Name: Enumerazione delle popolazioni dei leucociti del sangue periferico per le principali studi clinici multicentrici utilizzando un intero saggio Fenotipizzazione Sangue (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-09-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 45 s
Description: Impara un saggio di fenotipizzazione del sangue per enumerare le popolazioni di leucociti in studi clinici multicentrici. Questo metodo standardizzato utilizza citometria a flusso e anticorpi fluorescenti per analisi accurate.

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Ringraziamo Jessica Jones, Erica Clark, Costanza Ducar, Donna Smith, Roy Lewis, Lily Apedaile, Joanne Wiesner, Devin Adams, Corey McBain e Stephen Voght per la loro assistenza nello sviluppo di questo manoscritto metodo, e video. Questo lavoro è stato sostenuto dalla Fondazione Bill e Melinda Gates Foundation CAVD concessione 38645 (MJM) e National Institutes of concede Salute UM1 AI068618 e U01 AI069481 (MJM). EA-N. è sostenuto da NIH Grant T32 AI007140. Ringraziamo il James B. Charitable Trust Pendleton per la loro donazione generoso equipaggiamento.

Nota: per proteggere i fluoroforo anticorpi coniugati dalla luce, eseguire tutte le fasi di un bio-Armadio di sicurezza con la luce spenta. 1. Antibody colorazione Preparazione del pannello <ol><li> Il pannello colorazione anticorpo può essere trovato in Tabella 1. Concentrazione di anticorpi dovrebbe essere definita mediante titolazione con sangue intero e utilizzando la stessa attrezzatura citometria di flusso e le procedure che saranno utilizzati per acquisire i campioni fenotipizzazione macchiati. </li><li> Una volta che i titoli di colorazione adeguati sono determinati, unire tutti gli anticorpi in una miscela unica in un lock-tappo del tubo. Aggiungere tampone di lavaggio flusso (Dulbecco PBS con 2% di siero fetale bovino inattivato) per portare il volume totale di 100 microlitri. Scala la miscela per il numero di campioni che colorati. Questa miscela può essere conservato a 4 ° C per un massimo di otto settimane. </li></ol> 2. Colorazione <ol><li> Se il sangue raccolto deve essere utilizzato per altri scopi in annunciodizione di questo saggio, impostare una aliquota parte mentre più sensibili al tempo procedure sono eseguite il sangue residuo. L&#39;aliquota può essere conservato a temperatura ambiente per 4 ore dopo l&#39;iniezione in vena senza significativa perdita di cellule. </li><li> Verificare che non vi è un intatto tallone pellet sul fondo del tubo Trucount ed etichetta il tubo per identificare il campione viene macchiato. Negli studi clinici HVTN, il Laboratorio di Data Management System (Frontier Science and Technology Research Foundation, Amherst, NY) è usato per etichettare e tenere traccia dei campioni colorati. </li><li> Registrare i numeri di lotto e le date di scadenza di tutti i reagenti. Registrare il numero di conteggio Trucount tubo cordone fornito dal produttore sulla borsa di tubi, assicurarsi che il numero di lotto sulla borsa corrisponde al numero di lotto sul tubo. </li><li> Utilizzare pipettaggio inverso per pipettare esattamente 100 pl di sangue intero nella provetta Trucount, appena sopra il fermo metallico. Evitare sbavature di sangue lungo il lato del tubo. </li><li&gt; Uso regolare (in avanti) tecnica di pipettaggio, pipettare 100 pl del pannello misto colorazione anticorpale (Vedi Tabella 1) nel tubo Trucount. Tappare la provetta e vortex a bassa velocità per circa 15 secondi per mescolare. Ispezionare visivamente il tubo per garantire che il pellet tallone è completamente sciolto. </li><li> Incubare la provetta Trucount per 15 minuti a temperatura ambiente (15-30 ° C) al buio. </li><li> Se necessario, diluire una aliquota di 10 × soluzione