Name: Sintesi di fase-shift nanoemulsioni con distribuzioni di dimensioni strette per vaporizzazione Droplet acustico e Bubble-enhanced Ultrasound-mediata Ablazione (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-09-13T12:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 28 s
Description: Scopri la sintesi di nanoemulsioni a cambio di fase con distribuzione di dimensioni stretta per ablazione mediata da ultrasuoni. Questo metodo migliora l'efficienza termica nei tumori solidi attraverso la vaporizzazione acustica controllata.

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Questo lavoro è stato supportato da una BU / CIMIT Fellowship Applicata Sanità Ingegneria Predoctoral, una National Science Foundation ampliare la partecipazione di Ricerca in Ingegneria Iniziazione di Grant (Brige), e il National Institutes of Health (R21EB0094930).

1. Preparazione della fase-shift nanoemulsione (PSNE) <ol><li> Sciogliere 11 mg e 1,68 mg DPPC DSPE-PEG2000 in cloroformio </li><li> Si evapora il solvente organico per formare un film secco lipide in un pallone di vetro a fondo rotondo </li><li> Dessicate il film lipidico durante la notte </li><li> Reidratare il film lipidico con 5,5 ml di tampone fosfato salino (PBS) </li><li> Soluzione di calore in un bagno di acqua a 45 ° C fino a quando si scioglie film lipidico, vortex periodicamente </li><li> Trasferire la soluzione lipidica in 7 ml Fiala </li><li> Sonicare soluzione lipidica per 2 min a 20% dell&#39;ampiezza </li><li> Dividere la soluzione in due flaconcini da 2,5 ml (scartare restante 0,5 ml) </li><li> Aggiungere 2,5 ml di soluzione salina in ogni fiala </li><li> Posizionare ciascun flacone con un 0 ° C bagno di acqua ghiacciata </li><li> Aggiungere 50 microlitri DDFP ad ogni flacone </li><li> Sonicare ogni flacone nel bagno di acqua ghiacciata utilizzando le seguenti impostazioni: 25% di ampiezza, modalità pulsata (10 sec a 50 sec spento), 60 secondi sul tempo totale </li><li> Transfer soluzioni PSNE a 20 fiale da scintillazione ml </li><li> Aggiungere 5 ml di soluzione salina in ogni fiala, con conseguente in 10 ml di volume finale </li><li> Montare indicazioni seguenti estrusione forniti dal produttore <ol><li> Lavare ogni parte con acqua deionizzata </li><li> Posizionare il disco di supporto in acciaio inox al centro della base di supporto filtro </li><li> Posizionare la maglia di acciaio inossidabile sulla parte superiore del disco di sostegno dell&#39;acciaio inossidabile </li><li> Con una pinzetta, posizionare una membrana di scarico estrusore disco (su lato lucido) sulla rete di acciaio inossidabile </li><li> Con una pinzetta, posizionare il filtro estrusore (il lato lucido) sulla membrana disco di scarico </li><li> Posizionare con cura il piccolo O-ring sul filtro e posizionare il thermobarrel e top estrusore al di sopra della base d&#39;appoggio </li><li> Serrare parzialmente ogni ala-primo dado, quindi serrare a fondo le ali-dadi a mano, in modo alterno </li><li> Collegare l&#39;estrusore auna linea di gas azoto </li><li> Per caricare il, estrusore pipetta da 10 ml di acqua deionizzata alla porta di esempio, chiudere l&#39;apertura, e serrare la valvola di sfiato </li><li> Aprire lentamente la linea di gas azoto per aumentare la pressione, costringendo il campione attraverso le membrane, e raccogliere il campione dal tubo di uscita </li><li> Dopo l&#39;uso, smontaggio in ordine inverso, sciacquare le parti dell&#39;estrusore con acqua deionizzata, e gettare il filtro a membrana e scarico disco membrana </li></ol></li><li> Per 100 nm goccioline solo, pre-condizione PSNE per estrusione di 10 volte con filtro a 200 nm </li><li> Estrusione PSNE 16 volte in 100 nm o 200 nm di filtro per ottenere una distribuzione ristretta dimensione </li></ol> 2. Preparazione di Hydrogel poliacrilammide contenente PSNE <ol><li> Preparare una soluzione