Registrazione simultanea intracellulare di un motoneuroni lombare e la forza prodotta dal suo gruppo motore nel topo adulto In vivo

L'obiettivo generale di questa procedura è studiare le proprietà elettrofisiologiche e contrattili di una singola unità motrice murina eseguendo registrazioni intracellulari di neuroni motori in vivo. Questo viene ottenuto esponendo innanzitutto il midollo spinale e il muscolo di interesse. Successivamente, un trasduttore di forza viene collegato al tendine del muscolo.

Il neurone motore successivo viene stimolato con un elettrodo intracellulare, provocando così la contrazione dell'unità motrice registrata. In definitiva, le proprietà elettrofisiologiche del neurone motore possono essere caratterizzate contemporaneamente alle proprietà contrattili della sua unità motrice. La dimostrazione visiva di questa tecnica è fondamentale poiché i passaggi di microchirurgia sono molto difficili da apprendere a causa delle piccole dimensioni dell'animale.

Per iniziare la procedura, anestetizzare un topo iniettando pentobarbital sodico o una miscela di chetamina e xilazina per via intraperitoneale. Assicurarsi che il topo non presenti riflesso alla pressione sulle dita dei piedi. Successivamente, praticare un'incisione sopra la trachea utilizzando un paio di forbici ottuse e allontanare la pelle su entrambi i lati.

Quindi separare la ghiandola salivare con una pinza ottusa. Per esporre i due muscoli sottili che ricoprono la trachea, dividere i due muscoli per rivelare la trachea. Utilizzando una pinza Dumont n. 7.

Fare scivolare due fili di seta aut di calibro quattro sotto la trachea. Successivamente effettuare un taglio trasversale nella trachea tra due anelli cartilaginei. Tuttavia, fare attenzione a non sezionare completamente la trachea.

Ora, inserire il tubo tracheale lungo la trachea. Fissare entrambi i lati dell'apertura di inserzione legando i punti di sutura sopra di essa. Successivamente, collegare il tubo tracheale a un ventilatore per topi e a un capnografo.

Quindi collegare il ventilatore all'ossigeno puro attraverso un sacco di compensazione. Regolare i parametri del ventilatore in modo che il topo non opponga resistenza alla ventilazione artificiale e che la pressione parziale di anidride carbonica al fine del respiro rimanga stabile tra il 4 e il 5%. In questo passaggio, esporre la vena giugulare su un lato del collo utilizzando tecniche di dissezione ottusa.

La vena giugulare si divide in due tronchi principali, le vene facciali anteriore e posteriore. Separare con attenzione la vena dal tessuto connettivo circostante. Quindi far scivolare due fili di sutura in seta aut n. 6 sotto la vena, posizionandoli il più distanti possibile lungo la sua lunghezza.

Successivamente, posizionare una pinza per vasi di piccole dimensioni sul lato prossimale della vena e legare il lato distale della vena. Utilizzando forbici da iride molto fini, praticare un piccolo taglio trasversale nella vena. Prestare molta attenzione a non sezionare completamente la vena.

Successivamente, inserire un catetere prefrollato di calibro francese nell'apertura fino alla clip vascolare che tiene insieme la vena e il catetere. Rimuovere con attenzione la clip vascolare. Quindi spingere il catetere di alcuni millimetri in più all'interno della vena. Fissare il catetere legandolo con punti di sutura su entrambi i lati dell'inserzione.

Successivamente, collegare uno dei cateteri a una siringa o a una pompa per siringa per iniettare dosi supplementari di anestetici come pentobarbital, sodio o xilazina chetamina. Ripetere la procedura per un'altra vena e collegare l'altro catetere a una pompa per siringa per un'infusione endovenosa lenta di una soluzione di glucosio al 4% contenente bicarbonato di sodio all'1% e plasmon al 14%. Alla fine, chiudere la cute del collo con ago e filo suturato.

Dopo di ciò, riportare il mouse in posizione prona. Effettuare ora un'incisione dalla parte superiore della coscia fino al tendine di Achille. Separare la pelle dai muscoli sottostanti e fare attenzione a non danneggiare i vasi sanguigni.

Successivamente, identificare il margine anteriore del bicipite femorale, che appare come una linea bianca che corre lungo la coscia. Quindi aprire con attenzione lungo la linea dal ginocchio fino all'osso dell'anca. Separare i muscoli per esporre il nervo sciatico sotto il bicipite femorale.

Dissezionare con attenzione il bicipite femorale e rimuoverlo. Per esporre il nervo sciatico e i muscoli tricipiti surali, identificare il nervo tibiale tra i nervi peroniero comune e surale. Tra i diversi rami del nervo tibiale, distinguere i rami che innervano il tricipite surale da quelli che penetrano più in profondità.