FACS Lisi a 1X con DIH 2 O. Aggiungere 900 microlitri 1 × soluzione FACS Lisi al tubo. </li><li> Tappare la provetta e agitare bene a bassa velocità per circa 15 secondi per mescolare. Spingere verso il basso il tappo saldamente in posizione di bloccaggio sul tubo e sigillare con la pellicola di laboratorio. </li><li> Conservare il tubo a -65 ° C a -95 ° C fino a quando il campione è pronto per la spedizione al laboratorio di analisi centrale o per analisi in casa. I campioni sono stabili in questa fase per almeno quattro settimane. Se la spedizione o il saggio immediatamentetamente, questo passaggio può essere omesso. </li></ol> 3. Spedizione Nota: Le istruzioni che seguono utilizzano un sistema di trasporto isolato da Saf-T-Pak, Inc. idoneo alla spedizione categoria B sostanze biologiche esenti secondo la International Air Transport Association e (IATA). Se l&#39;analisi dei campioni nella stessa posizione come la colorazione si è verificato, andare alla sezione 4. <ol><li> I campioni possono essere spediti immediatamente dopo colorazione o una volta che sono congelati a -65 ° C a -95 ° C. Avvolgere ogni tubo completamente in pellicola e mettere in casella campione macchiato. Posizionare la scatola macchiato campione all&#39;interno di una tenuta poli-borsa con materiale assorbente. </li><li> Posizionare la tenuta poly-bag e contenuto in un sacchetto di Tyvek e sigillare con meno aria possibile nel sacchetto. </li><li> Posizionare il pacchetto campione (campione all&#39;interno imballaggio secondario) all&#39;interno della scatola interna marrone. </li><li> Posizionare l&#39;interno marrone bbue all&#39;interno del torace polistirolo, fissandolo nella dentellatura per evitare che si spostino. </li><li> Riempire la cassa in polistirolo con ghiaccio secco (circa 8 kg) e posizionare il coperchio a tenuta sul petto. </li><li> Nastro saldamente il contenitore di spedizione e la nave come sostanza biologica, Categoria B (UN3373) con il ghiaccio proprio a secco (UN1845) le marcature; seguire IATA PI-650 istruzioni. </li><li> Al ricevimento, i campioni vengono conservati a -65 ° C a -95 ° C fino a che vengono analizzati. </li></ol> 4. Scongelamento e Citometria a Flusso analisi <ol><li> Togliere il campione macchiato dal freezer a scongelare a temperatura ambiente al buio prima di raccogliere il citofluorimetro. Se la raccolta di dati su più di un campione, standardizzare il processo per tutte le provette sfalsando scongelamento modo che i tubi non sono seduti a temperatura ambiente per più di 1 ora ciascuno. </li><li> I campioni devono essere acquisiti utilizzando un citofluorimetro quattro laser dotato di filtri adatti, come il BD LSRII. Utilizzare standard di calibrazione citometro e metodi di compensazione fluorescenza per i dati di raccolta 4. </li></ol> Nota: Non impostare soglie scatter scatter in avanti o di lato durante la raccolta 5. Perline Trucount può scendere al di sotto della soglia impostata più basso possibile per questi parametri che causano un sottoinsieme di perline di non essere contabilizzati durante l&#39;analisi. Se richiesto dallo strumento di fissare una soglia, impostare il più basso possibile Am Ciano soglia canale. Perché leucociti CD45 + colorati con il pannello sarà Am Ciano positivo, e perline Trucount anche fluorescenza nel Ciano Am canale, ciò dovrebbe consentire di tutti i dati pertinenti devono essere opportunamente raccolti. <ol start="3"><li> Agitare la provetta per 5 secondi prima di caricare sul citofluorimetro. Perline Trucount reagiscono molto in molti canali. Porta le perle al momento della raccolta, trovando la popolazione che è altamente doppio positivo per Cy5 PE e APC (i due colors che più facilmente distinguere le perle dalle celle può variare a