Name: Generazione rapida e efficiente di neuroni da cellule staminali umane pluripotenti in un formato piatto Multititre (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-03-05T12:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 27 s
Description: Scopri un protocollo rapido ed efficiente per differenziare cellule staminali pluripotenti umane in neuroni utilizzando piastre multititre. Questo metodo semplificato facilita la ricerca neuroscientifica con marcatori tipici visibili già dal giorno otto.

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Questo lavoro è stato finanziato dalla Max Planck Society.

1. Preparazione di Matrigel piastre rivestite e Media <ol><li> Preparazione di Matrigel piastre rivestite Matrigel è stato trovato per essere un substrato preferito per il fissaggio di differenziare EBs e promuove anche la conseguenza efficiente di questi neuroni di 10. <ol><li> Scongelare 10 ml di una notte sul ghiaccio Matrigel. </li><li> Il giorno dopo, diluire il gelatinosa Matrigel con due volumi di ghiaccio-freddo DMEM/F-12 e preparare aliquote di 1 ml in prechilled provette da 15 ml coniche che possono essere conservati congelati a -20 ° C. </li><li> Decidere su un formato di piastra per la differenziazione neuronale. Per esempio, come punto di partenza, si consiglia di effettuare un primo giro di differenziazione in un 12-pozzetti. Pre-raffreddare quattro piastre da 12 pozzetti a 4 ° C. Sciogliere un&#39;aliquota di Matrigel congelate aggiungendo 9 ml di pre-raffreddate DMEM/F-12 seguiti pipettando su e giù fino a che tutto il prediluito Matrigel è stato scongelato e disciolto. </li><li> Poi, Trasferire il contenuto in un nuovo tubo da 50 ml contenente 15 ml di DMEM/F-12 su ghiaccio (diluizione finale Matrigel: 1:75). Quindi, si aggiungono 0,5 ml di Matrigel diluito ad ogni pozzetto di pre-raffreddamento 12-pozzetti. Avvolgere le piastre con Parafilm e lasciare riposare a notte RT. </li><li> Giorno successivo, trasferire piastre a 4 ° C. Piastre rivestite possono essere conservati per diverse settimane prima dell&#39;uso. </li></ol></li><li> Media </li></ol> EB medie formazione (~ 15 ml necessario effettuare differenziazione in una piastra a 96 pozzetti - vedi Tabella 1 e schema della figura 2): DMEM/F-12 con il 0,4% (PVA) 1x N2 1x B27 0,05% BSA 20 ng / ml FGF2 10 pM Y-27.632 1x PenStrepGln Differenziazione media (~ 30 ml necessario effettuare differenziazione in una piastra a 96 pozzetti, seguito dalla formazione neurone in uno Matrigel rivestita 12-pozzetti, vedi Tabella 1): DMEM/F-12 1x N2 <br/&gt; 1x B27 0,05% BSA 0,5 micron PD0325901 15 um SB431542 0,5 micron Dorsomorphin 1x PenStrepGln 2. EB Formazione forzata <ol><li> Grow hPSCs sotto i vostri preferiti alimentatore senza condizioni. Usiamo MEF condizionata medie su Matrigel rivestite piastre da 6 pozzetti 15. Tuttavia, i sistemi di coltura di altri come i media definiti fatti in casa o commerciale deve anche lavorare. Al momento di avviare un esperimento differenziazione, hPSCs dovrebbe essere sub-confluenti e attiva crescita. </li><li> Rimuovere meccanicamente spontaneamente colonie differenziate con una punta di pipetta sterile di plastica sotto un microscopio stereo. </li><li> Lavare le restanti colonie indifferenziate con PBS, e digerire di singole cellule utilizzando Accutase contenente 1X Y-27632. Pellet di cellule singole mediante centrifugazione a 200 xg per 2 minuti, risospendere in un piccolo volume di mezzo di formazione EB e determinare titolo cellulare mediante un hematocytometer. </li><li> Aggiungi una aliquota di celluleil restante formazione medio EB comportare un titolo tra 40.000 e 80.000 cellule per ml. </li><li> Usando una pipetta multicanale, trasferire 100 microlitri per pozzetto di una piastra di fondo-96V, con conseguente 4000 a 8000 cellule per pozzetto. Spin piastra da 96 pozzetti in un incernierato centrifuga piastra a 400 xg per 1 minuto per raccogliere le cellule al fondo dei pozzetti, e trasferimento incubatore per colture cellulari. EBs formerà durante la notte, come mostrato in Figura 1. </li></ol> 3. Neuroectoderma induzione <ol><li> Giorno successivo (giorno 0), raccogliere EBs dalla piastra 96V sotto un microscopio stereo e trasferimento in un piccolo