Name: Trasmissione di virus vegetali Utilizzo Aleurodidi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-11-08T08:40:00.000+00:00
Duration: 10 min 22 s
Description: Impara a trasmettere virus vegetali usando Bemisia tabaci con tassi di trasmissione quasi del 100%. Questo metodo ottimizza le condizioni di allevamento per studi di virologia vegetale.

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1. Mosche bianche Manutenzione Colony <ol><li> Condizioni ambientali: mosche bianche colonie devono essere mantenuti in una stanza crescita controllata. Controllo di umidità relativa, temperatura, fotoperiodo, e l&#39;intensità della luce sono essenziali per la crescita di colonie ottimale (Figura 1). Una temperatura di 28 ° C, 30-50% di umidità relativa, ed un 14 hr fotoperiodo produrrà una colonia che si sviluppa da uovo ad emergere adulto in 18 giorni (questo tempo varia con la pianta ospite). L&#39;umidità relativa deve essere mantenuta al di sotto del 70% per scoraggiare la crescita di insetti e piante patogeni fungini. Tassi di fertilizzanti e di acqua devono essere ridotti per scoraggiare patogeni fungini e l&#39;accumulo di sale. L&#39;intensità della luce per la colonia dovrebbe essere piuttosto elevato. Lampadine fluorescenti VHO utilizzati in numero sufficiente per generare circa 800-1.000 candele ft all&#39;altezza baldacchino sono adeguate per la maggior parte delle piante (per esempio. Cotone, fagiolo, fagiolo di Lima, pomodoro). La pulizia è essenziale peruna colonia di mosche bianche di mantenere condizioni di allevamento ottimali. </li><li> Gabbie Colony: Aleurodidi devono essere mantenuti su piante in gabbie, anziché gratuito in camera di crescita. Le gabbie possono essere costruite in vari materiali, ma devono permettere: la ventilazione, la facilità di accesso, capacità di evitare la fuga mosche bianche o infiltrazione, e di dimensioni sufficienti a mantenere abbastanza piante per generare la popolazione di mosche bianche necessario. Buoni risultati sono stati ottenuti con organza, più controlli su alluminio (per forza) così come uno screening mosche bianche a prova (vedere la tabella di attrezzature e forniture specifiche). </li><li> Colony impianto di preparazione: Le specie di piante selezionate è una considerazione importante quando si inizia una colonia di mosche bianche. L&#39;impianto dovrebbe essere in grado di sostenere una popolazione ad alto insetto senza crollare. La pianta scelta per una colonia nonviruliferous dovrebbe essere un nonhost per il virus o virus che sono destinati ad essere trasmessi per evitare contaminazioni nella colonia e se il mantenimento di un virulicolonia ferous, deve essere ospite del virus. Le piante devono crescere abbastanza rapidamente per sostenere emergere di nuovi adulti entro 18 giorni di essere introdotto alla colonia ma non così rapidamente a superare le gabbie entro quattro settimane. Nano, cespuglio, o cultivar vegetali patio tipo sono raccomandati in quanto spesso producono una superficie fogliare simile a cultivar più alti, ma senza l&#39;allungamento dello stelo. </li><li> È molto importante per le piante posteriori per la colonia in serre in gabbie che escludono whiteflies e altri insetti. L&#39;uso di piante che sono infestati da aleurodidi, tripidi, acari o prima che entrino nella colonia può causare la colonia al collasso. Piante infestate hanno anche il potenziale per essere infettati con virus trasmesse dagli insetti, che interferiscono con gli studi di trasmissione del virus. </li></ol> 2. Mosche bianche Colony Istituzione <ol><li> Avviare una colonia per la prima volta utilizzando mosche bianche pulite - quelli gratuiti di virus vegetali, altri insetti, insetti e agenti patogeni. Questi possono essere ottenutida collaboratori o dal campo. Se il campo di raccolta, mosche bianche dovrebbero essere allevati per almeno 8 settimane su piante nonhost del virus delle piante, e verificare l&#39;assenza di sintomi di piante per essere sicuri che siano privi di virus vegetali. </li><li> Settimana 1: Introdurre mosche bianche pulite per la prima gabbia di piante. Mosche bianche possono essere introdotti mediante aspirazione di numeri noti o con una leggera agitazione mosche bianche di un&#39;altra pianta fonte secondo le richieste della colonia. Durante la settimana 1, mosche bianche sono le uova sulla parte inferiore della superficie delle foglie delle piante. Una dimensione approssimativa popolazione può essere previsto per ogni emersione in base al numero di adulti utilizzati per deporre le uova e il numero medio di uova deposte dalla whitefly femminile sulla pianta ospite in questione. </li><li> Settimana 2: Inizia un&#39;altra gabbia con l&#39;introduzione di mosche bianche a nuove piante ospiti per deporre le uova. Le piante nella gabbia iniziate in settimana 1 avranno uova, e alcune mosche bianche immature che coprono pagina inferiore delle foglie (Figura 2). Alcunialeurodidi adulti introdotte durante settimana 1 saranno ancora in vita. </li><li> Settimana 3: Iniziare una terza gabbia con l&#39;introduzione di mosche bianche di nuovi impianti per deporre le uova. Le piante nella gabbia iniziato nel 1 settimana dovranno immaturo, così come molti nuovi aleurodidi adulti emergenti e ci dovrebbe essere un aumento molto evidente negli adulti mosche bianche popolazione. Le piante nella gabbia iniziate in settimana 2 avranno molte uova e mosche bianche immature che coprono la pagina inferiore delle foglie. </li><li> Settimana 4: Iniziare una quarta gabbia con l&#39;introduzione di mosche bianche di nuovi impianti per deporre le uova. Le piante nella gabbia iniziate in settimana 1 avranno molte mosche bianche adulte che sono circa una settimana dopo emersione. Le piante nella gabbia iniziate in settimana 2 avrà molte nuove mosche bianche adulte emergenti e ci dovrebbe essere un aumento molto notevole nella popolazione mosche bianche. Le piante nella gabbia iniziate durante la settimana 3 avranno molte uova e mosche bianche immature che coprono la pagina inferiore delle foglie. </li><li> Settimanale dopo il primo 4 weeks: Ogni settimana, inizia una nuova gabbia introducendo i whiteflies adulti dal quarto più antico gabbia (la gabbia iniziata in settimana 1) sui nuovi impianti in una nuova, gabbia pulita. La vecchia gabbia dovrebbe essere rimosso e le sue piante scartato. Queste mosche bianche sono circa 1 settimana di post-emergenza. Nel caso della colonia viruliferous, queste mosche bianche dovranno trasmettere il virus ai nuovi impianti, nonché le uova laici per la prossima generazione di mosche bianche. </li><li> Esperimenti di trasmissione prevede di utilizzare le mosche bianche che emergeranno nella gabbia della terza settimana. Se sono necessarie più mosche bianche, numeri di piante possono essere aumentati e più mosche bianche possono essere aggiunti alla settimana 1 gabbia per aumentare popolazione mosche bianche. </li></ol> 3. Metodo per l&#39;inoculazione di piante di prova <ol><li> Per assicurare elevate velocità di trasmissione: 1) Aleurodidi deve essere maneggiato più delicatamente possibile per evitare di danneggiare l&#39;insetto che consentirà di ridurre le velocità di trasmissione, 2) deve ricevere una sufficiente superficie fogliare disponibile per aleurodidi per IETla sua sonda o di un mangime. Un aumento del tempo di acquisizione o di un aumento del numero di piante ospiti di acquisizione può aumentare bassi tassi di infettività in piante di prova dovuto all&#39;addensamento nella acquisizione o periodo di accesso inoculazione. </li><li> Raccolta di Aleurodidi. Che segue è una procedura per la raccolta e la circolazione di numero preciso degli aleurodidi necessari a fini sperimentali. Per spostare un gran numero di mosche bianche, come è necessario per lo screening di resistenza, ad esempio, è sufficiente scuotere delicatamente le piante infestate da mosche bianche sopra le piante di prova o gli host di acquisizione infettate da virus (e in seguito le piantine). Assicurati di scuotere le piante per molti luoghi di ridurre al minimo gli effetti di aggregazione. </li><li> Di recente è emerso mosche bianche adulte (1-3 giorni dopo la nascita) sono molto attivi e si alimentano in modo spesso tendono a dare le velocità di trasmissione più alti 4. Aleurodidi più vecchi ancora trasmettono, ma ad una frequenza inferiore. Molteplici aleurodidi per pianta di prova (15-40 per plant) deve essere utilizzato per gli alti tassi di trasmissione da un rapporto di 1 mosca bianca per pianta provoca spesso inaccettabili tassi di trasmissione bassi 3,4. Il numero necessario dipenderà dal virus e la specie di acquisizione e di impianti di prova. </li><li> Montare i dispositivi di aspirazione e fiale di raccolta. (Figura 3) </li><li> Con una mano, tenere una scheda di plastica di colore giallo all&#39;interno della gabbia di colonia che contiene le mosche bianche da raccogliere. Battere delicatamente le piante per incoraggiare le mosche bianche adulte a volare. Mosche bianche saranno attratti dal cartellino giallo e voleranno dalla pianta alla carta, dove possono essere raccolti utilizzando un aspiratore e un respiro molto delicato. Non aspirare mosche bianche che si nutrono di piante. I loro stiletti sono incorporati nello stabilimento, mentre l&#39;alimentazione così li tirare fuori le piante si