seconda strumentazione). Selezionare la porta tallone come arresto del cancello, e registrare i dati fino a quando almeno 20.000 perle vengono acquisiti. </li><li> Analizzare i dati utilizzando un software appropriato, come FlowJo (Treestar; Ashland, OR). Figura 1 mostra lo schema di gating utilizzata per l&#39;analisi delle diverse popolazioni leucocitarie da un pareggio rappresentante sangue di controllo. </li></ol> 5. Calcoli Trucount <ol><li> Ogni tubo Trucount contiene un pellet liofilizzato di perline fluorescenti. Dopo l&#39;aggiunta di liquido al tubo e di vortex, le perle dovrebbe diventare equamente distribuiti in tutto il campione. Il numero di perle in pellet varia leggermente da lotto e si trova sulla custodia per i tubi. </li><li> Porta le perline Trucount e delle popolazioni di cellule, come mostrato in Figura 1 per determinare i conteggi di eventi per ogni popolazione. Confrontando il numero di eventi in il cancello tallone al numero totale di perline originariamente nel tubo consente di determinare il rapporto di campione prelevato, che può quindi essere utilizzato per determinare la concentrazione assoluta (cioè cellule / mL) per ogni popolazione. La seguente equazione può essere utilizzato per questo scopo: La concentrazione cellulare (# cellule / pl sangue intero) = [# di popolazione (eventi / eventi / # # perlina perline totali in pellet)] / 100 ul. </li></ol> 6. Risultati rappresentativi <img src="/files/ftp_upload/4302/4302fig1.jpg" alt="Figura 1" fo:content-width="5.5in" fo:src="/files/ftp_upload/4302/4302fig1highres.jpg" /> Figura 1. Regime Soppressione utilizzato per l&#39;analisi delle principali popolazioni leucocitarie che mostrano i dati rappresentativi di un volontario sano. A) perline Trucount (i) sono gated ed esclusi dalle cellule. Granulociti (ii) sono delineati e lympohcytes e monociti sono divisi in 3 popluations: CD14linfociti negativi (iii), tutte le cellule CD14 negative (iv), e non-linfociti (v). B) CD14 linfociti negativi sono gated per distinguere cellule T CD4 + (vi), cellule T CD8 + (vii), cellule B (viii), CD56 cellule luminose NK (ix), CD56 cellule dim NK (x), e CD56 cellule negative NK (xi). C) Tutte le cellule CD14 negative sono gated distinguere mieloide (xii) e plasmacitoidi (xiii) cellule dendritiche. D) non-lympocytes sono gated di distinguere non classici (xiv), intermedi (xv), e classica (xvi) monociti. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/4302/4302fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per ingrandire la figura</a> . Sottopopolazioni cellulari più specifiche che non sono mostrati nella Figura 1 (ad esempio, cellule NKT o neutrofili) può anche essere distinti utilizzando il pannello presentiamo, e lo schema di gating può essere esteso o modificato per soddisfare esigenze specifiche di studio. Alcuni passi gating indicati sono unici a questo metodo. Di particolare nota, un cancello inclusione ecancello esclusione rimangono attorno alle perline Trucount e posti uno sopra l&#39;altro, uno per cancello per contare le perline, e uno di escludere le perline dall&#39;analisi cellulare (Figura 1A). Inoltre, poiché i linfociti, monociti e granulociti non sono così facilmente distinguibili nel sangue intero in quanto sono nelle cellule mononucleari del sangue periferico da scatter in avanti e laterale scatter, gating queste cellule con CD45 espressione e side scatter è spesso necessario (Figura 1A). Granulociti contaminanti (cerchio) che non potevano essere separati da linfociti e monociti con CD45 e side scatter si distinguono in alcuni appezzamenti per la loro alta espressione CD16 (Figura 1C e 1D Figura). Il numero di granulociti contaminanti è generalmente piccolo, e non interferiscono con gating monociti e cellule NK.