al 24% di BSA diluendo 1,2 g BSA polvere in 5 ml di acqua deionizzata </li><li> Preparare la soluzione APS 10% diluito 0,1 g di polvere in 1 ml APS deionizzata water </li><li> Nel seguente ordine, miscelare 2,1 ml di soluzione di acrilammide, 1,2 ml di tampone Tris, 0,1 ml APS 10%, 4,5 ml di soluzione al 24% di BSA e 3,6 ml di acqua deionizzata in camera di plastica </li><li> Riscaldare a 40 ° C e posto sotto vuoto per 1 ora </li><li> Aggiungere 480 ml di PSNE e mescolare bene agitando con delicatezza la camera di plastica. </li><li> Aggiungere 12 microlitri TEMED e posizionare la camera in un bagno di acqua 12 ° C per 2 ore </li></ol> 3. Risultati rappresentativi Un schematico della configurazione per esperimenti ultrasuoni con tessuti che imitano fantasmi idrogel è mostrato in Figura 1. Questo protocollo risulta in lipidi rivestite goccioline perfluorocarburiche con una distribuzione di dimensione ristretta che sono stabili in soluzione per almeno una settimana. La distribuzione della dimensione misurata con light scattering dinamico (Particle Analyzer 90Plus Size, Brookhaven Instruments, Holtsville, NY) è mostrato in Figura 2 per PSNE estrusi con 100 e 200nm filtri. Il diametro PSNE efficace nel tempo, misurato utilizzando dispersione dinamica della luce, è riportata nella Tabella 1, dimostrando che PSNE sono stabili per almeno una settimana. B-mode immagini di PSNE prima e dopo vaporizzazione in un idrogel di poliacrilamide sono mostrati in Figura 3. Inoltre, una lesione formata da 15 sec di HIFU-mediata riscaldamento in un idrogel di poliacrilamide contenente albumina e PSNE è mostrato in Figura 4. La forma asimmetrica della lesione è il risultato del riscaldamento prefocal che si verifica a causa della presenza della nube bolla nel percorso ultrasuoni. È importante notare che il riscaldamento prefocal e formazione di lesione a causa dispersione da bolle può essere minimizzata riducendo la potenza acustica trasmessa. <img src="/files/ftp_upload/4308/4308fig1.jpg" alt="Figura 1"/> Figura 1. Schema del setup sperimentale per ultrasuoni esperimenti con tessuto-mimIcking idrogel. <img src="/files/ftp_upload/4308/4308fig2.jpg" alt="Figura 2"/> Figura 2. Dimensione distribuzione di PSNE estruso attraverso 100 nm o 200 nm filtri, misurata con Dynamic Light Scattering. Le unità degli assi delle ordinate sono basati sull&#39;intensità della luce diffusa dalle particelle di una certa dimensione relativa alla intensità totale della luce diffusa dal campione. <img src="/files/ftp_upload/4308/4308fig3.jpg" alt="Figura 3"/> Figura 3. Immagini B-mode (a) prima e (b) dopo la vaporizzazione PSNE in un idrogel di poliacrilamide. La freccia indica la regione focale dove è formata una nube bolla per vaporizzazione PSNE. <img src="/files/ftp_upload/4308/4308fig4.jpg" alt="Figura 4"/> Immagini Figura 4. Del polyacrylamide idrogel contenente albumina e PSNE (a) prima e (b) dopo la vaporizzazione e la sonicazione con HIFU, dimostrando formazione di lesione a seguito di ultrasuoni indotta riscaldamento. La frequenza centrale degli ultrasuoni è stata del 3,3 MHz. Il segnale ad ultrasuoni consisteva in un ciclo iniziale di 30, 6,4 W impulsi per vaporizzare PSNE, immediatamente seguito da 15 secondi di ultrasuoni continuo a 0,77 W. <table border="1"><tbody><tr><td rowspan="2"> Giorni dopo estrusione </td><td colspan="2"> Estruso con filtro a 200 nm </td><td colspan="2"> Estruso con filtro 100 nm </td></tr><tr><td> Media Dia. (Nm) </td><td> Std. Dev. (Nm) </td><td> Media Dia. (Nm) </td><td> Std. Dev. (Nm) </td></tr><tr><td> 1 </td><td> 182,9 </td><td> 4,9 </td><td> 118,0 </td><td> 0,9 </td></tr><tr><td> 7 </td> &lt;td&gt; 177,7 </td><td> 2,5 </td><td> 124,8 </td><td> 3,1 </td></tr></tbody></table> Tabella 1. Diametro medio e la deviazione standard di PSNE a uno e sette giorni dopo l&#39;estrusione con 100 nm e 200 nm filtri.

