Name: Analisi Profilo metabolico di embrioni di zebrafish (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-01-14T12:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 41 s
Description: Scopri come misurare il profilo metabolico in vivo negli embrioni di zebrafish con l'analizzatore Seahorse XF 24. Questo metodo consente di studiare la funzione mitocondriale nell'organismo completo e valutare gli effetti di manipolazioni genetiche e farmacologiche.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Gli autori desiderano ringraziare i membri del personale del Fondo per la Deakin University Zebrafish per fornire un&#39;eccellente assistenza in corso allevamento. YG è supportato da una borsa di studio di ricerca post-dottorato e Alfred Deakin un assegno di ricerca Central da Deakin University. SLM è supportato da una borsa di studio NHMRC sviluppo della carriera. ACW è sostenuta da una sovvenzione NHMRC Attivazione. Tutti gli autori sono supportati dal Molecular &amp; Medical Research Centre di ricerca strategica presso Deakin University.

Parte 1: trattamento chimico di embrioni di zebrafish <ol><li> Raccogliere embrioni di zebrafish dopo la fecondazione. Incubare a 28,5 ° C in terreno E3 in 100 × 15 millimetri Petri. Nota: per ibridazione in situ o Oil-Red-O colorazione, 1-fenil-2-tiourea (PTU) ad una concentrazione finale di 0,2 mM viene aggiunto inibire la formazione di pigmento, 1 ma non è necessario per l&#39;analisi Seahorse. </li><li> Per gli studi farmacologici, aggiungere la sostanza chimica necessaria ad una concentrazione finale adeguata per lo sviluppo di embrioni di zebrafish in circa 26 ore dopo la fecondazione (HPF) con un adeguato controllo con solo veicolo. Nota: per gli inibitori farmacologici sensibili alla luce, gli embrioni possono essere consentito di sviluppare in il priore buio per l&#39;analisi. </li></ol> Parte 2: il profilo metabolico dal vivo con il Seahorse XF 24 Analyser <ol><li> Prima di ogni esecuzione, il Seahorse XF 24 cartuccia Analyser che ospita il 2 O e H <s&gt; + fino fluorofori è calibrato attraverso un processo automatizzato eseguito dall&#39;analizzatore. </li><li> Preparazione del 24 pozzetti XF piastra da 24 isole. La seguente sequenza sperimentale è impiegato: <ol><li> Poiché il consumo di ossigeno è sensibile alle variazioni di temperatura, quattro pozzi sono usati per controllare le fluttuazioni di temperatura possibili attraverso la piastra. Questi pozzetti non contengono embrioni, ma sono riempiti con 700 pl di mezzo E3 (Figura 2A). </li><li> I restanti 20 pozzi (cfr. parte 2.2) sono riempiti con 700 ml di mezzo di E3 e un embrione ciascuno (Figura 2B). </li><li> Per ogni esperimento, 10 embrioni sono trattati con veicolo (controllo) e 10 trattati con inibitore chimico (trattata). Embrioni di controllo e trattato si alternano (ad esempio, ben A2: embrione di controllo; bene A3: embrione trattato: A4 anche: embrione di controllo; ben embrione A5 trattamento, ecc.) </li><li> Una schermata di acquisizione isolotto è aggiunto in cima. ogni pozzetto per garantire che il campione rimane nella camera di misura all&#39;interno del dosaggio (Figura 2B) Nota: trattati chimicamente embrioni rimangono con la soluzione chimica originale durante l&#39;intera procedura, senza necessità di lavare il prodotto chimico prima esecuzione dell&#39;analizzatore Seahorse programma. </li><li> Una volta terminata, la lastra viene caricata nel Analyser Seahorse ed il dosaggio viene avviato. </li></ol></li><li> Analisi di campioni. Due diverse prove sono eseguite di routine. <ol><li> Basale respirazione / Massimo programma respirazione (durata circa 90 min.). Le alterazioni della respirazione basale sostenere disfunzione metabolica, mentre la respirazione massima è una misura della capacità totale di produzione di energia e alterazioni in questo parametro associato con un certo numero di stati sia patologici e fisiologici. La capacità respiratoria di riserva, o la capacità di sistema di aumentare ulteriormente la produzione di ATP, viene inoltre calcolatada questa prova dalla sottrazione di respirazione basale da massima. Tre ripetizioni di ciascuna miscela (2 min) / attesa (1 min) / misura (2 min) ciclo viene eseguita per stabilire prima la respirazione basale. Al termine del terzo ciclo, una concentrazione finale di 2,5 pM di FCCP (mitocondriale protonophore / disaccoppiatore) viene aggiunto a ciascun pozzetto permettendo la misurazione della respirazione massima. Il ciclo di misura viene quindi ripetuto 5-8 volte (Figura 3). </li><li> ATP fatturato / Proton programma di perdita (durata circa 60 min.). La respirazione a causa di fatturato ATP rappresenta la principale funzione dei mitocondri in forma di produzione di ATP, mentre la respirazione a causa della perdita di protoni, o respirazione disaccoppiati, è strettamente legata ad altri parametri della funzione mitocondriale tra cui la respirazione basale e reattiva la formazione di specie di ossigeno. Respirazione a causa turnover ATP è rappresentato dalla differenza di respirazione dopo l&#39;aggiunta di 25 pM oligomicina (un inibitore di ATP sintasi) rispetto alla respirazione basale. Respirazione disaccoppiata, o respirazione a causa di perdita protonica, viene determinato calcolando la differenza tra oligomicina-mediata respirazione respirazione e dopo l&#39;aggiunta di 25 uM rotenone (un inibitore del complesso I). Cicli di misura vengono ripetuti 8 volte dopo l&#39;aggiunta di ciascun inibitore mitocondriale. </li></ol></li></ol> Alla fine delle piste, i valori medi del controllo 10 e 10 embrioni trattati chimicamente sono calcolati. Parte 3: Oil-Red-O di colorazione <ol><li> Gli embrioni a 50 HPF sono dechorionated utilizzando una pinza sottile e fissate in 4% PFA per una notte a 4 ° C. </li><li> Oil-Red-O colorazione viene effettuata, come precedentemente descritto 2 (vedi Figura 4). </li></ol>