romperanno i loro stiletti e rendendoli incapaci di entrambi acquisire o trasmettere virus (Figura 4). </li><li> Raccogliere circa 20 mosche bianche adulte in un unico colleflaconcino ction per minimizzare i danni fisici agli insetti da aspirazioni ripetute (Figura 5). </li><li> Per cambiare il flacone di raccolta, toccare delicatamente il flaconcino su una superficie dura e tappo con Parafilm mentre le mosche bianche sono disorientati dalla intercettazioni. </li><li> Mettere una nuova raccogliere fiala sulla aspiratore e ripetere fino a quando il numero di mosche bianche necessari sono raccolti. Mosche bianche possono rimanere nelle fiale di raccolta a temperatura ambiente per diverse ore. </li><li> Di acquisizione. Aleurodidi sono posti su una pianta infetta da virus e permesso di nutrirsi delle piante infette per 48-72 ore. Periodi di acquisizione più lunghi di 72 ore generalmente non aumentano le velocità di trasmissione. Per i virus trasmessi in modo non permanente o semipersistent, 1 ora e diverse ore, rispettivamente, sono sufficienti periodi di accesso di acquisizione (Tabella 1). I migliori risultati si ottengono quando whiteflies sono date libero accesso alle piante in gabbie che confinano gli insetti ad un singolo impianto oapiù impianti. Tuttavia alcuni esperimenti richiedono l&#39;acquisizione di foglie specifici in cui possono essere usati Case gabbie di clip. Quando si utilizzano gabbie di clip, è importante accogliere la preferenza alimentazione mosca bianca per pagina inferiore delle foglie. Inoltre, affollamento di mosche bianche in gabbie di clip può ridurre i tassi di trasmissione - tassi accettabili di trasmissione sono stati raggiunti utilizzando 10 mosche bianche femminili per clip gabbia di 2,5 cm di diametro. </li><li> Inoculazione. Preparare una gabbia adatta al formato del inoculazione e posizionare le piantine dentro. Se solo una pianta è da inoculare considerare una singola gabbia di pianta. Se più di un impianto deve essere inoculato in considerazione una piccola struttura in PVC / sacchetto di organza gabbia o una gabbia di alluminio (Figura 6). Le dimensioni della gabbia utilizzata per l&#39;inoculazione dovrebbe essere leggermente più grande della dimensione della pianta (s) da inoculare. Velocità di trasmissione più elevate si ottengono quando mosche bianche sono tenuti vicino alla cupola della pianta e non dato un sacco di spazio libero. </li><li> Raccolta delle mosche bianche da host di acquisizione dipende dalle esigenze dell&#39;esperimento. Se sono necessari piccoli numeri, aspirare whiteflies come descritto sopra. Porre i flaconi di raccolta del whiteflies all&#39;interno della gabbia pressi delle piante e rimuovere il coperchio (Figura 7). Aprire il flacone e rilasciare le mosche bianche o invertire e picchiettare delicatamente il flacone per liberare le mosche bianche. Se sono richieste grandi numeri è sufficiente spostare le piante di acquisizione con mosche bianche nelle gabbie in cui sono ubicati gli impianti di prova e agitare delicatamente le mosche bianche al largo della pianta ospite acquisizione. Per entrambi i tipi di introduzione, assicurarsi di distribuire le mosche bianche attraverso le piante per ridurre al minimo l&#39;aggregazione e assicurare un inoculo uniforme. </li><li> Lasciare le mosche bianche per sondare o mangimi per la giusta quantità di tempo, ancora una volta dipende dal virus e in qualche misura la pianta ospite (Tabella 1). </li><li> Controllare le mosche bianche, almeno una volta durante il periodo di accesso inoculazione per assicurare che le mosche bianche sonoprobing o alimentando aprendo la gabbia e girando sopra alcune foglie su ogni pianta. </li><li> Per i periodi più lunghi di accesso inoculazione, disturbare le piante delicatamente (con un bastone di bambù o equivalente) per spazzolare le cime delle piante e incoraggiare le mosche bianche di ridistribuire sulle piante. La ridistribuzione delle mosche bianche aiuta a garantire una velocità di trasmissione superiore di contrastare la tendenza naturale di mosche bianche di aggregare. </li><li> Terminazione. Il periodo di accesso inoculazione è finita uccidendo le mosche bianche con sostanze chimiche approvate. Applicare due insetticidi uno dopo l&#39;altro: un insetticida da contatto di porre fine rapidamente aleurodidi adulto e un insetticida sistemico di interrompere eventuali mosche bianche che si sviluppano nelle seguenti settimane e quelli perdere per l&#39;insetticida di contatto (Figura 8). Un insetticida di contatto come il sapone insetticida e insetticidi sistemici come imidacloprid o pimetrozina sono stati utilizzati con buon successo. </li></ol>