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<li>Vuckovic, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+dendritic+cells+in+clinical+practice+using+a+new+whole+blood+single-platform+TruCOUNT+assay%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Monitoring dendritic cells in clinical practice using a new whole blood single-platform TruCOUNT assay.</a> J. Immunol Methods. 284, 73-87 (2004).</li>
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</ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

In questo rapporto, presentiamo una perlina metodo basato per l&#39;enumerazione di popolazioni leucocitarie in sangue fresco intero mediante citometria di flusso e coprire i parametri necessari per il suo utilizzo in uno studio clinico multicentrico, con l&#39;analisi del campione centralizzata. Questo metodo si basa su e ottimizza il protocollo BD Trucount e consente il suo utilizzo affidabile in un ambiente clinico multicentrico. Il saggio colorazione è semplice e richiede circa 45 minuti per eseguire, rendendo così ...

<table border="1"><tbody><tr><td> Reagente Nome </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td></tr><tr><td> Trucount assoluti Tubi di conteggio </td><td> BD Biosciences </td><td> 340334 </td></tr><tr><td> FACS 10X Soluzione di Lisi </td><td> BD Biosciences </td><td> 349202 </td></tr><tr><td> Categoria B &amp; Sistema spedizione Esente, isolato </td><td> Saf-T-Pak </td><td> STP-320 </td></tr><tr><td> AmCyan CD45 anticorpo monoclonale </td><td> BD Biosciences </td><td> 339192 </td></tr><tr><td> CD3 FITC anticorpo monoclonale </td><td> BD Biosciences </td><td> 349201 </td></tr><tr><td> CD8 PerCP-Cy 5,5 anticorpo monoclonale </td><td> BD Biosciences </td><td> 341051 </td></tr><tr><td> CD4 Alexa Fluor 700 anticorpi monoclonalidy </td><td> BD Biosciences </td><td> 557922 </td></tr><tr><td> HLA-DR ECD anticorpo monoclonale </td><td> Beckman Coulter </td><td> IM3636 </td></tr><tr><td> V450 CD14 anticorpo monoclonale </td><td> BD Biosciences </td><td> 560349 </td></tr><tr><td> CD19 PE anticorpo monoclonale </td><td> BD Biosciences </td><td> 555413 </td></tr><tr><td> CD16 APC-H7 anticorpo monoclonale </td><td> BD Biosciences </td><td> 560195 </td></tr><tr><td> CD56-PE Cy7 anticorpo monoclonale </td><td> BD Biosciences </td><td> 335791 </td></tr><tr><td> CD11c APC anticorpo monoclonale </td><td> BD Biosciences </td><td> 559877 </td></tr><tr><td> CD123 PE-Cy5 anticorpo monoclonale </td><td> BD Biosciences </td><td> 551065 </td></tr></tbody></table>

enumerazione delle popolazioni dei leucociti del sangue periferico per le principali studi clinici multicentrici utilizzando un intero saggio fenotipizzazione sangue

Enumeration of Major Peripheral Blood Leukocyte Populations for Multicenter Clinical Trials Using a Whole Blood Phenotyping Assay

Crioconservazione dei leucociti del sangue periferico è ampiamente usato per conservare le cellule per la valutazione della risposta immunitaria negli studi clinici e offre molti vantaggi per la facilità e la standardizzazione delle valutazioni immunologiche, ma gli effetti negativi di questo processo sono stati osservati in alcuni sottogruppi di cellule, come i granulociti, cellule B , e cellule dendritiche 1-3. Saggiare leucociti freschi fornisce un quadro più preciso della stato in vivo delle cellule, ma è spesso difficile da eseguire nel contesto di ampi studi clinici. Saggi su cellule fresche sono dipendenti da impegni di volontariato e tempi e, se in termini di tempo, la loro applicazione può essere poco pratico a causa delle ore di lavoro richieste del personale di laboratorio. Inoltre, quando le sperimentazioni sono condotte a molteplici centri, laboratori con le risorse e la formazione necessarie per eseguire i saggi non può essere situato in prossimità sufficiente a siti clinici. Per risolvere questi problemi, abbiamo sviluppatopato un 11-colore del pannello colorazione anticorpo che può essere utilizzato con tubi Trucount (Becton Dickinson, San Jose, CA) e al fenotipo enumerare le popolazioni principali leucociti nel sangue periferico, producendo più robusto tipo cellulare informazioni specifiche di saggi come un emocromocitometrico completo (CBC), o con saggi disponibili in commercio pannelli progettati per tubi Trucount che macchiano solo per alcuni tipi di cellule. La procedura di colorazione è semplice, richiede solo 100 ml di sangue intero fresco, e dura circa 45 minuti, rendendo così possibile la standard di sangue laboratori di trasformazione da eseguire. Si è adattato dal tubo BD scheda tecnica Trucount ( <a href="http://www.bdbiosciences.com/external_files/is/doc/tds/Package_Inserts_CE/live/web_enabled/23-3483-06_PI_Trucount tubes_CE_EN.pdf" target="_blank">versione 8/2010</a> ). Il cocktail di anticorpi colorazione può essere preparata in anticipo in massa a un laboratorio saggio centrale e spediti a laboratori di lavorazione del sito. Tubi colorati possono essere fissatie congelati per la spedizione al laboratorio analisi centrale per l&#39;analisi di citometria a flusso multicolore. I dati generati da questo pannello colorazione può essere utilizzato per monitorare variazioni di concentrazione dei leucociti nel tempo in relazione all&#39;intervento e potrebbe facilmente essere ulteriormente sviluppato per valutare gli stati di attivazione di specifici tipi cellulari di interesse. In questo rapporto, dimostriamo la procedura utilizzata dal sangue di elaborazione tecnici di laboratorio per eseguire la colorazione di sangue intero fresco e la procedura per analizzare questi campioni macchiati in un laboratorio analisi centrale di supporto di uno studio clinico multicentrico. I dettagli del video la procedura in quanto viene eseguito nel contesto di un progetto di sperimentazione clinica del sangue nel HIV Vaccine Trials Network (HVTN).