<ol><li>Nüsslein-Volhard, C., Dahm, R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aN%C3%BCsslein-Volhard%2C+C+%22Zebrafish%22">Zebrafish</a>. , Oxford University Press. (2002).</li>
<li>Schlombs, K., Wagner, T., Scheel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Site-1+protease+is+required+for+cartilage+development+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Site-1 protease is required for cartilage development in zebrafish.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 14024-14029 (2003).</li>
<li>Ingham, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+power+of+the+zebrafish+for+disease+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Mol.+Genet%22%5BJournal%5D)">The power of the zebrafish for disease analysis.</a> Hum. Mol. Genet. 18, R107-R112 (2009).</li>
<li>Nasevicius, A., Ekker, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effective+targeted+gene+%27knockdown%27+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Genet%22%5BJournal%5D)">Effective targeted gene 'knockdown' in zebrafish.</a> Nat. Genet. 26, 216-220 (2000).</li>
<li>Stackley, K. D., Beeson, C. C., Rahn, J. J., Chan, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioenergetic+profiling+of+zebrafish+embryonic+development%5BTitle%5D)+AND+%22Plos+One%22%5BJournal%5D)">Bioenergetic profiling of zebrafish embryonic development.</a> Plos One. 6, e25652(2011).</li>
<li>McGee, S. L., Sadli, N., Morrison, S., Swinton, C., Suphioglu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DHA+protects+against+zinc+mediated+alterations+in+neuronal+cellular+bioenergetics%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Physiol.+Biochem%22%5BJournal%5D)">DHA protects against zinc mediated alterations in neuronal cellular bioenergetics.</a> Cell Physiol. Biochem. 28, 157-162 (2011).</li>
<li>Sivitz, W. I., Yorek, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+dysfunction+in+diabetes%3A+from+molecular+mechanisms+to+functional+significance+and+therapeutic+opportunities%5BTitle%5D)+AND+%22Antioxid.+Redox+Signal%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial dysfunction in diabetes: from molecular mechanisms to functional significance and therapeutic opportunities.</a> Antioxid. Redox Signal. 12, 537-577 (2010).</li>
<li>Bournat, J. C., Brown, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+dysfunction+in+obesity%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Endocrinol.+Diabetes+Obes%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial dysfunction in obesity.</a> Curr. Opin. Endocrinol. Diabetes Obes. 17, 446-452 (2010).</li>
<li>Ghafourifar, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondria+in+multiple+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Biosci%22%5BJournal%5D)">Mitochondria in multiple sclerosis.</a> Front Biosci. 13, 3116-3126 (2008).</li>
<li>Winklhofer, K. F., Haass, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+dysfunction+in+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial dysfunction in Parkinson's disease.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1802, 29-44 (2010).</li>
<li>Maruszak, A., Zekanowski, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+dysfunction+and+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Prog.+Neuropsychopharmacol.+Biol.+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial dysfunction and Alzheimer's disease.</a> Prog. Neuropsychopharmacol. Biol. Psychiatry. 35, 320-330 (2011).</li>
<li>de Moura, M. B., dos Santos, L. S., S, L., Van Houten, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+dysfunction+in+neurodegenerative+diseases+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.+Mol.+Mutagen%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial dysfunction in neurodegenerative diseases and cancer.</a> Environ. Mol. Mutagen. 51, 391-405 (2010).</li>
</ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Zebrafish è una consolidata modello genetico sia in avanti (ENU mutagenesi) e reverse (Tilling, zinc finger nucleasi mirata knock-out, knockdown morfolino) approcci genetici 3,4, mentre la funzione del gene in embrioni di zebrafish può anche essere facilmente bloccato o attivato utilizzando selettivi composti farmacologici specifici per i prodotti codificati. Grazie al loro sviluppo esterno e piccole dimensioni, embrioni di zebrafish sono particolarmente adatti per l&#39;analisi metabolica. Tuttavia, la misura del profilo metabolico robusta e funzione mitocondriale in vivo in embrioni di zebrafish non è stato raggiunto, con una sola descrizione preliminari riportate 5. Analisi Seahorse stato originariamente progettato per basati su celle studi metabolici e ha dimostrato di dare risultati precisi e affidabili 6. L&#39;applicazione di questa nuova metodologia di embrioni di zebrafish è significativo, e in grado di aumentare l&#39;uso più ampio di questo modello per gli studi metabolici. In questo studio, abbiamo dimostrato la misurazione di una serie di parametri di respirazione in embrioni di zebrafish utilizzando l&#39;analizzatore Seahorse, tra cui la respirazione basale, respirazione massima, di ricambio capacità respiratoria, fatturato ATP e perdite protone. Forniamo anche un esempio di come tali misurazioni possono essere correlati con altri parametri fisiologici, in questo caso accumulo di lipidi, e dell&#39;uso di inibitori farmacologici in questo sistema di analisi. In combinazione con l&#39;uso di embrioni geneticamente alterati, questo fornisce una potente piattaforma sperimentale per comprendere i fattori che incidono sul metabolismo. Ci sono una varietà di applicazioni per questa nuova metodologia, con disfunzione mitocondriale è implicato in molte malattie umane, come il diabete mellito 7, obesità 8, 9 sclerosi multipla, Parkinson 10, morbo di Alzheimer 11 e alcuni tipi di cancro 12. È importante sottolineare che, our lavoro viene eseguito in vivo, in cui tutte le influenze ambientali - quali citochine, sviluppo connesse etc crescita - sono attivi, fornendo così una vista fisiologicamente rilevante nella respirazione vivo e profilo metabolico. Come schermi chimici sono eseguiti di routine in wild type e mutanti embrioni di zebrafish sfondo (Figura 1), i prodotti farmaceutici innovativi che influenza la respirazione, la funzione dei mitocondri e metabolismo rischiano di essere facilmente identificabili con l&#39;analizzatore Seahorse. I risultati ottenuti utilizzando l&#39;analizzatore Seahorse potrebbe essere utilizzato in combinazione con altri saggi di fornire ulteriori informazioni. Questo può includere analisi fisiologica, come olio rosso-colorazione, o analisi molecolare, come l&#39;ibridazione in situ per adipociti marcatori specifici come cebpα, PPARa, PPARy, ecc FAS Restano alcune limitazioni a questa metodologia. Anche se e gli altri erano in grado di utilizzare oligomicina per misuraure produzione di ATP e perdita protonica sugli embrioni giovani 5 (vedi figura 3), in embrioni di età superiore ai 60 Trattamento hpf oligomicina è inefficiente. Riteniamo che nei vecchi embrioni oligomicina non può diffondere con la stessa facilità che nei giovani embrioni rendendo i risultati impossibili da interpretare. Dal momento che i risultati oligomicina sono obbligatori per la determinazione della respirazione a causa di fatturato ATP e la respirazione disaccoppiato, stiamo attualmente studiando concentrazioni più elevate di oligomicina per gli anziani embrioni. Tuttavia, antimicina A trattamenti rimangono più efficace, con altre misure, come la respirazione basale, respirazione massima e ricambio capacità respiratoria, può essere eseguita in embrioni di zebrafish anziani, fino a 68 HPF (non mostrato). Un&#39;altra limitazione utilizzando l&#39;attuale configurazione Analyser Seahorse è lo spazio fisico all&#39;interno di ogni piastra di cattura isolotto bene, in modo tale che essi sono adatti solo per embrioni di zebrafish e larve giovani. Pertanto, eseguendo metabolic studi sulla dieta obesità indotta nei pesci adulti, per esempio, non è ancora tecnicamente possibile. Tuttavia, questo studio possono indurre lo sviluppo di lastre appositamente studiati per il novellame o adulto, in modo da estendere l&#39;ambito di analisi possibili.