<ol><li>Hynynen, K., Darkazanli, A., Unger, E., Schenck, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MRI-guided+noninvasive+ultrasound+surgery%5BTitle%5D)+AND+%22Med.+Phys%22%5BJournal%5D)">MRI-guided noninvasive ultrasound surgery.</a> Med. Phys. 20, 107-115 (1993).</li>
<li>Baban, D. F., Seymour, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+tumour+vascular+permeability%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Drug+Deliv.+Rev%22%5BJournal%5D)">Control of tumour vascular permeability.</a> Adv. Drug Deliv. Rev. 34, 109-119 (1998).</li>
<li>Maeda, H., Wu, J., Sawa, T., Matsumura, Y., Hori, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+vascular+permeability+and+the+EPR+effect+in+macromolecular+therapeutics%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Control.+Release%22%5BJournal%5D)">Tumor vascular permeability and the EPR effect in macromolecular therapeutics: a review.</a> J. Control. Release. 65, 271-284 (2000).</li>
<li>Schadlich, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+accumulation+of+NIR+fluorescent+PEG-PLA+nanoparticles%3A+impact+of+particle+size+and+human+xenograft+tumor+model%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Tumor accumulation of NIR fluorescent PEG-PLA nanoparticles: impact of particle size and human xenograft tumor model.</a> ACS Nano. 5, 8710-8720 (2011).</li>
<li>Williams, R. Convertible perfluorocarbon droplets for cancer detection and therapy. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWilliams%2C+R+%222010+IEEE+Ultrasonics+Symposium%22">2010 IEEE Ultrasonics Symposium</a>. , (2010).</li>
<li>Martz, T. D., Sheeran, P. S., Bardin, D., Lee, A. P., Dayton, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Precision+manufacture+of+phase-change+perfluorocarbon+droplets+using+microfluidics%5BTitle%5D)+AND+%22Ultrasound+Med.+Biol%22%5BJournal%5D)">Precision manufacture of phase-change perfluorocarbon droplets using microfluidics.</a> Ultrasound Med. Biol. 37, 1952-1957 (2011).</li>
<li>Giesecke, T., Hynynen, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrasound-mediated+cavitation+thresholds+of+liquid+perfluorocarbon+droplets+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Ultrasound+Med.+Biol%22%5BJournal%5D)">Ultrasound-mediated cavitation thresholds of liquid perfluorocarbon droplets in vitro.</a> Ultrasound Med. Biol. 29, 1359-1365 (2003).</li>
<li>Sheeran, P. S., Luois, S., Dayton, P. A., Matsunaga, T. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formulation+and+Acoustic+Studies+of+a+New+Phase-Shift+Agent+for+Diagnostic+and+Therapeutic+Ultrasound%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Formulation and Acoustic Studies of a New Phase-Shift Agent for Diagnostic and Therapeutic Ultrasound.</a> Langmuir. 27, 10412-10420 (2011).</li>
<li>Sheeran, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decafluorobutane+as+a+phase-change+contrast+agent+for+low-energy+extravascular+ultrasonic+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Ultrasound+Med.+Biol%22%5BJournal%5D)">Decafluorobutane as a phase-change contrast agent for low-energy extravascular ultrasonic imaging.</a> Ultrasound Med. Biol. 37, 1518-1530 (2011).</li>
<li>Zhang, P. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22The+Application+of+Phase-Shift+Nanoemulsion+in+High+Intensity+Focused+Ultrasound%3A+An+In+Vitro+Study+%5BDoctoral+%5D%22">The Application of Phase-Shift Nanoemulsion in High Intensity Focused Ultrasound: An In Vitro Study [Doctoral Dissertation]</a>. , (2011).</li>