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Nessun conflitto di interessi dichiarati.

I metodi qui descritti sono stati sviluppati per un periodo di due decenni e sono basate sulle informazioni di base fornita da molti studi di trasmissione whitefly, comportamento e biologia. Poiché ci sono molte pubblicazioni, questo manoscritto si riferisce principalmente a recensioni e ad alcune pubblicazioni specifiche selezionate per illustrare il tipo di dati utilizzati per sviluppare questa tecnica. È molto importante in questa procedura che i whiteflies sono gestite dolcemente poiché rottura delle gambe e antenne può portare a comportamenti anomali e tassi inferiori di trasmissione. Raccolta con aspiratori e altri dispositivi meccanici di aspirazione non ha mai prodotto buoni risultati. Un&#39;altra considerazione per il successo è che il numero di whiteflies utilizzati per ottenere il 100% di trasmissione a piante di prova, deve essere determinata per ciascuna combinazione di pianta ospite e virus. Questo rapporto ottimale deve soltanto essere stabilita una volta. I migliori risultati sono stati ottenuti utilizzando whiteflies giovani adulti (1-3 giorni emergere passato) poiché g piùive più alti tassi di trasmissione. Gli anziani possono essere utilizzati, ma saranno necessari un maggior numero di mosche bianche per compensare i loro tassi di cambio ridotti. Le femmine sono noti per la trasmissione a tassi più elevati rispetto ai maschi, in quanto si nutrono più spesso rispetto ai maschi. Tuttavia non è di solito vale la pena il tempo di separare i sessi per la trasmissione. Questa procedura può essere modificato in molti modi per soddisfare le risorse e le esigenze del ricercatore. Quando si lavora con molti virus è meglio mantenere una singola colonia di mosche bianche allevati su piante nonhost del virus. Queste mosche bianche possono essere raccolti posto su piante infettate da virus per l&#39;acquisizione e poi, dopo l&#39;acquisizione delle mosche bianche possono essere spostati di nuovo per le piantine. Le piante destinate alla colonia dovrebbero essere coltivate in serre in gabbie per evitare l&#39;introduzione di mosche bianche che li possa infettare con un altro virus. Infestazione di queste piante con acari, tripidi, e altri parassiti vegetali può compromettere l&#39;health della colonia e causare il crollo. Infine l&#39;irrigazione delle piante colonia deve essere fatto con cura. Queste piante sono soggette a stress estremo dalla somministrazione di tante whiteflies e le condizioni di luce normali inferiori. Radice marciume funghi che vengono introdotti sul torba nelle miscele fuori suolo può diventare un problema se le piante vengono overwatered ancora una volta. Pretrattamento delle piante con un fungicida drench può eliminare alcuni dei problemi. Mentre la trasmissione mosche bianche dei virus delle piante può richiedere molto tempo e richiedono risorse importanti (come le camere di crescita) è essenziale per la trasmissione di alcuni virus per il quale non abbiamo altri mezzi di trasmissione. E &#39;anche un modo utile di impianti di vagliatura per la resistenza ai virus, in quanto utilizza lo stesso tipo di trasmissione che le piante in campo dovranno resistere. L&#39;uso di mezzi più artificiali di trasmissione non sempre dato i migliori risultati nelle valutazioni di germoplasma per Virus-resistenza.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Nome dell'articolo&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Azienda&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Numero di catalogo&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Commenti (opzionale)&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Schermo anti-aleurodidi</td><td>Klayman Meteor Ltd. Petah Tikva 49130, Israel</td><td>---</td><td>Schermo BioNet a maglia 50, schermo insetticida antivirale</td></tr><tr><td>Schermo anti-aleurodidi</td><td>Hummert International (www.hummert.com)</td><td>27-4050-1 - 27-4062-1</td><td>Schermo BioNet a maglia 50, schermo insetticida antivirale</td></tr><tr><td>Dispositivi per il prelievo di aleurodidi</td><td>BioQuip</td><td>1135A</td><td>Possono essere realizzati anche utilizzando contagocce, tubi flessibili in plastica, adattatori per vuoto in plastica e garza</td></tr><tr><td>Provette per il campionamento</td><td>BioQuip</td><td>8909</td><td>Il tipo di provetta dipende dall'aspiratore utilizzato.</td></tr><tr><td>Schede di plastica gialla</td><td>qualsiasi azienda</td><td>---</td><td>Qualsiasi scheda di plastica gialla brillante va bene, può essere acquistata in molti posti.</td></tr><tr><td>Gabbie per aleurodidi</td><td>---</td><td>---</td><td>Queste gabbie non sono disponibili in commercio e devono essere costruite. Gabbie di dimensioni 60 cm x 60 cm x 60 cm funzionano bene per le nostre esigenze. Preferiamo quelle realizzate con zanzariere in alluminio, organza di nylon, plastica vinilica, con una struttura ottenuta mediante telai per finestre in alluminio. Le porte sono fissate con cerniere a libro e sigillate con guarnizioni per tenuta all'aria; la parte superiore delle gabbie è in plastica vinilica. Le gabbie possono anche essere realizzate in: 1) plexiglass incollato ai bordi, con aperture laterali schermate per la ventilazione; 2) sacchi grandi in organza di nylon, organza o schermo anti-aleurodidi a maglia 50, con supporti interni costituiti da tubi e raccordi in PVC tagliati alla lunghezza desiderata e assemblati all'interno dei sacchi; 3) telai in legno con organza di nylon, organza o schermo anti-aleurodidi a maglia 50.</td></tr></tbody></table>