In questo rapporto, dimostriamo la procedura di colorazione e l&#39;analisi di un test di fenotipizzazione effettuato su sangue intero fresco per enumerare le principali popolazioni innata e adattiva dei leucociti. Sottolineiamo considerazioni per l&#39;esecuzione di queste procedure nel contesto di uno studio clinico multicentrico.

Enumerazione delle popolazioni dei leucociti del sangue periferico per le principali studi clinici multicentrici utilizzando un intero saggio Fenotipizzazione Sangue

La crioconservazione dei leucociti del sangue periferico è ampiamente utilizzata per preservare le cellule destinate alle valutazioni della risposta immunitaria nei trial clinici e offre molti...

Questo video descrive la procedura sviluppata dall'HIV Vaccine Trials Network presso il Fred Hutchinson Cancer Research Center per la colorazione di sangue intero fresco in studi clinici multicentrici, da analizzare successivamente in un laboratorio centralizzato. La procedura utilizza provette tru count prodotte da Becton Dickinson Biosciences, ognuna contenente un pellet liofilizzato che si scioglie durante la preparazione del campione, rilasciando un numero noto di microsfere fluorescenti. Anticorpi fluorescenti vengono impiegati per la colorazione di marcatori di superficie specifici per diverse popolazioni cellulari.Il numero di cellule in queste diverse popolazioni può essere confrontato con il numero di microsfere fluorescenti durante l'analisi di citometria a flusso e le concentrazioni assolute delle diverse popolazioni di leucociti nel sangue intero possono essere monitorate nel tempo in relazione all'intervento. Salve, mi chiamo Erica Anderson Nissan e sono scienziata presso l'HIV Vaccine Trials Network. La procedura che state per vedere è una procedura che abbiamo sviluppato per l'uso nei nostri trial clinici multicentrici.In questi studi, i tecnici di laboratorio che si occupano della lavorazione del sangue ricevono campioni di sangue intero fresco, li colorano con anticorpi marcati con fluorocromi e successivamente spedicono i campioni a un laboratorio centralizzato in grado di analizzarli mediante citometria a flusso. Il sangue intero fresco non viene spesso analizzato negli studi clinici a causa di problemi di costo e fattibilità, ma abbiamo sviluppato un pannello di colorazione con un singolo anticorpo in grado di identificare le principali popolazioni di leucociti nel sangue periferico; la colorazione di queste popolazioni richiede meno di 45 minuti, rendendola fattibile per l'uso negli studi clinici nell'ambito dell'HVTN. Stiamo utilizzando questo pannello per comprendere gli eventi precoci che si verificano dopo la vaccinazione con vaccini sperimentali contro l'HIV, ma questo pannello PI potrebbe essere ulteriormente modificato per concentrarsi su tipi cellulari di interesse specifico per il singolo ricercatore. Grazie mille per averci seguito e speriamo che questa procedura possa esservi utile in futuro.La Tabella Uno mostra un pannello di coloranti anticorpali a 11 colori sviluppato per fenotipizzare e enumerare le principali popolazioni di leucociti presenti nel sangue periferico. Il cocktail anticorpale viene preparato dal laboratorio centrale di saggio e inviato ai laboratori di elaborazione per garantire coerenza tra i diversi siti e consentire di testare i cocktail su un prelievo di sangue di controllo prima dell'utilizzo per la colorazione dei campioni del trial. Ogni anticorpo coniugato fluorescente viene titolato separatamente, quindi gli anticorpi vengono combinati utilizzando i titoli appropriati in una singola miscela con tampone di lavaggio per citofluorimetria contenente PBS delcos con siero fetale bovino attivato al 2%.Il cocktail di anticorpi è etichettato con un numero di lotto e una data di scadenza e viene spedito dal laboratorio centrale del saggio ai laboratori di elaborazione mediante un sistema di imballaggio che mantiene una temperatura di quattro gradi Celsius durante il trasporto. Una volta ricevuto, il pannello di marcatura con anticorpi può essere conservato a quattro gradi Celsius al buio per un massimo di otto settimane. Dopo la marcatura, viene utilizzata la soluzione BD fax per lisare i globuli rossi e fissare le colorazioni con anticorpi, preservando al contempo i leucociti.La soluzione viene ricevuta dal produttore a una concentrazione 10x e viene diluita di uno a dieci nel laboratorio centrale di saggio con acqua deionizzata. La soluzione diluita viene quindi etichettata con un numero di lotto e