volume in un piatto 3,5 centimetri batterica contenente 2 ml di terreno di differenziamento. Agitare delicatamente il piatto per alcuni secondi per lavare il EBS. </li><li> Aggiungere 100 pl di mezzo di differenziazione per pozzetto di un ultra-bassa attacco U-bottom piastra a 96 pozzetti. In uno stereomicroscopio, il trasferimento EBS in piccoli volumi dalla lavastoviglie in 96U-pozzetti (uno EB per noill). Inserire la piastra di 96U in incubatore per colture cellulare per 4 giorni per permettere la formazione neuroectoderma. </li></ol> 4. Neuron Formazione <ol><li> Il giorno 4, preparare un piatto di lavaggio come al punto 3.1 e inoltre sostituire DMEM/F-12 in un pre-riscaldato Matrigel rivestita 12-pozzetti da terreno di differenziamento (1 ml per pozzetto). </li><li> Placcatura di EBS <ol><li> Raccogliere EBs dalla piastra 96U, lavare questi semi come sopra, e con cura uno per uno nei pozzetti del Matrigel rivestite 12-pozzetti (circa 8 EBs per pozzetto): EB deve essere equamente distribuita all&#39;interno dei pozzetti per consentire di conseguenza indisturbato neuroni nel corso dei prossimi giorni (vedi immagine &quot;ore 5&quot; in Figura 2). </li><li> Prima del trasferimento del 12 e piastra posteriore in incubatrice, EBs consentono di collegare liberamente per circa 10 minuti a temperatura ambiente. Poi, trasferire accuratamente 12 pozzetti alla cultura incubatore cellulare. Neuroni crescerà fuori dal placcato EBs in modo radiale entro 4 giorni, come shown in figura 2 (il &quot;Giorno 8&quot; immagine a destra). </li></ol></li></ol> 5. Formazione Neuron come monostrati <ol><li> In alternativa alle fasi del punto 4), al giorno 4 della procedura, raccogliere EBs in un piatto 3,5 centimetri batterica contenente 2 ml di terreno di differenziamento, poi trasferire EBs in un piccolo volume di PBS contenente un piatto, e poi in un altro piatto contenente Accutase. </li><li> Lasciate digerire a cellule singole, centrifugare a 200 xg per 2 minuti, risospendere in un piccolo volume di terreno di differenziamento e determinare titolo cellulare mediante un hematocytometer. Regolare il titolo a 1-2X10 6 cellule per ml con terreno di differenziamento (senza Y-27632). </li><li> Cellule piastra out in pre-riscaldato Matrigel rivestite 12-pozzetti (1 ml per pozzetto), e trasferimento in coltura cellulare incubatore. Formazione neurone come monostrati è stata osservata tra i giorni 7-8 (Figura 3C). Va notato, tuttavia, che questa variante del monostratola procedura non è completamente ottimizzato per quanto riguarda la sopravvivenza delle cellule e substrato più adatto. </li></ol>

<ol><li>Thomson, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+stem+cell+lines+derived+from+human+blastocysts%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts.</a> Science. 282, 1145-1147 (1998).</li>
<li>Takahashi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+adult+human+fibroblasts+by+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors.</a> Cell. 131, 861-872 (2007).</li>
<li>Koch, P., Opitz, T., Steinbeck, J. A., Ladewig, J., Brustle, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rosette-type%2C+self-renewing+human+ES+cell-derived+neural+stem+cell+with+potential+for+in+vitro+instruction+and+synaptic+integration%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">A rosette-type, self-renewing human ES cell-derived neural stem cell with potential for in vitro instruction and synaptic integration.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 3225-3230 (2009).</li>
<li>Chambers, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+neural+conversion+of+human+ES+and+iPS+cells+by+dual+inhibition+of+SMAD+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Highly efficient neural conversion of human ES and iPS cells by dual inhibition of SMAD signaling.</a> Nat. Biotechnol. 27, 275-280 (2009).</li>
<li>Lee, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+directed+differentiation+of+neural+crest+stem+cells+derived+from+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Isolation and directed differentiation of neural crest stem cells derived from human embryonic stem cells.</a> Nat. Biotechnol. 25, 1468-1475 (2007).</li>