<li>Allen, T. M., Hansen, C., Martin, F., Redemann, C., Yau-Young, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liposomes+containing+synthetic+lipid+derivatives+of+poly%28ethylene+glycol%29+show+prolonged+circulation+half-lives+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta%22%5BJournal%5D)">Liposomes containing synthetic lipid derivatives of poly(ethylene glycol) show prolonged circulation half-lives in vivo.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1066, 29-36 (1991).</li>
<li>Klibanov, A. L., Maruyama, K., Beckerleg, A. M., Torchilin, V. P., Huang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activity+of+amphipathic+poly%28ethylene+glycol%29+5000+to+prolong+the+circulation+time+of+liposomes+depends+on+the+liposome+size+and+is+unfavorable+for+immunoliposome+binding+to+target%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta%22%5BJournal%5D)">Activity of amphipathic poly(ethylene glycol) 5000 to prolong the circulation time of liposomes depends on the liposome size and is unfavorable for immunoliposome binding to target.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1062, 142-148 (1991).</li>
<li>Klibanov, A. L., Maryama, K., Torchilin, V. P., Huang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amphipathic+polyethyleneglycols+effectively+prolong+the+circulation+time+of+liposomes%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Amphipathic polyethyleneglycols effectively prolong the circulation time of liposomes.</a> FEBS Lett. 268, 235-237 (1990).</li>
<li>Gabizon, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prolonged+circulation+time+and+enhanced+accumulation+in+malignant+exudates+of+Doxorubicin+encapsulated+in+polyethylene-glycol+coated+liposomes%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Prolonged circulation time and enhanced accumulation in malignant exudates of Doxorubicin encapsulated in polyethylene-glycol coated liposomes.</a> Cancer Res. 54, 987-992 (1994).</li>
<li>Awasthi, V. D., Garcia, D., Goins, B. A., Philips, W. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulation+and+biodistribution+profiles+of+long-circulating+PEG-liposomes+of+various+sizes+in+rabbits%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Pharm%22%5BJournal%5D)">Circulation and biodistribution profiles of long-circulating PEG-liposomes of various sizes in rabbits.</a> Int. J. Pharm. 253, 121-132 (2003).</li>
<li>Zhang, P., Porter, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+in+vitro+study+of+a+phase-shift+nanoemulsion%3A+a+potential+nucleation+agent+for+bubble-enhanced+HIFU+tumor+ablation%5BTitle%5D)+AND+%22Ultrasound+Med.+Biol%22%5BJournal%5D)">An in vitro study of a phase-shift nanoemulsion: a potential nucleation agent for bubble-enhanced HIFU tumor ablation.</a> Ultrasound Med. Biol. 36, 1856-1866 (2010).</li>
<li>Lafon, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gel+phantom+for+use+in+high-intensity+focused+ultrasound+dosimetry%5BTitle%5D)+AND+%22Ultrasound+Med.+Biol%22%5BJournal%5D)">Gel phantom for use in high-intensity focused ultrasound dosimetry.</a> Ultrasound Med. Biol. 31, 1383-1389 (2005).</li>
</ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Ultrasuoni focalizzati ad alta intensità (HIFU) è usato clinicamente per l&#39;ablazione termica tumori. 1 Per migliorare riscaldamento localizzato e migliorare ablazione termica nei tumori, lipidi rivestite goccioline perfluorocarburiche sono stati sviluppati che possono essere vaporizzato da HIFU. La vascolarizzazione in molti tumori è anormalmente perde a causa della loro rapida crescita. 2 Così, nanoparticelle sono in grado di penetrare le fenestrazioni e passivamente accumulano all&#39;interno...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome comune </td><td> Fabbricante </td><td> Cat. Numero </td><td> Nome e Cognome / Descrizione </td></tr><tr><td> DPPC </td><td> Lipidi Avanti, Alabaster, AL, Stati Uniti d&#39;America </td><td> 850355P </td><td> 1,2-dipalmitoil-sn-glycero-3-phosphocholine </td></tr><tr><td> DSPE-PEG2000 </td><td> Lipidi Avanti, Alabaster, AL, Stati Uniti d&#39;America </td><td> 880120P </td><td> 1,2-distearoil-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[metossi (polietilene glicole) -2000] (sale di ammonio) </td></tr><tr><td> DDFP </td><td> Fluoromed, Round Rock, TX, Stati Uniti d&#39;America </td><td> CAS: 138495-42-8 </td><td> Dodecafluoropentano (C 5 F 12) </td></tr><tr><td> PBS </td><td> Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, Stati Uniti d&#39;America </td><td> P2194 </td><td> PBS </td></tr><tr><td> Cloroformio </td><td> Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, Stati Uniti d&#39;America </td><td> 372978 </td><td> Cloroformio </td></tr><tr><td> Acrilamide </td><td> Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, Stati Uniti d&#39;America </td><td> A9926 </td><td> 40% 19:01 acrilammide / bis-acrilamide </td></tr><tr><td> Tampone Tris </td><td> Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, Stati Uniti d&#39;America </td><td> T2694 </td><td> 1M, pH 8, cloridrato trizma e trizma di base </td></tr><tr><td> BSA </td><td> Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, Stati Uniti d&#39;America </td><td> A3059 </td><td> Albumina di siero bovino </td></tr><tr><td> APS </td><td> Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, Stati Uniti d&#39;America </td><td> A3678 </td><td> Ammonio persolfato soluzione </td></tr><tr><td> TEMED </td><td> Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, Stati Uniti d&#39;America </td><td> 87689 </td><td> N, N, N &#39;, N&#39;-tetrametiletilendiammina </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Attrezzatura </td></tr><tr><td> Sonicator (3 punta mm) </td&gt; <td> Sonics &amp; Materials, Inc., Newtown, CT, Stati Uniti d&#39;America </td><td> Vibra-Cell </td><td></td></tr><tr><td> Bagnomaria </td><td> Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, Stati Uniti d&#39;America </td><td> Neslab EX-7 </td><td></td></tr><tr><td> Estrusore </td><td> Lipidi del Nord, Burnaby, BC, Canada </td><td> Lipex </td><td></td></tr><tr><td> Estrusori Filtri </td><td> Whatman, Piscataway, NJ, USA </td><td> Nuclepore # 110605 e # 110606 </td><td></td></tr><tr><td> Estrusore di scarico del disco </td><td> Sterlitech Corporation, Kent, WA, Stati Uniti d&#39;America </td><td> # PETEDD25100 </td><td></td></tr><tr><td> Camera di plastica </td><td> US Plastic Corporation, Lima, OH, Stati Uniti d&#39;America </td><td> # 55288, 1 3/16 &quot;x 1 3/16&quot; x 2 7/16 &quot; </td><td></td></tr></tbody></table>

sintesi di fase-shift nanoemulsioni con distribuzioni di dimensioni strette per vaporizzazione droplet acustico e bubble-enhanced ultrasound-mediata ablazione

Synthesis of Phase-shift Nanoemulsions with Narrow Size Distributions for Acoustic Droplet Vaporization and Bubble-enhanced Ultrasound-mediated Ablation