<html><table border="1"><tbody><tr><td> Nome del reagente </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td><td> Commenti </td></tr><tr><td> XF 24 analizzatore di flusso extracellulare </td><td> Seahorse Bioscience </td><td> 100737-101 </td><td> Formato 24 ben </td></tr><tr><td> Islet Capture micropiastra </td><td> Seahorse Bioscience </td><td> 101122-100 </td><td> Formato 24 ben </td></tr><tr><td> XF calibrante Soluzione </td><td> Seahorse Bioscience </td><td> 100840-000 </td><td></td></tr><tr><td> XF saggio medio </td><td> Seahorse Bioscience </td><td> 101022-100 </td><td></td></tr><tr><td> Oil-Red-O </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> O0625 </td><td></td></tr><tr><td> 1-fenil-2-tiourea (PTU) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P7629 </td><td>/ Zfbook/chapt10.html # wptohtml51 &quot;target =&quot; _blank &quot;&gt; http://zfin.org/zf_info/zfbook/chapt10.html # wptohtml51 </td></tr><tr><td> E3 (media embrionale) </td><td> Self made </td><td> - </td><td> <a href="http://zfin.org/zf_info/zfbook/chapt10.html#wptohtml16" target="_blank">http://zfin.org/zf_info/zfbook/chapt10.html # wptohtml16</a> </td></tr><tr><td> 100x15 millimetri Petri piatti </td><td> Falco </td><td> 35-1029 </td><td></td></tr><tr><td> FCCP </td><td> Sigma </td><td> C2920 </td><td></td></tr><tr><td> Oligomicina </td><td> Sigma </td><td> 75351 </td><td></td></tr><tr><td> Antimicina A </td><td> Sigma </td><td> A8674 </td><td></td></tr></tbody></table>