una data di scadenza e spedita a temperatura ambiente ai laboratori di elaborazione al momento della ricezione. La soluzione per il dosaggio del conteggio reale viene conservata a temperatura ambiente compresa tra 15 e 30 gradi Celsius prima del prelievo del sangue per la colorazione del conteggio assoluto.Il laboratorio di elaborazione deve assicurarsi che tutti i reagenti appropriati siano stati ottenuti dal laboratorio centrale del saggio. Questi includono i tubi BD TRU count, il pannello combinato di marcatura con anticorpi e una soluzione di licenza x fax. L'HVTN utilizza un sistema di gestione dei dati di laboratorio per registrare tutte le informazioni rilevanti per ogni campione.Un codice identificativo univoco viene stampato su un'etichetta che è posta sul tubo del conteggio effettivo. Per tracciare il campione durante tutto il processo, etichettare una provetta criogenica per identificare il campione da colorare. Questa di solito includerà un identificatore del paziente o del volontario, un identificatore della visita e la data del prelievo del sangue. Aliquotare la quantità richiesta di sangue nella provetta criogenica etichettata utilizzando una tecnica asettica.La quantità di sangue utilizzata per la colorazione dipende dal pannello di colorazione impiegato, ma di solito è di 50 o 100 microlitri per pannello. Il vial criogenico può quindi essere messo da parte fino a quattro ore a temperatura ambiente prima della colorazione. Ulteriori procedure sensibili al tempo vengono eseguite sul sangue rimanente.Verificare che ci sia un pellet di perle intatto sul fondo del tubo ed etichettare il tubo tru count. Registrare le informazioni relative al campione, i numeri di lotto e le date di scadenza di tutti i reagenti. I moduli di lavoro sono utili per tracciare queste informazioni durante un trial clinico.Il numero di perle nel tubo tru count e il numero di lotto sono riportati sulla parte anteriore della confezione dei tubi tru count. Quando si è pronti per iniziare il processo di colorazione tru count, assicurarsi di avere tutti i materiali e i reagenti pronti per l'uso all'interno della cappa a sicurezza biologica. Questi includono l'aliquota di sangue etichettata come tubo tru count, il tubo del pannello di anticorpi coniugati per la colorazione, una soluzione x fax lacing, micropipette da 200 microlitri e da 1000 microlitri con relative punte, candeggina, pellicola da laboratorio e un timer dopo la colorazione.Sarà inoltre necessaria una scatola per campioni colorati, ma questa non deve trovarsi all'interno della cappa. La quantità di sangue e di anticorpo da utilizzare varia a seconda dei tipi cellulari identificati dal pannello e del numero di cellule necessarie per un'analisi adeguata. Ogni pannello viene testato su campioni di controllo per determinare la quantità ottimale di sangue da utilizzare per la colorazione, mentre la quantità di anticorpo impiegata corrisponde alla quantità di sangue utilizzata per il pannello mostrato in questo video.Prima della pipettaggio verranno utilizzati 100 microlitri di sangue e 100 microlitri di anticorpo. Mescolare il sangue capovolgendo delicatamente il tubo diverse volte ed eseguire delicatamente alcune aspirazioni e dispersioni con la pipetta. Per garantire ulteriormente un'adeguata miscelazione del sangue.Quindi utilizzare la pipettatura inversa per prelevare accuratamente il sangue intero dall'aliquota e trasferirlo nel tubo tru count appena sopra il fermo metallico. Evitare di spalmare il sangue lungo la parete del tubo. Sostituire la punta della pipetta tra un tubo tru count e l'altro.Ora è il momento di colorare il sangue con il pannello di anticorpi prima della pipettaggio. Mescolare il pannello di colorazione aspirando e dispensando delicatamente più volte. Aggiungere 100 microlitri della miscela di anticorpi al sangue nel tubo True Count.Non eseguire la pipettatura al contrario in questo passaggio, poiché comporterebbe lo spreco di un reagente prezioso. Chiudere il tubo e vorticare a bassa velocità per circa 15 secondi per favorire il mescolamento. Assicurarsi che il pellet di perle sia completamente disciolto.Coprire il tubo con della pellicola di alluminio e impostare un timer per colorare il sangue per 15 minuti. La quantità di soluzione one x fax slicing necessaria è nove volte la quantità di sangue utilizzata nel saggio; in questo esempio, si utilizzano 900 microlitri di soluzione one x fax slicing. Dopo l'incubazione di 15 minuti, aggiungere 900 microlitri di soluzione