Elettroencefalografia simultanea, in tempo reale misura della concentrazione di lattato e la manipolazione Optogenetic di attività neuronale nella corteccia cerebrale Rodentia

L'obiettivo generale di questa procedura è misurare il sonno definito dall'EEG e la concentrazione di lattato durante la stimolazione optogenetica a precise coordinate stereotassiche. Impiantare chirurgicamente gli elettroelettroencefalogrammi e le cannule necessari per un sensore di lattato e un cavo in fibra ottica. Quindi inserire il cavo in fibra ottica e il sensore di lattato precalibrato nelle loro cannule guida nel cranio dell'animale.

Quindi, regolare l'intensità dello stimolo della luce blu per ottenere la risposta elettrofisiologica desiderata. Quindi procedi alla raccolta dei dati elettroencefalografici, elettromiografici e della concentrazione di lattato mentre l'animale è lasciato agire spontaneamente e/o dormire. Rispetto ad altri metodi, come gli studi farmacologici dell'EEG, questo approccio sperimentale ha il vantaggio di monitorare la biochimica e l'elettrofisiologia del cervello, mentre l'attività dei neuroni viene manipolata in tempo reale su una scala temporale inferiore al secondo.

Quindi il potenziale per produrre nuove intuizioni per il campo della ricerca sul sonno è alto. Ad esempio, è possibile identificare i concomitanti metabolici ed elettrofisiologici del sonno a onde lente. Questo tipo di esperimento può essere applicato anche in altre aree delle neuroscienze, come l'apprendimento e la memoria, la plasticità sinaptica o i disturbi convulsivi.

La tecnica chirurgica è tecnicamente impegnativa. Richiede una buona dose di destrezza, ma questa può essere raggiunta attraverso la pratica. In questa dimostrazione visiva, itererò i passaggi critici di alcune complicate procedure chirurgiche che completeranno la descrizione scritta.

Una volta che un animale si è ripreso dall'intervento chirurgico, la sfida è inserire correttamente il sensore di lattato e il cavo in fibra ottica. Jonathan ed io dimostreremo come usare una mano ferma quando si trattiene l'animale per inserire questi due delicati pezzi di attrezzatura. Infine, mostreremo come ottimizzare la risposta EEG regolando l'intensità dello stimolo in tempo reale.

Per questo esperimento, utilizzare topi transgenici che esprimono il canale cationico sensibile alla luce blu. Il canale adotta in due nei neuroni corticali cerebrali. Per prima cosa anestetizzare il topo utilizzando il 5% di fluoro, il 95% di ossigeno per l'induzione mantenendo l'anestesia con il 3% di fluoro e il 97% di ossigeno.

Fai un'incisione mediale sulla parte superiore del cranio tra gli occhi e la parte posteriore del cranio. Pulisci il cranio con perossido di idrogeno e soluzione fisiologica sterile. Individuare e contrassegnare B e Lambda per determinare le coordinate stereotassiche per le configurazioni di stimolo optogenetico dell'elettrodo, innescare i fori delle viti con un trapano dentale ad alta velocità con una punta a forma di fresa a sfera da 0,5 millimetri seguita da una punta a sfera da 0,7 millimetri.

Inserire le viti dell'elettrodo kelo gram nei fori con un cacciavite a mano a taglio. Guidali in circa quattro o cinque giri per ottenere la profondità desiderata. Tenere le cannule guida in posizione con una cannula stereotassica, quindi fissarle al cranio e ancorarle con cemento acrilico Per mantenere la pervietà, ogni cannula guida dovrebbe contenere una cannula fittizia o uno stiletto dal momento dell'intervento chirurgico al momento della sperimentazione.

Una volta posizionati gli EEG e le cannule guida nel cranio, legarli insieme con un sottile strato di cemento acrilico dentale. Dopo che il cemento si è solidificato, posizionare il connettore di plastica sopra il cumulo di cemento essiccato venduto alle estremità dei fili che emanano dai cavi EEG ai contatti sul connettore di plastica nel caso in cui i conduttori del filo siano in cemento. Quindi tirare i fili dell'elettromiogramma attraverso i muscoli nuclei facendoli scorrere nella canna di un ago calibro 21.

Forato attraverso il muscolo legare, un doppio nodo da chirurgo, una sutura di nylon a cinque zero attorno a questi fili, appena distale rispetto al punto in cui escono, la sutura muscolare di nuovo insieme, la pelle che è stata retratta per accedere al tessuto muscolare con singoli nodi interrotti del chirurgo utilizzando una sutura a taglio inverso P a tre aghi e cinque a zero nylon. Una volta programmata l'unità di stimolo mc, eseguirla come generatore di segnale autonomo come segnale binario on-off a cinque volt. Collegare l'unità di stimolo mc all'unità di alimentazione abilitata TTL del laser con connettori BNC.