<li>Li, X. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specification+of+motoneurons+from+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Specification of motoneurons from human embryonic stem cells.</a> Nat. Biotechnol. 23, 215-221 (2005).</li>
<li>Pera, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+human+embryonic+stem+cell+differentiation+by+BMP-2+and+its+antagonist+noggin%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Regulation of human embryonic stem cell differentiation by BMP-2 and its antagonist noggin.</a> J. Cell Sci. 117, 1269-1280 (2004).</li>
<li>Smith, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+Activin%2FNodal+signaling+promotes+specification+of+human+embryonic+stem+cells+into+neuroectoderm%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Inhibition of Activin/Nodal signaling promotes specification of human embryonic stem cells into neuroectoderm.</a> Dev. Biol. 313, 107-117 (2008).</li>
<li>Greber, B., Lehrach, H., Adjaye, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+early+fate+decisions+in+human+ES+cells+by+distinct+states+of+TGFbeta+pathway+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Dev%22%5BJournal%5D)">Control of early fate decisions in human ES cells by distinct states of TGFbeta pathway activity.</a> Stem Cells Dev. 17, 1065-1077 (2008).</li>
<li>Greber, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FGF+signalling+inhibits+neural+induction+in+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">FGF signalling inhibits neural induction in human embryonic stem cells.</a> EMBO J. 30, 4874-4884 (2011).</li>
<li>Anderson, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Familial+dysautonomia+is+caused+by+mutations+of+the+IKAP+gene%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Hum.+Genet%22%5BJournal%5D)">Familial dysautonomia is caused by mutations of the IKAP gene.</a> Am. J. Hum. Genet. 68, 753-758 (2001).</li>
<li>Lee, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modelling+pathogenesis+and+treatment+of+familial+dysautonomia+using+patient-specific+iPSCs%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Modelling pathogenesis and treatment of familial dysautonomia using patient-specific iPSCs.</a> Nature. 461, 402-406 (2009).</li>
<li>Burridge, P. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+human+embryonic+stem+cell+embryoid+body+homogeneity+and+cardiomyocyte+differentiation+from+a+novel+V-96+plate+aggregation+system+highlights+interline+variability%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Improved human embryonic stem cell embryoid body homogeneity and cardiomyocyte differentiation from a novel V-96 plate aggregation system highlights interline variability.</a> Stem Cells. 25, 929-938 (2007).</li>
<li>Watanabe, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+ROCK+inhibitor+permits+survival+of+dissociated+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells.</a> Nat. Biotechnol. 25, 681-686 (2007).</li>
<li>Xu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Feeder-free+growth+of+undifferentiated+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Feeder-free growth of undifferentiated human embryonic stem cells.</a> Nat. Biotechnol. 19, 971-974 (2001).</li>
<li>Burridge, P. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+universal+system+for+highly+efficient+cardiac+differentiation+of+human+induced+pluripotent+stem+cells+that+eliminates+interline+variability%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A universal system for highly efficient cardiac differentiation of human induced pluripotent stem cells that eliminates interline variability.</a> PLoS One. 6, e18293(2011).</li>
</ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Maggior parte dei protocolli di differenziazione che comportano la formazione di EB da hPSCs, compresa la nostra procedura precedentemente pubblicato con il 10, sono basati su manuale o enzima-assistita raccolta di hESC come aggregati, il che porta inevitabilmente a eterogeneità nei formati EB. Questo fatto porta a variabilità in efficienza differenziazione con alcune linee cellulari, rendendo così difficile analisi sistema, in particolare su scala velocità media. Inoltre, la dissezione manuale è alta intensi...

