Generazione rapida e efficiente di neuroni da cellule staminali umane pluripotenti in un formato piatto Multititre

L'obiettivo generale del seguente esperimento è quello di differenziare le cellule staminali pluripotenti umane o PSC H in neuroni utilizzando un formato di piastra multititolazione. Ciò si ottiene raccogliendo e placcando una sospensione a cella singola di PSC H nel fondo V 96. Piastre a pozzetti per formare corpi embrionali o EBS durante la notte.

Successivamente, gli EBS vengono trasferiti in piastre di attacco ultra-basse a forma di U contenenti terreno di differenziazione per indurre la formazione del neuroectoderma. Successivamente, gli EBS vengono placcati su piastre rivestite di matrigel per promuovere la crescita dei neuroni. Si possono ottenere risultati che mostrano la presenza di marcatori neuronali tipici intorno all'ottavo giorno mediante immunofluorescenza.

I protocolli per differenziare le cellule staminali umane prepotenti in neuroni sono spesso complicati e noiosi. Un po' accidentalmente. Ci siamo imbattuti in una procedura molto semplice per creare neuroni da cellule staminali umane prepotenti.

Da un punto di vista tecnico, il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti è che è facile da eseguire, rapida ed economica. Allo stesso tempo, a presentare la procedura sarà il dottor MI Z del laboratorio. Preparare il terreno di formazione EB e il mezzo di differenziazione come indicato nel protocollo scritto.

Coltivare PSC h in condizioni prive di alimentatore, come un terreno condizionato con metanfetamina su piastre rivestite di matrigel, o utilizzando sistemi di coltura chimicamente definiti in condizioni di crescita attiva subconfluente. L'uso di uno stereomicroscopio con una punta di pipetta in plastica sterile rimuove meccanicamente le colonie differenziate spontaneamente. Lavare le colonie indifferenziate rimanenti con PBS e utilizzare Accutane contenente un inibitore della roccia x per digerire in singole cellule.

Pellettare le singole celle mediante centrifugazione a 200 G per due minuti e sospendere Resus in un piccolo volume di terreno di formazione EB. Utilizzare un emocitometro per determinare il titolo cellulare. Aggiungere altre cellule al terreno di formazione EB rimanente per arrivare a un titolo compreso tra 40.000 e 80.000 cellule per millilitro.

Utilizzando una pipetta multicanale, trasferire 100 microlitri per pozzetto su una piastra inferiore da 96 V, ottenendo da 4.000 a 8.000 cellule per pozzetto. Bene. Centrifugare la piastra in una centrifuga a piastre oscillanti a 400 G per un minuto per raccogliere tutte le cellule sul fondo dei pozzetti. Trasferire le cellule in un incubatore e lasciare che EBS si formi durante la notte il giorno successivo sotto lo stereomicroscopio.

Raccogliere l'EBS e trasferirlo in un piccolo volume in una capsula batterica di 3,5 centimetri contenente due millilitri di differenziazione. Medio. Lavare le celle ruotando delicatamente il piatto. Aggiungi 100 microlitri di terreno di differenziazione a ciascun pozzetto di un attacco ultra basso.

Piastra inferiore a 96 pozzetti al microscopio stereoscopico. Trasferire l'EBS in piccoli volumi dalla piastra di lavaggio nei pozzetti a 96 U. Incubare l'EBS per quattro giorni per consentire la formazione del neuroectoderma il quarto giorno.

Lavare le cellule in terreno di differenziazione e seminarle una ad una nei pozzetti di una piastra multititolazione rivestita in matrigel, come una piastra a 12 pozzetti. Le cellule dovrebbero essere equamente distribuite all'interno dei pozzetti per consentire la crescita indisturbata dei neuroni. Lasciare che l'EBS si attacchi liberamente al matrigel per circa 10 minuti a temperatura ambiente.

Quindi trasferire con cura la piastra nell'incubatrice. I neuroni cresceranno dall'EBS placcato in modo radiale entro i prossimi quattro giorni. In precedenza abbiamo dimostrato che, in linea con molti altri, l'EBS da PSC H potrebbe essere generato semplicemente mediante riplaccatura, aggregati dopo la suddivisione di routine di HPC H in piastre a basso attacco.

Questo di solito si traduce in un'ampia distribuzione delle dimensioni delle cellule. Un altro problema è che gli EBS mantenuti in sospensione tendono ad aggregarsi l'uno con l'altro, portando a un'eterogeneità delle dimensioni ancora più elevata per aggirare questo singolo H. Le PSC sono state invocate in pozzetti a basso attaccamento, il che ha comportato l'assenza di formazione di EB e la morte cellulare. Tuttavia, la combinazione della molecola di sopravvivenza cellulare, Y 2 7 6 3 2 con l'alcol polivinilico, che ha dimostrato di migliorare la formazione di EB dalle HSC, ha permesso alla formazione di EBS da sospensioni HESC a singola cellula durante la notte.

Convenientemente, le dimensioni EB in questo formato di piastra multititolazione possono essere controllate strettamente posizionando un numero diverso di celle per pozzetto. A differenza dell'utilizzo di tecniche convenzionali, dopo aver trasferito EBS su piastre a 96 U con attacco ultra-basso, la formazione del neuroectoderma è stata indotta utilizzando un piccolo cocktail di molecole costituito da inibitori F-G-F-E-R-K-T-G, TGF beta SMA due e BP SMA uno, che ha poi permesso alle cellule di essere piastrate su matrigel per dare origine ai neuroni. L'avvio della formazione di EB da circa 8.000 cellule ha prodotto la migliore capacità di differenziazione neuronale, che è caratterizzata da pronunciate escrescenze neuronali dall'ebs placcato.

Riduzione dei centri necrotici EB dopo la placcatura e alta espressione di marcatori sensoriali e panneuronali come B rrn tre A e beta tre tubulina. L'efficienza complessiva della differenziazione neuronale sembra essere paragonabile alla procedura originale, che finora è applicabile sia alle HSC che alle PSC HI. Tre linee HPSC indipendenti, cellule HES e cellule HIPS sono state testate con successo nella procedura multi-pozzetto, mentre la variabilità dipendente dalla linea cellulare e l'efficienza di differenziazione non possono generalmente essere escluse.

Questa figura mostra quattro cellule neuroectodermiche dissociate in un singolo giorno che sono state placcate come singole cellule e differenziate con successo a circa il 60% di efficienza La gestione di EBS nella piattaforma multi titter richiede un po' di allenamento all'inizio, ma dopo un po' di tempo, vedrai che è abbastanza facile.