analisi profilo metabolico di embrioni di zebrafish

Metabolic Profile Analysis of Zebrafish Embryos

Un obiettivo crescita nel campo del metabolismo è quello di determinare l&#39;impatto della genetica su diversi aspetti della funzione mitocondriale. La comprensione di queste relazioni aiuterà a comprendere l&#39;eziologia di fondo per una serie di malattie legate alla disfunzione mitocondriale, come il diabete e l&#39;obesità. I recenti progressi nella strumentazione, ha permesso il monitoraggio dei parametri distinti della funzione mitocondriale in linee cellulari o espianti di tessuto. Presentiamo qui un metodo per un&#39;analisi rapida e sensibile di parametri funzione mitocondriale in vivo durante lo sviluppo embrionale di zebrafish usando l&#39;Seahorse Bioscience XF 24 analizzatore extracellulare flusso. Questo protocollo utilizza la cattura Islet micropiastre in cui un singolo embrione si trova in ciascun pozzetto, consente la misurazione della bioenergetica, tra cui: (i) la respirazione basale, (ii) la respirazione mitocondriale basale (iii) la respirazione mitocondriale a causa di fatturato ATP, (iv) mitocondriale respirazione disaccoppiato o prOton perdita e (iv) la respirazione massimo. Utilizzando questo approccio embrionali parametri respiratori zebrafish può essere paragonato tra wild-type e di embrioni geneticamente modificati (mutante, gene sovra-espressione o knockdown gene) o quelli manipolato farmacologicamente. Si prevede che la diffusione di questo protocollo fornirà ai ricercatori nuovi strumenti per analizzare le basi genetiche dei disturbi metabolici in vivo nel modello animale vertebrato rilevante.

<html> Siamo interessati a capire il ruolo dei geni specifici sul metabolismo, in particolare il tasso di respirazione e il metabolismo dei lipidi. Pertanto, abbiamo trattato selvatici embrioni di zebrafish tipo da 26 in poi HPF con uno specifico inibitore farmacologico di enzima codificato da uno di questi geni. A 50 HPF, metà del veicolo e inibitore trattati embrioni sono stati analizzati utilizzando la Seahorse per la funzione mitocondriale, mentre la restante metà sono stati fissati in 4% PFA notte a 4 ° C e successivamente trattata per deposizione di lipidi con Oil-Red-O. Il trattamento con l&#39;inibitore di enzima specifico condotto un ~ 2 volte più elevata respirazione basale (Figura 4A), che è stata associata con un aumento deposizione di lipidi soprattutto nel telencefalo e sotto la vescicola otica (Figura 4B, C). pload/4300/4300fig1highres.jpg &quot;/&gt; Figura 1. Rappresentazione schematica di trattamento chimico di embrioni di zebrafish. Wildtype, geneticamente manipolati, trattati farmacologicamente o embrioni di zebrafish sono sfondo. <img src="/files/ftp_upload/4300/4300fig2.jpg" alt="Figura 2" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/4300/4300fig2highres.jpg"/> Figura 2. XF24 piatto isolotto impostare. (A) Quattro pozzi contenere mezzo embrionale solo come il controllo della temperatura (indicate con una X) e gli altri contengono un embrione / bene. (B) Close-up di un pozzo (C6) che mostra un 50 embrione wild type hpf trattati con veicolo (DMSO) coperta da una schermata di acquisizione isolotto (punta di freccia). <img src="/files/ftp_upload/4300/4300fig3.jpg" alt="Figura 3" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/4300/4300fig3highres.jpg"/> Figura 3. Respiratparametri di ioni per selvatici di tipo 50 embrioni di zebrafish HPF. (A) Per ogni misura, la media dei 20 embrioni singoli è presentato. Respirazione basale (media: 299,7; SD: 75.7; SEM: 16.9), la respirazione massima (media: 387,4; SD: 93.3; SEM: 20,9), la capacità respiratoria di ricambio (media: 87,7; SD: 72.0; SEM: 16.1). (B) Per ciascuna misurazione, la media dei 20 singoli risultati è presentato. Basale respirazione mitocondriale; respirazione mitocondriale a causa di fatturato ATP mitocondriale respirazione disaccoppiato e non mitocondriale respirazione. Mt: mitocondriale; SRC: ricambio capacità respiratoria; SD: Deviazione Standard, SEM: Errore standard della media. I risultati sono presentati in pmol di O 2 consumata / min / embrione. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/4300/4300fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per ingrandire la figura</a> . <img src="/files/ftp_upload/4300/4300fig4.jpg" alt="Figura 4" /> Figura 4. Rappresenrisultati rappresentativi dell&#39;esposizione a sostanze chimiche sulla respirazione basale e la deposizione di lipidi. (A, B) 50 HPF embrioni colorati con olio rosso O in vista laterale. L&#39;embrione incubate con l&#39;inibitore selettivo (B) mostra più la colorazione Oil-Red-O nel telencefalo (punta di freccia) e sotto la vescicola otica (freccia) rispetto ad un veicolo trattato con embrione di controllo. (C) respirazione basale mostra un aumento di circa 2 volte negli embrioni trattati chimicamente (n = 10 embrioni per gruppo). I risultati sono presentati in pmol di O 2 / min / embrione.