Ultrasuoni focalizzati ad alta intensità (HIFU) è usato in clinica per l&#39;ablazione termica dei tumori. Per migliorare riscaldamento localizzato e migliorare ablazione termica nei tumori, lipidi rivestite goccioline perfluorocarburiche sono stati sviluppati che possono essere vaporizzato da HIFU. La vascolarizzazione in molti tumori è anormalmente perde a causa della loro rapida crescita, e nanoparticelle sono in grado di penetrare le fenestrazioni e passivamente accumulano all&#39;interno del tumore. Pertanto, controllando la dimensione delle goccioline può migliorare accumulo all&#39;interno del tumore. In questa relazione, la preparazione di gocce stabili in un sfasamento nanoemulsione (PSNE) con una distribuzione granulometrica ristretta viene descritto. PSNE stati sintetizzati da sonicating una soluzione lipidica in presenza di perfluorocarburo liquido. Una distribuzione dimensionale ristretta è stato ottenuto estrudendo i tempi PSNE multipli utilizzando filtri con pori di 100 o 200 nm. La distribuzione delle dimensioni è stata misurata in un periodo di 7 giorni con Dynamic Light Scattering. Polyacidrogel rylamide contenenti PSNE sono stati preparati per esperimenti in vitro. Goccioline PSNE nei idrogel sono stati vaporizzati con gli ultrasuoni e le bolle risultano migliorate riscaldamento localizzato. Vaporizzato PSNE permette un riscaldamento più rapido e riduce anche l&#39;intensità ultrasuoni necessari per l&#39;ablazione termica. Così, PSNE dovrebbe migliorare ablazione termica nei tumori, migliorando potenzialmente risultati terapeutici di HIFU-mediate trattamenti di ablazione termica.

Phase-shift nanoemulsioni (PSNE) può essere vaporizzato con ultrasuoni focalizzati ad alta intensità per migliorare il riscaldamento localizzato e migliorare la termoablazione nei tumori. In questa relazione, la preparazione di PSNE stabile con una distribuzione di dimensione stretta è descritto. Inoltre, l&#39;impatto di PSNE vaporizzato su ultrasuoni-mediata ablazione è in tessuti che imitano fantasmi.

Sintesi di fase-shift nanoemulsioni con distribuzioni di dimensioni strette per vaporizzazione Droplet acustico e Bubble-enhanced Ultrasound-mediata Ablazione

L'ultrasuono focalizzato ad alta intensità (HIFU) viene utilizzato in ambito clinico per l'ablazione termica di tumori. Per potenziare il riscaldamento localizzato e migliorare l'ablazione termica in...

L'obiettivo generale del seguente esperimento è osservare l'effetto delle bolle generate dalla vaporizzazione acustica di nanoemulsioni rivestite di lipidi sull'ablazione mediata da ultrasuoni. Questo risultato si ottiene innanzitutto disperdendo nanoemulsioni rivestite di lipidi in idrogeli di poliacrilamide caricati con albumina. In un secondo passaggio, un trasduttore focalizzato trasmette impulsi brevi ad alta ampiezza nell'idrogel, provocando la vaporizzazione locale delle nanoemulsioni nel punto focale; successivamente, le bolle risultanti vengono continuamente eccitate mediante ultrasuoni, e l'energia acustica irradiata dalle bolle viene rapidamente assorbita dall'idrogel, accelerando così il tasso di riscaldamento mediato da ultrasuoni.I risultati mostrano che la presenza di bolle riduce in modo significativo il tempo e l'energia necessari per riscaldare l'idrogel oltre la temperatura soglia per la denaturazione delle proteine, determinando un'ablazione mediata da ultrasuoni più rapida ed efficiente. La dimensione della nanoemulsione a cambiamento di fase è un fattore determinante cruciale per la soglia di pressione. Per la vaporizzazione acustica, abbiamo sviluppato un protocollo per produrre nanoemulsioni stabili a cambiamento di fase con distribuzioni dimensionali ristrette e soglie di vaporizzazione ben definite, nonché un sistema in vitro per valutare l'impatto sull'ablazione mediata da ultrasuoni.Sebbene venga descritto un sistema in vitro, le nanoemulsioni sono progettate per raggiungere i tessuti extravascolari