trasmissione di virus vegetali utilizzo aleurodidi

Transmitting Plant Viruses Using Whiteflies

Aleurodidi, Hemiptera: Aleyrodidae, Bemisia tabaci, un complesso di specie morfologicamente indistinquishable 5, sono vettori di molti virus vegetali. Diversi generi di questi virus vegetali mosche bianche-trasmesse (Begomovirus, Carlavirus, Crinivirus, Ipomovirus, Torradovirus) comprendono diverse centinaia di specie di patogeni emergenti e economicamente significativi di importanti alimenti e piante tessili (recensito da 9,10,16). Questi virus non si replicano nel loro vettore, ma comunque sono spostati facilmente da pianta a pianta dalla mosca bianca adulta con vari mezzi (recensito da 2,6,7,9,10,11,17). Per la maggior parte di questi virus che alimentano mosche bianche è necessario per l&#39;acquisizione e l&#39;inoculazione, mentre per gli altri è richiesto solo di sondaggio. Molti di questi virus sono in grado o non può essere facilmente trasmessi con altri mezzi. Pertanto la manutenzione delle colture di virus, biologici e caratterizzazione molecolare (identificazione del campo ospite e sintomi) 3,13, Ecologia 2,12, richiede che i virus trasmessi agli host sperimentali utilizzando il vettore di mosca bianca. Inoltre lo sviluppo di nuovi approcci alla gestione, come ad esempio la valutazione di nuove sostanze chimiche o composti 14 15, nuovi approcci culturali 1,4,19, o la selezione e lo sviluppo di cultivar resistenti 7,8,18, richiede l&#39;uso di aleurodidi per trasmissione del virus. L&#39;uso di trasmissione mosche bianche di virus vegetali per la selezione e lo sviluppo di cultivar resistenti in programmi di riproduzione è particolarmente impegnativo 7. Selezione efficace e screening per la resistenza impiega un elevato numero di piante e vi è una necessità per il 100% delle piante da inoculate per trovare i pochi genotipi che possiedono geni di resistenza. Questi studi utilizzano un numero elevato di viruliferous mosche bianche, spesso più volte all&#39;anno. Manutenzione Whitefly descritto qui in grado di generare centinaia o migliaiadelle mosche bianche adulti sulle piante ogni settimana, tutto l&#39;anno, senza la contaminazione di altri virus delle piante. Piante gratuitamente sia aleurodidi e virus devono essere prodotti di introdurre nella colonia di mosche bianche ogni settimana. Whitefly culture devono essere tenuti liberi di mosche bianche patogeni, parassiti e parassitoidi che possono ridurre le popolazioni mosche bianche e / o ridurre l&#39;efficienza di trasmissione del virus. Colonie prodotte nella maniera descritta possono essere scalati rapidamente per aumentare o diminuire numeri della popolazione come necessario, e possono essere variate secondo le preferenze di alimentazione della whitefly basata sull&#39;host pianta del virus. Ci sono due tipi fondamentali di colonie di mosche bianche che possono essere mantenuti: un nonviruliferous e una mosca bianca viruliferous colonia. La colonia nonviruliferous è composta da mosche bianche allevati su piante virus e permette la disponibilità settimanale di mosche bianche che possono essere utilizzati per trasmettere i virus provenienti da diverse culture. Il viruliferous mosche bianche colonia,composto da mosche bianche allevati su piante infettate da virus, permette la disponibilità settimanale di mosche bianche che hanno acquisito il virus omettendo in tal modo un passo nel processo di trasmissione del virus.

Questi metodi per whitefly stabilimento colonie e manutenzione, così come la manipolazione di trasmettere virus vegetali sono stati utilizzati con successo in una serie di studi 4,11,12,14 così come molti altri non citati. Usando questi metodi con virus persistentemente trasmessi, abbiamo ottenuto ordinariamente i tassi desiderati di trasmissione del 100% per la selezione per la resistenza, lo screening insetticidi per la loro capacità di interferire con la trasmissione (e valutazione di composti che inducono resistenza) 13,14,17,18 ( Figura 9). Le procedure qui descritte possono essere e sono stati adattati alle molte posizioni in strutture di ricerca pubbliche e private. <table border="1"><tbody><tr><td> Tipo di trasmissione </td><td> Acquisizione Periodo di accesso (ora) </td><td> Inoculazione Periodo di accesso (ora) </td><td> Rif. </td></tr><tr><td> Non permanente </td><td> 1 </td&gt; <td> 2-24 </td><td> 10 </td></tr><tr><td> Semipersistent </td><td> 6-24 </td><td> 8-24 </td><td> 10, 16 </td></tr><tr><td> Persistente </td><td> 48-72 </td><td> 48-72 </td><td> 3, 6, 8, 9 </td></tr></tbody></table> Tabella 1. Tempi stimati che possono essere utilizzati per produrre alti tassi di trasmissione di virus con diversi tipi di relazioni con i loro vettori Bemisia tabaci specie complesse. Tempi stimati sono basati su tempi minimi pubblicati richiesti per la trasmissione 80-100% e modificato in alcuni casi per tenere conto di periodi di latenza e le differenze tra le popolazioni di mosche bianche, virus e piante ospiti. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/4332/4332fig1.jpg" /> Figura 1. Un esempio di una mosca bianca viruliferous colonia. Questa stanza contiene le gabbie di crescita delle piante infettate con un begomovirus e infested con viruliferous mosche bianche. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/4332/4332fig2.jpg" /> Figura 2. A sinistra: immaturi fasi della mosca bianca, Bemisia tabaci MEAM clade sensu De Barro 6 circa 1 settimana di post-emergenza e di destra: un adulto mosca bianca, un vettore efficace di molti virus delle piante. <img alt="Figura 3" fo:content-width="5.5in" fo:src="/files/ftp_upload/4332/4332fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/4332/4332fig3.jpg" /> Figura 3. Tipi di dispositivi di raccolta che possono essere utilizzati per raccogliere whiteflies per la trasmissione virus vegetale. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/4332/4332fig4.jpg" /> Figura 4. A sinistra: carta di plastica giallo utilizzato per raccogliere gli adulti mosche bianche che mostrano mosche bianche pronte per la raccolta<html> . Destra: Raccolta mosche bianche da una carta di plastica giallo. Mosche bianche può essere visto sulla carta, come piccole macchie bianche / grigio. <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/4332/4332fig5.jpg" /> Figura 5. Whiteflies raccolti da aspirazione (20 in una fiala) dalla colonia sia pronta per acquisizione o inoculazione. <img alt="Figura 6" fo:content-width="5.5in" fo:src="/files/ftp_upload/4332/4332fig6highres.jpg" src="/files/ftp_upload/4332/4332fig6.jpg" /> Figura 6. In alto a sinistra:. Gabbie singole piante utilizzate a fini sia di acquisto o di inoculazione In alto a destra: gabbie più grandi realizzati in tubo pvc e organza. Inferiore: alluminio / schermo e gabbie di organza in una serra piante contenenti destinati ad una colonia mosca bianca. 32fig7.jpg &quot;/&gt; Figura 7. Mosche bianche vengono trasferiti a un unico impianto per inoculazione (o acquisizione). <img alt="Figura 8" src="/files/ftp_upload/4332/4332fig8.jpg" /> Figura 8. L&#39;aggiunta di un insetticida sistemico inzuppare per terminare il periodo di accesso inoculazione mosche bianche. <img alt="Figura 9" src="/files/ftp_upload/4332/4332fig9.jpg" /> Figura 9. Piante di campo in fase di valutazione per la resistenza a leaf curl virus giallo del pomodoro. Tutte le piante sono state inoculate in 5 settimane vecchie piantine e poi trapiantato al campo per la valutazione. Piante in primo piano sono una linea di germoplasma resistente, piante sullo sfondo sono linea germoplasma sensibili.