Zebrafish rappresenta un potente modello vertebrato che è stato sotto-utilizzato per studi metabolici. Qui si descrive un metodo rapido per misurare la<em&gt; In vivo</em&gt; Profilo metabolico di zebrafish in via di sviluppo che permette la comparazione di diversi parametri della funzione mitocondriale tra geneticamente o farmacologicamente embrioni manipolati, aumentando in tal modo l&#39;applicabilità di questo organismo.

Analisi Profilo metabolico di embrioni di zebrafish

Un obiettivo crescente nel campo del metabolismo è determinare l'impatto della genetica sui diversi aspetti della funzione mitocondriale. Comprendere questi...

L'obiettivo generale del seguente protocollo è misurare il profilo metabolico di embrioni di zebrafish in risposta a specifiche alterazioni genetiche o fisiologiche. Questo viene ottenuto innanzitutto modulando un particolare percorso genetico o fisiologico mediante un composto farmacologico selettivo. Successivamente, quando sono stati raggiunti gli stadi di sviluppo desiderati, la respirazione basale viene misurata negli embrioni di controllo e in quelli trattati utilizzando l'analizzatore Seahorse XF 24.Successivamente, i parametri della respirazione vengono calcolati dai dati ottenuti, risultati che rivelano come i profili metabolici possano essere studiati nel pesce zebra in via di sviluppo in vivo, e come tali profili possano essere modulati mirando a un gene specifico durante lo sviluppo embrionale. Il principale vantaggio del metodo rispetto alle tecniche già disponibili, come i saggi cellulari o la misurazione indiretta della respirazione, consiste nel fatto che si lavora con l'organismo intero, un intero embrione, permettendo di esaminare tutti gli aspetti della respirazione mitocondriale. Questa tecnica può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo del metabolismo misurando la respirazione dell'intero animale e la funzione mitocondriale.Per iniziare il trattamento, raccogliere gli embrioni di pesce zebra dopo la fecondazione per l'ibridazione in situ o la colorazione con Oil Red O a 0,2 millimoli di 1, fenil-2-tio urea. Per prevenire la formazione di pigmenti, incubare gli embrioni per circa 26 ore. Aggiungere il composto desiderato a una concentrazione finale appropriata, includendo un controllo con solo veicolo, prima di utilizzare l'analizzatore Seahorse XF 24; eseguire la calibrazione che ospita il flussimetro di ossigeno e idrogeno per preparare la piastra XF 24 a 24 pozzetti per isolotti.Iniziare aggiungendo 700 microlitri di mezzo E tre a ciascun pozzetto. Quindi aggiungere un embrione a 20 dei pozzetti per assicurare che il campione rimanga nella camera di misurazione. Durante tutto il saggio, applicare una schermatura con occhiello al di sopra di ciascun pozzetto.10 dei pozzetti vengono utilizzati per gli embrioni di controllo, indicati con una C, e 10 pozzetti vengono utilizzati per gli embrioni trattati, indicati con una T. Le caselle nere indicano i pozzetti senza embrioni, utilizzati per controllare le fluttuazioni di temperatura attraverso la piastra. Ora inserire la piastra nell'analizzatore Seahorse. Per misurare la respirazione, utilizzare il programma di respirazione basale e respirazione massima per stabilire la respirazione basale.Misurare tre volte per due minuti ciascuna, attendendo un minuto tra una misurazione e l'altra, successivamente aggiungere il complessante mitocondriale FCCP a una concentrazione finale di 2,5 micromolare. Ripetere il ciclo di misurazione da cinque a otto volte dopo aver stabilito la respirazione basale. Utilizzare il programma