hPSCs, composto da embrioni derivati ​​da cellule staminali embrionali umane (hESC) e cellule staminali pluripotenti indotte (hiPSCs), sono pluripotenti significato che possono dare origine a diverse linee cellulari in vitro 1-2. Numerosi tipi di cellule differenziate sono stati derivati ​​da hESC ad oggi, sostenendo l&#39;idea che queste cellule presentano strumenti utili per la ricerca scientifica e basati su celle approcci di screening, e promettenti per terapie a base di cellule. Protocolli per la differenziazione neuronale hESC sono solitamente complesse e lunghe quanto sono spesso basati sulla prima sorte indurre complessiva neurale, seguito da isolamento manuale dei progenitori neurali, e la differenziazione terminale successiva in un determinato tipo di neurone di interesse 3-6. In alcuni riguardo, questa complessità non è sorprendente e inevitabile dato che un tale state-of-the-art protocolli di differenziazione diretti tendono a imitare graduale primi stadi dello sviluppo umano, which è di per sé estremamente complesso. D&#39;altra parte, può in parte anche riflettere la nostra mancanza di comprensione dei processi molecolari sottostanti, con conseguente protocolli di differenziazione che sono ancora lungi dall&#39;essere completamente ottimizzato. Per quanto riguarda la conversione di hPSCs indifferenziate in neuroectoderma, Pera et al. trovato che la soppressione di BMP / SMAD1/5/8 segnalazione aumenta l&#39;induzione neurale del hESC 7. Inoltre, l&#39;inattivazione di SMAD2 / 3 segnalazione ha dimostrato di promuovere la formazione neuroectoderma 8. Di conseguenza, l&#39;inattivazione combinata di queste due vie tende a generare una più efficace di induzione neurale del hPSCs 4,9. Più di recente, abbiamo dimostrato che un percorso di segnalazione terzo, FGF / ERK, funge da repressore forte delle prime fasi di impegno neuroectodermica in hESC. Al contrario, la repressione simultanea di tutti e tre questi percorsi portare a quasi omogenea conversione di hESC in neuroectoderma conin soli quattro giorni 10. Successivamente, la differenziazione terminale altamente efficiente in neuroni funzionali è stato osservato entro otto giorni. I neuroni ottenuti sono stati probabilmente i neuroni sensoriali del sistema nervoso periferico, che può in parte spiegare la loro derivazione rapida 10. Difetti nella manutenzione neurone sensoriale è considerata una causa di alcune patologie umane come disautonomia familiare 11. Per la modellazione di tali malattie basato su tecnologia hiPSC 12, per un&#39;ulteriore caratterizzazione funzionale, nonché per scopi applicati non richiedono alcun tipo particolare di neuroni, questa procedura differenziazione può presentare una base utile. Tuttavia, la strategia di differenziazione che avevamo originariamente impiegato coinvolto formazione di corpi embrionali (EB) da ciuffi di colonie hESC 10, e ciò ha determinato un bel grado di eterogeneità per quanto riguarda formati EB, e apparso anche di compromettere l&#39;efficienza formazione dei neuroni in alcune ceLinee ll. Inoltre, a causa della eterogeneità in dimensioni EB, la possibilità di verificare sistematicamente effetti dei fattori di crescita addizionali o piccole molecole durante e dopo la formazione dei neuroni sembravano essere alquanto confuso. In questo rapporto, abbiamo adattato la nostra procedura precedente per un rendimento medio-compatibile, l&#39;aggregazione forzata a base di tecnica per generare EBs in una dimensione altamente controllato modo, come mostrato anche in altri contesti 13. Successivamente, l&#39;EBS generato in forma di V pozzetti di piastre da 96 pozzetti sono state trasferite a forma di U bassissimo attaccamento piastre da 96 pozzetti, per avviare la formazione