Migliorare la nostra comprensione e la nostra capacità di gestire molti dei virus delle piante insetto-trasmesse richiede l&#39;uso del vettore. Trasmissione insetto di virus vegetali è una interazione tritrofico, e come tale richiede la manipolazione di insetti, virus, e vegetali. Vettori devono essere allevati in gran numero e manipolati in modo tale da assicurare alti tassi di trasmissione di piante test. Le basi di allevamento e di manipolare la mosca bianca,<em&gt; Bemisa tabaci</em&gt; (<em&gt; Hemiptera: Aleyrodidae</em&gt;), Un vettore di virus vegetali appartenenti a vari generi impianto emergenti virus, che rappresentano un gran numero di virus economicamente rilevanti è presentato.

Trasmissione di virus vegetali Utilizzo Aleurodidi

Le mosche bianche, Hemiptera: Aleyrodidae, Bemisia tabaci, un complesso di specie morfologicamente indistinguibili5, sono vettori di molti virus vegetali. Diversi...

L'obiettivo generale del seguente esperimento è trasmettere virus vegetali utilizzando mosche bianche. Questo obiettivo viene raggiunto allestendo e mantenendo una colonia di mosche bianche, in grado di fornire settimanalmente nuovi adulti non contaminati da altri possibili vettori o patogeni. Le colonie vengono mantenute aggiungendo regolarmente mosche bianche a piante giovani prive di insetti, dalle quali vengono prodotti nuovi adulti.Dopo 17-20 giorni ogni settimana, gli adulti appena emersi possono essere trasferiti su piante di prova per acquisire o trasmettere il virus. Solitamente si ottengono efficienze prossime al 100%, e i tassi di trasmissione inizieranno generalmente bassi per poi aumentare grazie a un'ottimizzazione sistematica. L'aspetto più complesso nell'utilizzo delle mosche bianche per l'inoculazione dei virus consiste nell'allevare questi insetti escludendo patogeni e insetti indesiderati.I patogeni, in particolare i funghi causanti il marciume radicale e le macchie fogliari, ridurranno la qualità delle piante ospiti del virus. Insetti indesiderati come i tripidi possono inibire la riproduzione dei bianconidi e compromettere la qualità della pianta ospite del virus. Le procedure saranno dimostrate da Heather Capa Bianco, una tecnica del mio laboratorio.Le colonie di aleurodidi devono essere mantenute in una stanza di crescita pulita e controllata. Il controllo dell'umidità relativa, della temperatura, del fotoperiodo e dell'intensità luminosa è essenziale per una colonia che si sviluppa dall'uovo all'adulto in 18 giorni; utilizzare le seguenti impostazioni. La temperatura deve essere impostata tra 26 e 30 gradi Celsius, e l'umidità relativa dovrebbe idealmente essere compresa tra il 30 e il 50%. Se l'umidità relativa supera il 70%, è probabile che diventino un problema patogeni fungini degli insetti e delle piante.Il periodo fotosintetico ideale è di 14 ore. L'intensità luminosa deve essere piuttosto elevata e le lampade fluorescenti VHO possono produrre da 800 a 1000 candele piede alla volta della chioma della pianta. Anche le dosi di fertilizzante e l'irrigazione devono essere ridotte per scoraggiare i patogeni fungini, nonché l'accumulo di sali. Le gabbie per insetti whitely devono permettere una buona ventilazione, facilità di accesso e uno spazio sufficiente per una popolazione crescente di whitely.Sono stati ottenuti buoni risultati utilizzando organza organico più schermatura in alluminio, così come schermatura bianca. L'identificazione della specie vegetale è un aspetto importante da considerare. In primo luogo, la pianta dovrebbe crescere rapidamente, senza però invadere eccessivamente la camera. In secondo luogo, la pianta deve essere abbastanza robusta da sostenere una popolazione elevata di insetti senza crollare.Per questi motivi, i cultivar nani o arbustivi rappresentano una buona scelta vegetale. In terzo luogo, la pianta deve essere in grado di ospitare oppure non ospitare il virus utilizzato, a seconda del tipo di colonia da allevare. Poiché la colonia può collassare a causa di acari, THPs, mosche bianche selvatiche o altri insetti invasivi, i cultivar scelti devono essere coltivati in un ambiente protetto per escludere altri insetti.Le prime mosche bianche di una nuova colonia devono essere prive di virus vegetali, altri insetti e patogeni degli insetti. Se le mosche bianche vengono raccolte in campo, elevarle per almeno otto settimane su piante che non siano ospiti del virus; durante questo periodo, verificare l'assenza di sintomi vegetali. Una volta ottenute mosche bianche libere da contaminazioni, introdurne da 20 a 100 in una gabbia di piante mediante aspirazione o agitandole delicatamente da un'altra pianta di origine.Ogni settimana è necessario allestire una nuova gabbia. Per le prime tre settimane, utilizzare le aleurodidi prelevate dalle piante non-ST per allestire la nuova gabbia. A partire dalla quarta settimana, utilizzare aleurodidi giovani adulte provenienti dalla gabbia di tre settimane per allestire la gabbia successiva.Nella prima settimana in gabbia, le aleurodidi