one x fax slicing al sangue colorato per fissare la colorazione e lisare i globuli rossi.La pipettaggio a rovescio non è necessario in questo passaggio. Chiudere il tubo e vorticare a bassa velocità per circa 15 secondi per mescolare. Premere saldamente il tappo in posizione di bloccaggio e sigillare.Con pellicola da laboratorio. Conservare le provette in una scatola scura o completamente avvolte nella stagnola a una temperatura compresa tra meno 65 e meno 95 gradi Celsius fino al loro invio al laboratorio centrale per il saggio. Fino ad oggi, i test hanno dimostrato che i campioni rimangono stabili fino a quattro settimane a questa temperatura; i campioni colorati devono essere spediti come sostanze biologiche di categoria B, seguendo le normative dell'Associazione Internazionale del Trasporto Aereo o IATA.Le normative prevedono che i campioni dell'HVTN vengano spediti settimanalmente dai laboratori di lavorazione al laboratorio centrale per i saggi, utilizzando un sistema di spedizione isolato prodotto da Safety Pack Ink, appositamente progettato per soddisfare questi requisiti. Quando si utilizza questo sistema, posizionare la scatola marrone interna all'interno del contenitore in polistirolo, fissandola nell'incavo per evitare spostamenti. Riempire completamente il contenitore con ghiaccio secco e attendere da cinque a dieci minuti per consentire alla scatola di raffreddarsi.Per preparare i campioni per la spedizione, avvolgere completamente ogni provetta e foglio di alluminio e posizionarli nella scatola per campioni colorati. Inserire materiale assorbente in un sacchetto di plastica a tenuta stagna insieme alla scatola per campioni colorati. Rimuovere l'aria in eccesso dal sacchetto e sigillarlo accuratamente.Posizionare il sacchetto di plastica impermeabile all'interno di un sacchetto in Tyvek. Ancora una volta, rimuovere tutta l'aria dal sacchetto prima della chiusura. Inserire il pacco del campione all'interno della scatola marrone interna e chiudere bene il coperchio sulla cassa in polistirolo.Fissare saldamente con nastro la scatola di spedizione e spedirla come sostanza biologica categoria B con le opportune indicazioni per il ghiaccio secco. Seguire le istruzioni IATA PI 650 nelle sperimentazioni cliniche multicentriche. È fondamentale tracciare i campioni durante le fasi di conservazione a breve termine, spedizione e conservazione a lungo termine.Il sistema di gestione dei dati utilizzato dall'HVTN consente la creazione di una bolla di accompagnamento che può essere importata nel database dei campioni presso il laboratorio centrale di analisi, dove i campioni verranno conservati e analizzati. Ciò permette di registrare quando i campioni sono stati spediti e ricevuti, dove sono stati conservati definitivamente e quando sono stati prelevati. Per l'analisi, rimuovere il campione colorato dal congelatore e lasciarlo scongelare a temperatura ambiente in una scatola oscura.Non più di un'ora prima della raccolta sul citometro a flusso. Se si raccolgono dati da più di un campione, scongelarli in modo sfalsato in modo che i tubi non rimangano a temperatura ambiente per più di un'ora; ciascun campione deve essere acquisito utilizzando un citometro a flusso a quattro laser dotato di filtri appropriati, come il BD LSR II, seguendo i metodi standard di calibrazione del citometro e di compensazione della fluorescenza per la raccolta dei dati, se richiesti dallo strumento. Per impostare una soglia, impostare la soglia più bassa possibile nel canale amaranto; vortexare il tubo del campione per cinque secondi prima del caricamento sul citometro a flusso.Le microsfere tru count del citometro fluorescono intensamente in molti canali. Delimita le microsfere durante il campionamento identificando la popolazione fortemente doppia positiva. Per PE SCI five e a PC, osserva che i due colori che distinguono più facilmente le microsfere dalle cellule possono variare a seconda dello strumento utilizzato.Selezionare la porta del bead tru count come porta di arresto e registrare i dati fino a quando non vengono acquisiti almeno 20.000 bead. Analizzare i dati utilizzando un software appropriato, come FlowJo. Ora illustreremo lo schema di gating utilizzato per l'analisi delle principali popolazioni di leucociti, utilizzando dati provenienti da un prelievo di sangue di controllo rappresentativo.