Sintesi di fase-shift nanoemulsioni con distribuzioni di dimensioni strette per vaporizzazione Droplet acustico e Bubble-enhanced Ultrasound-mediata Ablazione

L'obiettivo generale del seguente esperimento è osservare l'effetto delle bolle generate dalla vaporizzazione acustica di nanoemulsioni rivestite di lipidi sull'ablazione mediata da ultrasuoni. Questo risultato si ottiene innanzitutto disperdendo nanoemulsioni rivestite di lipidi in idrogeli di poliacrilamide caricati con albumina. In un secondo passaggio, un trasduttore focalizzato trasmette impulsi brevi ad alta ampiezza nell'idrogel, provocando la vaporizzazione locale delle nanoemulsioni nel punto focale; successivamente, le bolle risultanti vengono continuamente eccitate mediante ultrasuoni, e l'energia acustica irradiata dalle bolle viene rapidamente assorbita dall'idrogel, accelerando così il tasso di riscaldamento mediato da ultrasuoni.

I risultati mostrano che la presenza di bolle riduce in modo significativo il tempo e l'energia necessari per riscaldare l'idrogel oltre la temperatura soglia per la denaturazione delle proteine, determinando un'ablazione mediata da ultrasuoni più rapida ed efficiente. La dimensione della nanoemulsione a cambiamento di fase è un fattore determinante cruciale per la soglia di pressione. Per la vaporizzazione acustica, abbiamo sviluppato un protocollo per produrre nanoemulsioni stabili a cambiamento di fase con distribuzioni dimensionali ristrette e soglie di vaporizzazione ben definite, nonché un sistema in vitro per valutare l'impatto sull'ablazione mediata da ultrasuoni.

Sebbene venga descritto un sistema in vitro, le nanoemulsioni sono progettate per raggiungere i tessuti extravascolari e i tumori solidi con particelle che possono essere vaporizzate acusticamente. Le bolle formate possono quindi essere utilizzate per applicazioni diagnostiche o terapeutiche nella gestione del cancro. Per iniziare la procedura di preparazione di una nanoemulsione con cambio di fase, o PSNE, mescolare innanzitutto i lipidi sciogliendo 11 milligrammi di DPPC e 1,7 milligrammi di DSPE.

Peg 2000 in cloroformio in un pallone a fondo rotondo di vetro. Posizionare il pallone a fondo rotondo in un bagno d'acqua a 50 gradi Celsius all'interno della cappa chimica e utilizzare un flusso di gas argonico per evaporare il solvente organico. Per formare un film lipidico secco, collocare il pallone in un essiccatore e lasciarlo sotto vuoto per tutta la notte, in modo da disidratare il film lipidico entro la mattina seguente.

Ridratare il film lipidico con 5,5 millilitri di PBS. Riscaldare la soluzione in un bagno d'acqua a 45 gradi Celsius fino a quando il film lipidico si dissolve per la preparazione. Trasferire periodicamente la soluzione lipidica in un vial da sette millilitri e quindi sottoporla a sonicazione con un sonicator a sonda per due minuti a un'ampiezza del 20%.

Dividere la soluzione in due provette da 2,5 millilitri ciascuna. I rimanenti 0,5 millilitri vengono scartati. Aggiungere 2,5 millilitri di PBS in ciascuna provetta, quindi posizionare entrambe le provette in un bagno di acqua ghiacciata a zero gradi Celsius.

Aggiungere 50 microlitri di doca fluoro pentano, o DDFP, a ciascun campione. Figlio della miscela lipidica DDFP. In un bagno di ghiaccio e acqua è la parte più critica di questa procedura.

Il bagno di acqua e ghiaccio viene utilizzato per prevenire l'evaporazione del liquido per fluorocarbonato. Durante questo processo, sottoporre ogni provetta al trattamento con sonica nel bagno di acqua e ghiaccio utilizzando le seguenti impostazioni: ampiezza al 25%, modalità pulsata e durata totale di 60 secondi. Dopo la sonicazione, trasferire la soluzione PSNE in provette per scintillazione da 20 millilitri aggiungendo cinque millilitri di PBS a ciascuna provetta, ottenendo un volume finale di 10 millilitri per provetta.

Assemblare l'estrusore seguendo le istruzioni del produttore per preparare l'estrusore. Pipettare 10 millilitri di acqua deionizzata nel portacampioni superiore. Chiudere l'apertura e serrare la valvola di sfiato.

Aprire lentamente la linea del gas azoto per aumentare la pressione, spingendo il campione attraverso le membrane. Raccogliere il campione dal tubo di uscita ed estrudere il PSNE per 16 volte attraverso un filtro da 100 nanometri o 200 nanometri per ottenere una distribuzione dimensionale ristretta. Iniziare questa procedura preparando un idrogel di poli acrilamide contenente PSNE.