relativo al turnover dell'ATP e alla perdita di protoni per misurare il turnover dell'ATP in presenza di 25 micromolare di oligomicina, un inibitore della sintasi dell'ATP, ed eseguire il ciclo di misurazione otto volte.Quindi utilizzare i valori di respirazione ottenuti per calcolare la differenza tra la respirazione indotta da un ligando e la respirazione mediata e la respirazione basale. Ripetere questo procedimento aggiungendo 25 micromolar di rotenone, un inibitore del complesso I. Quindi determinare la respirazione disaccoppiata calcolando la differenza tra la respirazione oligomicina-mediata e la respirazione successiva all'aggiunta di rotenone al termine del programma.L'analizzatore di ippocampo calcola i valori medi di 10 embrioni di controllo e 10 embrioni trattati chimicamente per eseguire l'analisi del grasso. Colorazione con olio rosso O per analizzare il deposito lipidico. Quando gli embrioni trattati e non trattati raggiungono le 50 ore post-fertilizzazione, utilizzare pinzette fini per montarli e fissarli in paraformaldeide al 4% in PBS per tutta la notte a quattro gradi Celsius.Lavare gli embrioni una volta in PBT per cinque minuti, quindi incubarli in alcol propanoico al 60% per un'ora, seguita da due ore in Oil Red O allo 0,3% e alcol propanoico al 60%. Risciacquare brevemente gli embrioni due volte in alcol propanoico al 60%, quindi una volta in PBT. Infine, trasferire gli embrioni dal 30-50% al 75% di glicerolo per la ripresa fotografica, come mostrato qui. Il trattamento degli embrioni con un inibitore enzimatico specifico ha determinato un aumento di circa due volte della respirazione, associato a un incremento del deposito lipidico, in particolare nel cefalone e al di sotto della vescicola otica. Durante il tentativo di questa procedura, è importante lavorare con embrioni allo stesso stadio di sviluppo.Questo è particolarmente vero quando si confronta la respirazione mitocondriale tra un embrione controllo e un embrione mutante o trattato farmacologicamente, che potrebbe presentare un lieve ritardo nello sviluppo. Pertanto, lo sviluppo di questa tecnica ha permesso ai ricercatori nel campo del metabolismo di esplorare la respirazione a livello di organismo intero e la funzione mitocondriale utilizzando il pesce zebra come modello vertebrale.

metabolic-profile-analysis-of-zebrafish-embryos

Research

Ricerca

JoVE Journal

Biology

Biologia

Riportiamo lo sviluppo di un sistema automatizzato per l'imaging e l'analisi di zebrafish embrioni transgenici in piastre a pozzetti multipli. Questo dimostra la capacità di misurare gli effetti dose-dipendente di una piccola molecola, BCI, sull'espressione del gene del fattore di crescita dei fibroblasti giornalista e fornire tecnologia per stabilire high-throughput schermi chimici zebrafish.

Sviluppo di imaging automatizzati e analisi chimiche per gli schermi zebrafish.

Questo video dimostra l'uso della gascromatografia nello spazio di testa per determinare le concentrazioni di etanolo negli embrioni di zebrafish. Questo metodo fornisce uno strumento utile per l'analisi qualitativa e quantitativa dei composti organici volatili.

Gascromatografia dello spazio di testa: una tecnica per valutare la concentrazione di etanolo negli embrioni di zebrafish

Qui riportiamo un protocollo per misurare lo stress ossidativo negli embrioni viventi di zebrafish. Questa procedura consente di rilevare le specie reattive dell'ossigeno (ROS) sia nei tessuti embrionali interi che nelle popolazioni di singole cellule. Questo protocollo realizzerà analisi sia qualitative che quantitative.