È inoltre possibile distinguere sottopopolazioni cellulari più specifiche utilizzando il pannello, come le cellule NKT o i neutrofili, ma queste non verranno mostrate in questo esempio. Innanzitutto, viene disegnata una finestra di inclusione e una finestra di esclusione attorno alle microsfere per il conteggio tru, posizionate una sopra l'altra: una per ottenere le microsfere da utilizzare per il conteggio e l'altra per escludere le microsfere dall'analisi cellulare. Successivamente, i dati cellulari, escluse le microsfere, vengono analizzati mediante finestre di selezione per includere solo le cellule singole, utilizzando lo scatter anteriore in altezza rispetto allo scatter anteriore in area.Questo gate esclude anche piccoli detriti. Le cellule positive per CD45 vengono quindi selezionate, separando i granulociti da linfociti e monociti mediante lo scatter laterale. I linfociti e i monociti vengono poi suddivisi in tre gruppi distinti utilizzando CD14 e lo scatter laterale.Questi includono linfociti CD14 negativi, tutte le cellule CD14 negative e i non linfociti; le cellule del gate dei linfociti CD14 negativi vengono innanzitutto suddivise in tre gruppi: CD3 positivo CD19 negativo, CD3 negativo CD19 positivo e CD3 negativo CD19 negativo. I linfociti T vengono selezionati dal gate CD3 positivo CD19 negativo. Dopo l'esclusione delle cellule CD56 positive e CD16 positive, si possono distinguere i linfociti T CD4 positivi e CD8 positivi. Le cellule B vengono selezionate dal gate CD3 negativo CD19 positivo, dopo l'esclusione delle cellule CD56 positive e CD16 positive, mentre le cellule NK vengono selezionate dal gate CD3 negativo CD19 negativo.Dopo aver escluso le possibili contaminazioni da monociti utilizzando CD11c e CD4, le cellule NK vengono suddivise in popolazioni CD56 brite, CD56 dim e CD56 negative. Per distinguere la popolazione di cellule dendritiche, tutte le cellule CD14 negative vengono selezionate escludendo le cellule positive per CD3, positive per CD19, positive per CD56 e positive per CD16. A partire da qui, le cellule positive per HLA-DR vengono selezionate e le cellule dendritiche mieloidi e le cellule dendritiche plasmacitoidi possono essere distinte in base all'espressione di CD11c e CD123.Infine, a partire dal tracciato dei non linfociti, i sottoinsiemi di monociti vengono selezionati escludendo possibili cellule contaminanti positive per CD 56, positive per CD 3 e positive per CD 19. I monociti non classici, intermedi e classici vengono distinti in base all'espressione di CD 16 e CD 14. Una volta selezionate le popolazioni di interesse, è possibile calcolarne le concentrazioni.Confrontando il numero di eventi nella finestra delle particelle con il numero totale di particelle inizialmente presenti nel tubo, sarà possibile determinare il rapporto del campione raccolto, che può quindi essere utilizzato per calcolare la concentrazione assoluta. Il numero di cellule per microlitro per ciascuna popolazione. L'equazione mostrata qui può essere utilizzata per questo scopo.In questo video, abbiamo illustrato la procedura utilizzata dai tecnici di laboratorio per l'elaborazione del sangue per eseguire la colorazione su sangue intero fresco e i passaggi necessari per analizzare questi campioni colorati in un laboratorio centrale per saggi. Nel contesto di una sperimentazione clinica multicentrica, abbiamo dimostrato che il saggio è semplice e di durata relativamente breve, rendendolo fattibile per i tecnici di laboratorio per l'elaborazione del sangue, che possono così congelare e trasferire i campioni al laboratorio di saggio essenziale per l'analisi. La chiave per ottenere risultati accurati e coerenti consiste nello standardizzare attentamente i passaggi critici del protocollo e nell'utilizzare un sistema di documentazione che registri tutti i passaggi, in modo che eventuali anomalie riscontrate possano essere ricondotte alla fonte del problema.I dati generati da questo pannello di colorazione possono essere utilizzati per monitorare le variazioni delle concentrazioni di leucociti nel tempo e potrebbero essere facilmente sviluppati ulteriormente per valutare gli stati di attivazione di specifici tipi cellulari di interesse.

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Enumerazione delle popolazioni dei leucociti del sangue periferico per le principali studi clinici multicentrici utilizzando un intero saggio Fenotipizzazione Sangue (Video) | JoVE Journal

Enumerazione delle popolazioni dei leucociti del sangue periferico per le principali studi clinici multicentrici utilizzando un intero saggio Fenotipizzazione Sangue

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