Utilizzando otto fili di seta OTT, legare insieme tutti i rami del nervo tibiale mantenendo intatti i rami che innervano il tricipite surale. Recidere il nervo tibiale il più lontano possibile dal nodo. Identificare le vertebre T13 e L1, dove T13 è l'ultima vertebra a cui sono attaccate le costole.

Quindi immobilizzare la colonna vertebrale utilizzando le pinze vertebrali per il midollo spinale di Cunningham su entrambi i lati di T13 e L1. Avere cura di non comprimere il midollo spinale, ma applicare una leggera trazione sull'asse longitudinale. Assicurarsi che la colonna vertebrale sia ben fissata premendola delicatamente verso il basso con una pinza.

Utilizzando pinzette fini, rimuovere i processi spinosi e quindi la lamina sopra T13 e L1 per esporre il midollo spinale. Successivamente, posizionare un bagno di plastica su misura intorno al midollo spinale. Dopodiché, fissare il bagno in posizione utilizzando un filo di seta numero 4.

Infine, assicurarsi che il bagnetto sia impermeabile sigillandolo con sigillante rapido. Una volta che il sigillante rapido si è asciugato, rimuovere il cotone che copre il midollo spinale e riempire il bagnetto con olio minerale. Utilizzare un altro morsetto vertebrale per fissare un processo spinoso della regione sacrale.

Per sostenere la regione dorsale dell'animale, utilizzare una terza pinza per immobilizzare l'arto posteriore destro e la caviglia flessa ad un angolo di 90 gradi al ginocchio, con l'arto piegato ad angolo di 90 gradi sia al ginocchio che alla caviglia. Rimuovere la garza che copre la zona dell'arto posteriore. Dissezionare il tendine d'Achille dal tessuto circostante.

Staccare il tricipite dalla tessuto circostante il più possibile utilizzando un ago filato. Far passare un filo di seta numero 6 attraverso il tendine di Achille ed eseguire un nodo triplo intorno al tendine. Successivamente, posizionare il trasduttore di forza vicino al nodo.

In seguito, fissare il tendine al trasduttore di forza utilizzando il filo di seta e recidere la parte distale del tendine. Successivamente, inserire due fili di acciaio inossidabile sotto la fascia dei muscoli tricipiti surali. Questi fili sono collegati a un amplificatore extracellulare in corrente alternata.

Per la registrazione dell'EMG, posizionare il nervo tricipitale surale sul catodo di un elettrodo ad uncino con l'anodo a contatto di un muscolo vicino. Quindi stimolare il nervo tricipitale surale utilizzando un impulso quadrato di 50 microsecondi di intensità crescente a bassa frequenza fino a quando non viene osservata l'ampiezza massima del singolo spasmo muscolare. Successivamente, stimolare nuovamente il nervo tricipitale surale con un impulso quadrato di 50 microsecondi di intensità crescente a bassa frequenza fino a quando non si osserva l'ampiezza massima del singolo spasmo muscolare.

Queste figure mostrano come identificare un neurone motore dal gruppo del tricipite surale. Dopo la penetrazione a bassa intensità di stimolazione, solo un EPSP monosinaptico può essere osservato a intensità più elevate. L'EPSP potrebbe essere sufficientemente grande da innescare un potenziale d'azione ortodromico a intensità di stimolazione ancora più elevate, in modo tutto o niente.

L'impulso antidromico appare con una latenza più breve rispetto al potenziale postsinaptico eccitatorio monosinaptico. Se viene iniettata una quantità sufficiente di corrente attraverso il microelettrodo per generare un potenziale d'azione, un'attività EMG può essere registrata sul muscolo dopo un breve ritardo, seguita da un tremito muscolare.

Dopo l'identificazione del neurone motore, è possibile caratterizzarne le proprietà elettrofisiologiche. Ad esempio, questa figura illustra come la resistenza di ingresso possa essere misurata utilizzando impulsi di corrente iperpolarizzanti e depolarizzanti e tracciando le variazioni del potenziale di membrana in funzione della quantità di corrente iniettata. Le proprietà contrattili dell'unità motrice possono inoltre essere studiate mediante diversi protocolli di stimolazione.

Ad esempio, la relazione tra forza e frequenza può essere ottenuta iniettando impulsi brevi di corrente a diverse frequenze nel neurone motore. La forza allo stato stazionario può quindi essere riportata in funzione della frequenza degli impulsi di corrente per rivelare una curva sigmoidea forza-frequenza. Una volta padroneggiata la chirurgia, parte di questa tecnica può essere eseguita in tre ore, se eseguita correttamente.