Analisi dello Stress Ossidativo in embrioni di zebrafish

I pesci zebra sono un importante organismo modello per lo studio dell'omeostasi energetica.  Utilizzando un indicatore redox sensibile al NADH2, alamar Blue, abbiamo sviluppato un test che misura il tasso metabolico delle larve di zebrafish in un formato di piastra a 96 pozzetti e può essere applicato alla scoperta di farmaci o geni.

High Throughput<em&gt; Danio Rerio</em&gt; Energia spese Assay

Questo protocollo presenta un approccio per l'analisi del trascrittoma intero da embrioni di zebrafish, larve, o ordinato cells. Includiamo isolamento di RNA, analisi dei percorsi dei dati RNASeq e convalida qRT-PCR-basata di cambiamenti di espressione genica.

Preparazione dei campioni e analisi dei dati di espressione genica basati su RNASeq dallo Zebrafish

Zebrafish recentemente sono stati utilizzati come un sistema di modello in vivo per studiare il tempo di replicazione del DNA durante lo sviluppo. Qui è dettagliato i protocolli per l'utilizzo di embrioni di zebrafish per tempo di replicazione di profilo. Questo protocollo può essere facilmente adattato per studiare il tempo di replicazione in mutanti, tipi di cellule individuali, modelli di malattia e altre specie.

Tempo di replicazione del DNA utilizzando Zebrafish come un sistema di modello In Vivo di profilatura

Questo lavoro descrive un protocollo per quantificare i livelli di etanolo in un embrione di pesce zebra utilizzando la cromatografia del gas dello spazio della testa da metodi di esposizione adeguati alla lavorazione degli embrioni e all'analisi dell'etanolo.

Quantificazione dei livelli di etanolo negli embrioni di pesce zebra utilizzando la cromatografia dello spazio della testa

La rigenerazione del muscolo scheletrico è guidata dalle cellule staminali muscolari residenti nei tessuti, che sono compromesse in molte malattie muscolari come la distrofia muscolare, e questo si traduce nell'incapacità del muscolo di rigenerarsi. Qui, descriviamo un protocollo che consente l'esame della rigenerazione muscolare in modelli di zebrafish di malattia muscolare.

Esame della rigenerazione muscolare nei modelli zebrafish di malattia muscolare

Questo protocollo descrive una procedura di screening farmacologico nelle larve di zebrafish 3-7 giorni dopo la fecondazione, seguita da una valutazione morfologica.

Screening di piccole molecole e test di tossicità nelle larve di zebrafish in fase iniziale

Le RASopatie sono sindromi genetiche multisistemiche causate dall'iperattivazione della via RAS-MAPK. Varianti potenzialmente patogene in attesa di convalida emergono continuamente, mentre le scarse evidenze precliniche limitano la terapia. Qui, descriviamo il nostro protocollo in vivo per testare e convalidare in modo incrociato i livelli di attivazione ERK associati alla RASopathy e la sua modulazione farmacologica durante l'embriogenesi mediante imaging FRET dal vivo in zebrafish...

Un protocollo efficiente per valutare la modulazione dell'attività di ERK nei primi modelli di sindrome di Noonan del pesce zebra tramite microscopia FRET dal vivo e immunofluorescenza

Questo protocollo descrive un metodo di microscopia ottica a basso costo per valutare la morfologia e la funzione cardiaca negli embrioni di zebrafish, consentendo una valutazione riproducibile della cardiotossicità dello sviluppo senza la necessità di sistemi di imaging avanzati.

Imaging cardiaco funzionale in embrioni di zebrafish utilizzando microscopia standard e analisi video: applicazioni nella ricerca ambientale e biomedica

Scopri come misurare il profilo metabolico in vivo negli embrioni di zebrafish con l'analizzatore Seahorse XF 24. Questo metodo consente di studiare la funzione mitocondriale nell'organismo completo e valutare gli effetti di manipolazioni genetiche e farmacologiche.

Analisi Profilo metabolico di embrioni di zebrafish

Esplora altri video