e i tumori solidi con particelle che possono essere vaporizzate acusticamente. Le bolle formate possono quindi essere utilizzate per applicazioni diagnostiche o terapeutiche nella gestione del cancro. Per iniziare la procedura di preparazione di una nanoemulsione con cambio di fase, o PSNE, mescolare innanzitutto i lipidi sciogliendo 11 milligrammi di DPPC e 1,7 milligrammi di DSPE.Peg 2000 in cloroformio in un pallone a fondo rotondo di vetro. Posizionare il pallone a fondo rotondo in un bagno d'acqua a 50 gradi Celsius all'interno della cappa chimica e utilizzare un flusso di gas argonico per evaporare il solvente organico. Per formare un film lipidico secco, collocare il pallone in un essiccatore e lasciarlo sotto vuoto per tutta la notte, in modo da disidratare il film lipidico entro la mattina seguente.Ridratare il film lipidico con 5,5 millilitri di PBS. Riscaldare la soluzione in un bagno d'acqua a 45 gradi Celsius fino a quando il film lipidico si dissolve per la preparazione. Trasferire periodicamente la soluzione lipidica in un vial da sette millilitri e quindi sottoporla a sonicazione con un sonicator a sonda per due minuti a un'ampiezza del 20%.Dividere la soluzione in due provette da 2,5 millilitri ciascuna. I rimanenti 0,5 millilitri vengono scartati. Aggiungere 2,5 millilitri di PBS in ciascuna provetta, quindi posizionare entrambe le provette in un bagno di acqua ghiacciata a zero gradi Celsius.Aggiungere 50 microlitri di doca fluoro pentano, o DDFP, a ciascun campione. Figlio della miscela lipidica DDFP. In un bagno di ghiaccio e acqua è la parte più critica di questa procedura.Il bagno di acqua e ghiaccio viene utilizzato per prevenire l'evaporazione del liquido per fluorocarbonato. Durante questo processo, sottoporre ogni provetta al trattamento con sonica nel bagno di acqua e ghiaccio utilizzando le seguenti impostazioni: ampiezza al 25%, modalità pulsata e durata totale di 60 secondi. Dopo la sonicazione, trasferire la soluzione PSNE in provette per scintillazione da 20 millilitri aggiungendo cinque millilitri di PBS a ciascuna provetta, ottenendo un volume finale di 10 millilitri per provetta.Assemblare l'estrusore seguendo le istruzioni del produttore per preparare l'estrusore. Pipettare 10 millilitri di acqua deionizzata nel portacampioni superiore. Chiudere l'apertura e serrare la valvola di sfiato.Aprire lentamente la linea del gas azoto per aumentare la pressione, spingendo il campione attraverso le membrane. Raccogliere il campione dal tubo di uscita ed estrudere il PSNE per 16 volte attraverso un filtro da 100 nanometri o 200 nanometri per ottenere una distribuzione dimensionale ristretta. Iniziare questa procedura preparando un idrogel di poli acrilamide contenente PSNE.Per prima cosa, preparare una soluzione al 24% di albumina sierica bovina o BSA sciogliendo 2,4 grammi di polvere di BSA in 10 millilitri di acqua deionizzata. Successivamente, preparare una soluzione al 10% di persolfato di ammonio o aPS diluendo un grammo di polvere di aPS in 10 millilitri di acqua deionizzata. Mescolare questi reagenti in uno stampo di plastica nell'ordine seguente: 2,1 millilitri di soluzione di acrilamide, 1,2 millilitri di buffer tris, 0,1 millilitri di aPS al 10%, 4,5 millilitri di soluzione di BSA al 24% e 3,6 millilitri di acqua deionizzata. Riscaldare la soluzione a 40 gradi Celsius in un bagno termico e quindi sottoporla a vuoto per un'ora per disaerare il liquido.Questo è necessario per evitare la formazione indesiderata di bolle all'interno dell'idrogel dopo un'ora. Rimuovere dal vuoto, aggiungere 480 