deporranno le uova sulla pagina inferiore delle foglie delle piante. Nella seconda settimana, diventeranno evidenti le forme immature delle aleurodidi e alcuni adulti saranno ancora vivi. Nella terza settimana, emergeranno molte nuove aleurodidi adulte e si dovrebbe osservare un aumento molto evidente della popolazione adulta di aleurodidi.Questi aleurodidi possono essere utilizzati per esperimenti di trasmissione. Alla quarta settimana, gli adulti di una settimana devono essere trasferiti in una nuova gabbia. La vecchia gabbia deve essere rimossa e le piante eliminate.Il trasferimento delicato delle mosche bianche viene effettuato con un dispositivo ad aspirazione e provette di raccolta, senza mai aspirare direttamente. Le mosche bianche che si nutrono sulle piante hanno gli stili boccali inseriti nel tessuto vegetale e si spezzeranno se vengono staccate bruscamente dalla pianta, rendendo inutile la raccolta. Per raccogliere le mosche bianche, tenete una provetta in una mano e, con l'altra mano, posizionate una protezione di plastica gialla all'interno della gabbia della colonia.Battere leggermente le piante per indurre gli adulti della mosca bianca a volare. La mosca bianca sarà attratta dalla scheda gialla, dove potrà essere raccolta. Utilizzando l'aspiratore e una depressione molto delicata, aggiungere non più di 20 mosche bianche in ciascun flacone di raccolta.Quindi, battere delicatamente sul flacone per stordire i moscerini e chiudere il flacone con paraffina. Per garantire un efficace trasmissione virale, utilizzare da 15 a 40 adulti giovani provenienti da piante infette a seconda del virus e della pianta ospite. Altri protocolli, come la selezione per resistenza, richiedono popolazioni iniziali più numerose.In questo caso, agitare le piante infette da virus, infestate da mosche bianche, sopra le piante che devono essere inoculate. Una volta posizionate le mosche bianche su una pianta infetta da virus, lasciarle nutrire per 48-72 ore per acquisire virus trasmessi in modo persistente. Un tempo maggiore di solito non aumenta il tasso di trasmissione per i virus trasmessi in modo non persistente o persistentemente sagace.Un periodo di accesso più breve, da un'ora a un giorno, è sufficiente per esperimenti che richiedono l'acquisizione da foglie specifiche. Si possono utilizzare gabbiette a molletta: posizionare la gabbietta in modo che la pagina inferiore della foglia sia accessibile, e non utilizzare più di 10 femmine di mosca bianca per ogni gabbietta di diametro 2,5 centimetri, poiché il tasso di trasmissione diminuirebbe a causa dell'affollamento. Per l'inoculazione delle piante, scegliere la gabbietta appropriata in base al numero di piante.Una pianta, ad esempio, necessita di una piccola gabbia appena più grande di sé stessa; per più piante, scegliere tra una tubatura in PVC più piccola, una gabbia con telaio o una gabbia più grande con struttura in alluminio. Più ridotto è lo spazio intorno alla chioma della pianta, meglio è. Una volta aggiunte le mosche bianche alla nuova pianta, il tempo necessario per l'inoculazione dipende dal virus e dalla pianta ospite.Come per l'acquisizione, la quantità di tempo richiesta per la trasmissione dipende dal tipo di trasmissione. La trasmissione non persistente richiede un tempo di accesso molto più breve rispetto alla trasmissione semi-persistente o persistente. Verificare che le aleurodidi stiano effettuando la perforazione o l'alimentazione durante il periodo di accesso all'inoculazione.Aprire la gabbia ed esaminare la pagina inferiore di alcune foglie su ogni pianta. Per i periodi di inoculazione più lunghi, disturbare periodicamente le piante con delicatezza per favorire la ridistribuzione degli insetti sulle piante.Questo aumenterà la velocità di trasmissione contrastando la tendenza naturale delle mosche bianche ad aggregarsi, ponendo così fine al periodo di inoculazione. Eliminare le mosche bianche mediante l'applicazione di due insetticidi, uno dopo l'altro. Applicare innanzitutto un insetticida a contatto per eliminare rapidamente gli adulti, ad esempio sapone insetticida.In secondo luogo, applicare un insetticida sistemico per eliminare qualsiasi mosca bianca che si sviluppi nelle settimane successive. Sono scelte efficaci qualsiasi adulto rimanente, arid o pyrazine. Utilizzando questi procedimenti, è possibile ottenere regolarmente tassi di trasmissione del virus del 100%. Tali elevati tassi di trasmissione sono essenziali quando si esegue la selezione di piante test per la resistenza al virus e sono desiderabili quando si valuta l'efficacia di composti chimici per la loro capacità di interferire con la trasmissione del virus.Dopo aver visto questo video, dovreste avere una buona comprensione di come allevare mosche bianche e utilizzarle per trasmettere virus vegetali. Queste procedure possono essere impiegate a scopi di ricerca o per lo sviluppo commerciale di piante resistenti ai virus, oppure per il test di composti in grado di interferire con la trasmissione virale.