Per prima cosa, preparare una soluzione al 24% di albumina sierica bovina o BSA sciogliendo 2,4 grammi di polvere di BSA in 10 millilitri di acqua deionizzata. Successivamente, preparare una soluzione al 10% di persolfato di ammonio o aPS diluendo un grammo di polvere di aPS in 10 millilitri di acqua deionizzata. Mescolare questi reagenti in uno stampo di plastica nell'ordine seguente: 2,1 millilitri di soluzione di acrilamide, 1,2 millilitri di buffer tris, 0,1 millilitri di aPS al 10%, 4,5 millilitri di soluzione di BSA al 24% e 3,6 millilitri di acqua deionizzata. Riscaldare la soluzione a 40 gradi Celsius in un bagno termico e quindi sottoporla a vuoto per un'ora per disaerare il liquido.

Questo è necessario per evitare la formazione indesiderata di bolle all'interno dell'idrogel dopo un'ora. Rimuovere dal vuoto, aggiungere 480 microlitri di sospensione di PSNE e mescolare accuratamente ruotando delicatamente la camera di plastica. In una cappa chimica, aggiungere 12 microlitri di tetraetilene diammina o T-E-M-E-D per polimerizzare l'acrilammide e collocare la camera in un bagno d'acqua a 12 °C per due ore.

La polimerizzazione è esotermica, quindi è necessaria una vasca fredda per evitare la vaporizzazione del PSE durante la polimerizzazione. Una volta che l'acrilamide si è polimerizzata, posizionare un trasduttore a potenza focalizzata e una sonda di imaging in un serbatoio in acrilico riempito con acqua deionizzata DGAs in modo che il piano di imaging coincida con il volume focale del trasduttore. Successivamente, posizionare l'idrogel di poli acrilamide caricato con PSNE al fuoco del trasduttore a potenza e vaporizzare il PSNE all'interno dell'idrogel mediante impulsi acustici brevi, seguiti da un'esposizione continua di 15 secondi per l'ablazione potenziata da bolle.

Quando la BSA viene denaturata, l'idrogel diventa opaco a causa dell'assorbimento degli ultrasuoni e della generazione di calore all'interno della vaporizzazione monitorata e della formazione di bolle mediante un apparato ecografico diagnostico. In questa immagine esemplificativa, la freccia indica la regione focale in cui una nuvola di bolle è stata generata dalla vaporizzazione dei PSNE. Ripetere l'esposizione acustica in una nuova posizione all'interno dell'idrogel senza sollevare i PSNE e confrontare il tempo e il volume di ablazione.

Questo protocollo produce goccioline di perfluorocarburo rivestite da lipidi con una distribuzione dimensionale ristretta. La distribuzione dimensionale misurata mediante scattering dinamico della luce è mostrata qui per PSNE estrusi utilizzando filtri da 100 e 200 nanometri. Le unità degli assi delle ordinate sono basate sull'intensità della luce dispersa da particelle di una certa dimensione rispetto all'intensità totale della luce dispersa dal campione.

Quando si misurano il diametro medio e la deviazione standard delle PSNE a uno e sette giorni dall'estrusione con filtri di 100 e 200 nanometri mediante scattering dinamico della luce, i risultati dimostrano che le PSNE sono stabili per almeno una settimana. Questa figura mostra immagini in modalità B delle PSNE prima e dopo la vaporizzazione. In un idrogel di poli acrilamide, la freccia indica la regione focale in cui una nuvola di bolle è stata formata dalla vaporizzazione delle PSNE.

Queste sono immagini di un idrogel di poliacrilammide contenente albumina e PSNE prima e dopo la vaporizzazione e la sonificazione con ultrasuoni focalizzati ad alta intensità o Hy Fu. Una lesione viene formata da 15 secondi di riscaldamento mediato da Hy Fu. La forma asimmetrica della lesione è il risultato di un riscaldamento pre-focale che si verifica a causa della presenza di una nube di bolle nel percorso degli ultrasuoni. Il riscaldamento pre-focale e la formazione della lesione dovuti alla dispersione provocata dalle bolle possono essere ridotti diminuendo la potenza acustica trasmessa dopo il suo sviluppo.

Questo metodo per la produzione di nanoemulsioni stabili con cambio di fase aprirà la strada ai ricercatori nel campo della terapia mediata da ultrasuoni per esplorare l'ablazione HIFU potenziata da bolle nei tumori solidi. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come produrre nanoemulsioni stabili con cambio di fase e distribuzioni dimensionali ristrette, nonché di come studiare la nucleazione delle bolle e l'ablazione mediata da ultrasuoni potenziata.