microlitri di sospensione di PSNE e mescolare accuratamente ruotando delicatamente la camera di plastica. In una cappa chimica, aggiungere 12 microlitri di tetraetilene diammina o T-E-M-E-D per polimerizzare l'acrilammide e collocare la camera in un bagno d'acqua a 12 °C per due ore.La polimerizzazione è esotermica, quindi è necessaria una vasca fredda per evitare la vaporizzazione del PSE durante la polimerizzazione. Una volta che l'acrilamide si è polimerizzata, posizionare un trasduttore a potenza focalizzata e una sonda di imaging in un serbatoio in acrilico riempito con acqua deionizzata DGAs in modo che il piano di imaging coincida con il volume focale del trasduttore. Successivamente, posizionare l'idrogel di poli acrilamide caricato con PSNE al fuoco del trasduttore a potenza e vaporizzare il PSNE all'interno dell'idrogel mediante impulsi acustici brevi, seguiti da un'esposizione continua di 15 secondi per l'ablazione potenziata da bolle.Quando la BSA viene denaturata, l'idrogel diventa opaco a causa dell'assorbimento degli ultrasuoni e della generazione di calore all'interno della vaporizzazione monitorata e della formazione di bolle mediante un apparato ecografico diagnostico. In questa immagine esemplificativa, la freccia indica la regione focale in cui una nuvola di bolle è stata generata dalla vaporizzazione dei PSNE. Ripetere l'esposizione acustica in una nuova posizione all'interno dell'idrogel senza sollevare i PSNE e confrontare il tempo e il volume di ablazione.Questo protocollo produce goccioline di perfluorocarburo rivestite da lipidi con una distribuzione dimensionale ristretta. La distribuzione dimensionale misurata mediante scattering dinamico della luce è mostrata qui per PSNE estrusi utilizzando filtri da 100 e 200 nanometri. Le unità degli assi delle ordinate sono basate sull'intensità della luce dispersa da particelle di una certa dimensione rispetto all'intensità totale della luce dispersa dal campione.Quando si misurano il diametro medio e la deviazione standard delle PSNE a uno e sette giorni dall'estrusione con filtri di 100 e 200 nanometri mediante scattering dinamico della luce, i risultati dimostrano che le PSNE sono stabili per almeno una settimana. Questa figura mostra immagini in modalità B delle PSNE prima e dopo la vaporizzazione. In un idrogel di poli acrilamide, la freccia indica la regione focale in cui una nuvola di bolle è stata formata dalla vaporizzazione delle PSNE.Queste sono immagini di un idrogel di poliacrilammide contenente albumina e PSNE prima e dopo la vaporizzazione e la sonificazione con ultrasuoni focalizzati ad alta intensità o Hy Fu. Una lesione viene formata da 15 secondi di riscaldamento mediato da Hy Fu. La forma asimmetrica della lesione è il risultato di un riscaldamento pre-focale che si verifica a causa della presenza di una nube di bolle nel percorso degli ultrasuoni. Il riscaldamento pre-focale e la formazione della lesione dovuti alla dispersione provocata dalle bolle possono essere ridotti diminuendo la potenza acustica trasmessa dopo il suo sviluppo.Questo metodo per la produzione di nanoemulsioni stabili con cambio di fase aprirà la strada ai ricercatori nel campo della terapia mediata da ultrasuoni per esplorare l'ablazione HIFU potenziata da bolle nei tumori solidi. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come produrre nanoemulsioni stabili con cambio di fase e distribuzioni dimensionali ristrette, nonché di come studiare la nucleazione delle bolle e l'ablazione mediata da ultrasuoni potenziata.

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