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Biologia

Gli afidi sono efficaci trasmettitori di virus delle piante. Microiniezione afide del virus, la procedura che vi mostrerò oggi, è una tecnica che permette ai ricercatori di iniettare virus direttamente nel hemocoel di afidi, bypassando l'intestino, uno dei 2 principali ostacoli per la trasmissione del virus in modo circulative. La stessa tecnica viene utilizzata anche per iniettare dsRNA per RNAi.

Test della barriere fisiologiche di trasmissione virale in Afidi Utilizzando Microiniezione

Descriviamo qui un semplice ibridazione in situ fluorescente (FISH) metodo per la localizzazione di virus e batteri nei tessuti insetti e vegetali. Questo protocollo può essere esteso per la visualizzazione di mRNA in tutto il monte e le sezioni microscopiche.

Fluorescenza<em&gt; In situ</em&gt; Ibridazioni (FISH) per la localizzazione di virus e batteri endosimbiontica a Plant e Insetti tessuti

Qui vi presentiamo un protocollo per propagare le cellule Homalodisca vitripennis e HoCV-1 in vitro. Media è stato rimosso dalla HoCV-1 colture positive e RNA estratto ogni 24 ore per 168 ore. Sopravvivenza cellulare è stata quantificata trypan colorazione blu. Particelle virali intere sono stati estratti dopo l'infezione. RNA estratto è stato quantificato da qRT-PCR.

Propagazione di<em&gt; Virus-01 Homalodisca coagulata</em&gt; Via<em&gt; Homalodisca vitripennis</em&gt; Cell Culture

Qui, vi presentiamo un protocollo per indagare la distribuzione host-tessuto, modalità di trasmissione, e l'effetto sulla forma fisica host di un densovirus all'interno di una specie di lepidotteri, il bollworm cotone. Questo protocollo può essere utilizzato anche per studiare l'interazione tra altri virus per via orale-trasmissibili e loro ospiti dell'insetto.

Protocolli per Indagare la distribuzione Host-tessuti, trasmissione-mode, e Effetto sul Fitness ospite di un Densovirus in cotone bollworm

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Metodi per l&#39;estrazione di Endosymbionts dalla Whitefly<em&gt; Bemisia tabaci</em

Questa carta segnala il protocollo per l'analisi di una rapida identificazione per Bemisia tabaci basato sulla tecnologia di amplificazione isotermica mediata da loop (lampada). Il protocollo richiede un addestramento minimo laboratorio e può, pertanto, essere implementato in loco nei punti di ingresso per l'importazione di vegetali quali porti ed aeroporti.

Un'analisi di amplificazione isotermica (lampada) mediata da Loop per la rapida identificazione di Bemisia tabaci

Descriviamo un'immunofluorescenza e un metodo PCR quantitativo per la localizzazione e la quantificazione dei begomovirus nei tessuti degli insetti. Il protocollo di immunofluorescenza può essere utilizzato per co-localizzare proteine virali e vettoriali. Il protocollo PCR quantitativo può essere esteso per quantificare i virus in corpi di mosca intero e piante infettate da virus.

Localizzazione e quantificazione dei begomovirus nei tessuti delle mosche bianche mediante immunofluorescenza e PCR quantitativo

Viene presentato un protocollo di iniezione (agroiniezione) a base di Agrobacterium per l'inoculazione del virus del mosaico a coda di volpe e dei virus del mosaico della canna da zucchero in piantine di mais. L'inoculazione in questo modo porta a infezioni virali, silenziamento genico indotto da virus di geni marcatori e sovraespressione virale di GFP.

Agroinoculazione diretta di piantine di mais per iniezione con cloni infettivi del virus del mosaico della coda di volpe ricombinante e virus del mosaico della canna da zucchero

Questo protocollo per la marcatura immunofluorescente sia delle proteine del virus vegetale che delle proteine degli insetti vettori nelle viscere degli insetti asportati può essere utilizzato per studiare le interazioni tra virus e insetti vettori, le funzioni delle proteine degli insetti e i meccanismi molecolari alla base della trasmissione del virus.

Marcatura immunofluorescente di virus vegetali e proteine di insetti vettori nell'intestino degli emitteri

Questo protocollo dimostra come utilizzare l'ospite della pianta per rilevare le proteine salivari delle cicaline e le proteine virali vegetali rilasciate dai vettori delle cicaline.

Rilevamento del virus e delle proteine salivari di un vettore cicalina nell'ospite della pianta

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Un metodo preciso e quantificabile per raccogliere emolinfa da piccoli artropodi

Impara a trasmettere virus vegetali usando Bemisia tabaci con tassi di trasmissione quasi del 100%. Questo metodo ottimizza le condizioni di allevamento per studi di virologia vegetale.

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