Collegare l'unità di alimentazione laser al laser tramite un cavo a nastro. Collegare anche il laser al connettore FC maschio sul cavo patch in fibra ottica di origine. Collegare il cavo in fibra ottica di origine al giunto rotante.

Commutatore Il giunto rotante in fibra ottica funge da commutatore. Mentre l'animale si muove nella sua gabbia, il giunto rotante ruota per evitare la rottura dei cavi in fibra ottica a causa della coppia rotazionale. Con fascette in plastica fissare il commutatore ad un supporto metallico posto sopra la gabbia cilindrica in cui è alloggiato l'animale.

Trattenere il mouse usando una mano per bloccarlo sotto un palmo a coppa. Orientare la testa tra il medio e l'indice dello sperimentatore. Ora pulisci la cannula guida dai detriti, detriti usando un ago sterile calibro 25.

Quindi inserire manualmente il cavo in fibra ottica e fissarlo alla cannula guida in fibra ottica con tappo a vite filettato. Controllare la profondità di inserimento del cavo in fibra ottica nel cervello mediante un nodo di sutura legato sul cavo in fibra ottica a una distanza fissa dall'estremità piatta e tagliata. Il sensore è equiparato a soluzione salina tamponata con fosfato ed esposto a tre concentrazioni di L lattato in modo graduale.

Secondo i protocolli del produttore, inserire il sensore precalibrato nella cannula guida del lattato montata sul cranio in modo identico alla procedura di inserimento del cavo in fibra ottica. Collegare il sensore di lattato al preamplificatore del biosensore pinnacle 8, 400 con connettori bipolari. Quindi collegare questo preamplificatore al connettore a otto pin sul supporto della testa impiantato chirurgicamente.

Prima di raccogliere i dati, utilizzare la manopola di controllo dell'intensità del laser per regolare l'intensità dello stimolo optogenetico. L'ampiezza della risposta EEG varierà tra gli animali a causa di fattori che non sono stati studiati sistematicamente. E' quindi necessario regolare l'intensità dello stimolo optogenetico e verificare che la risposta EEG sia adeguata al raggiungimento della risposta desiderata.

Raccogli i dati utilizzando il sistema Pinnacle 8, 400 con il punteggio neuro. Un'interfaccia SEIA classifica gli stati di sonno mediante ispezione visiva del processo di dati EEG ed EMG. I dati in epoche di dieci secondi come movimento oculare non rapido, sonno o sonno con movimento oculare rapido in base all'EEG e all'EMG.

Questa configurazione di stimolo optogenetico del biosensore mostra gli elettrodi EEG impiantati chirurgicamente, il sensore di lattato e la cannula per la stimolazione optogenetica. In assenza di stimolazione optogenetica, questo topo è stato sottoposto a sonno spontaneo. Le transizioni dello stato di veglia mentre E-E-G-E-M-G e la concentrazione cerebrale di lattato sono state monitorate continuamente la veglia e i due sottotipi di sonno.

Il movimento oculare rapido e il movimento oculare non rapido sono definiti in base all'EEG e all'EMG. È interessante notare che la corrente del biosensore di lattato aumenta in funzione dell'EEG a bassa ampiezza e diminuisce in funzione dell'EEG ad alta ampiezza. Entrambi i canali dell'EEG rispondono agli stimoli optogenetici erogati nella corteccia frontale.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come impiantare chirurgicamente un topo per la manipolazione optogenetica simultanea e la misurazione dell'elettroencefalogramma, dell'elettromiogramma e della concentrazione di lattato nel cervello. Una volta padroneggiata, questa tecnica chirurgica può essere eseguita correttamente in 90-120 minuti. Ricordarsi di monitorare costantemente la respirazione dell'animale come indicatore della profondità dell'anestesia.

Se l'animale respira meno frequentemente di una volta ogni quattro o cinque secondi, l'anestesia potrebbe essere troppo profonda. Se l'animale respira più frequentemente di una volta ogni due secondi, l'anestesia potrebbe essere troppo leggera. Ricordarsi di prendere le opportune precauzioni di sicurezza quando si utilizza l'agente anestetico gassoso del fluoro.

Garantire un'adeguata ventilazione nella sala operatoria per proteggere la retina dal laser utilizzato per la stimolazione optogenetica. Indossare occhiali protettivi o racchiudere l'animale in un armadietto a prova di luce. Ti consigliamo di esercitarti a impiantare il biosensore di lattato e il cavo in fibra ottica in un topo completamente sveglio.

I topi non sono conformi a queste procedure e devono essere immobilizzati. Tuttavia, il sistema di ritenuta non può essere così forte da ferire l'animale o impedire la respirazione.