezza biologica, è sempre necessario adottare precauzioni come indossare guanti e camice durante l'esecuzione di questa procedura, e i rifiuti devono essere smaltiti correttamente seguendo le linee guida stabilite dal comitato locale di sicurezza biologica.