neuroectoderma in sospensione. Quattro giorni più tardi, l&#39;EBS potrebbe essere piastrate dando origine a neuroni terminalmente differenziate ad alta efficienza e omogeneità. In alternativa, giorno-4 EBs erano dissociate in singole cellule e placcato in quanto tale, che ha portato a bassa densità monostrati di neuroni umani. Risultati coerenti sono stati finora ottenuti con due indipendentemente delinee di hESC rived, HuES6 e NCl3. Come prerequisito, formazione EB successo era strettamente dipendente l&#39;uso di un polimero sintetico, alcool polivinilico (PVA), insieme con inibitore ROCK Y-27.632 noto per promuovere la sopravvivenza hESC 13-14. Come risultato, l&#39;omogeneità del EBs formata in 96-V-piastre è stata notevolmente migliorata rispetto a formazione di EBS come culture di massa basato su metodi di frazionamento casuali. Questo sistema fornisce quindi una piattaforma significativamente migliorato per la formazione neuroectoderma in coltura in sospensione, seguito dalla formazione neurone altamente controllato in condizioni aderenti.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome del reagente </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td><td> Commenti </td></tr><tr><td> Matrigel HC </td><td> Becton Dickinson </td><td> 354263 </td><td> Vedere il testo per ulteriori dettagli sulla gestione </td></tr><tr><td> DMEM/F-12 </td><td> Life Technologies </td><td> 21331-020 </td><td></td></tr><tr><td> Poli (vinil alcool) </td><td> Sigma </td><td> 363170 </td><td> Sciogliere al 0,4% in DMEM/F-12 utilizzando un bagno d&#39;acqua ad ultrasuoni / evitare il surriscaldamento / può essere conservato a 4 ° C per diverse settimane </td></tr><tr><td> N2 Supplemento </td><td> Life Technologies </td><td> 17502-048 </td><td> 100X, memorizzare come aliquote congelate </td></tr><tr><td> B27 Supplemento </td><td> Life Technologies </td><td> 12587-010 </td><td> 50X, negozio come aliquote congelate </td></tr><tr><td> Albumina di siero bovino </td><td> Sigma </td><td> A1595 </td><td> 10% = 500X, negozio come aliquote congelate </td></tr><tr><td> L-Glutammina con penicillina / streptomicina </td><td> PAA </td><td> P11-013 </td><td> O equivalente </td></tr><tr><td> FGF2 </td><td> Peprotech </td><td> 100-18B </td><td> Sciogliere a 10 pg / ml in 0,1% di BSA / PBS = 1000X, negozio come aliquote congelate </td></tr><tr><td> ROCK inibitore Y-27.632 </td><td> abcamBiochemicals </td><td> Asc-129 </td><td> Sciogliere a 10 mM in DMSO = 1000X, negozio come aliquote congelate </td></tr><tr><td> PBS </td><td> PAA </td><td> H15-002 </td><td> O equivalente </td></tr><tr><td> Accutase </td><td> PAA </td><td> L11-007 </td><td></td></tr><tr><td> Da 96 pozzetti con fondo a V piastre </td><td> Nunc </td><td> 277143 </td><td></td></tr><tr><td> PD0325901 </td><td> Axon medchem </td><td> Axon 1408 </td><td> Sciogliere a 0.5 mM in DMSO = 1000X, negozio come aliquote congelate </td></tr><tr><td> SB431542 </td><td> abcamBiochemicals </td><td> Asc-163 </td><td> sciogliere a 15 mM in DMSO = 1000X, negozio come aliquote congelate </td></tr><tr><td> Dorsomorphin </td><td> Santa Cruz </td><td> sc-200689 </td><td> sciogliere a 0.5 mM in DMSO = 1000X, negozio come aliquote congelate </td></tr><tr><td> 96 pozzetti U-basso ultra-low di fissaggio piastre </td><td> Corning </td><td> 7007 </td><td></td></tr><tr><td> beta-III anticorpo Tubulin (mouse) </td><td> Sigma </td><td> T8660 </td><td> utilizzare a 1:1000 </td></tr><tr><td> beta-III tubulina (coniglio) </td><td> Covance </td><td> PRB-435P </td><td> utilizzare a 1:2000 </td></tr><tr><td> BRN3A (POU4F1) anticorpo </td><td> Santa Cruz </td><td> sc-8429 </td><td> utilizzare a 1:500 </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Tabella 1. &lt;/ Strong&gt; reagenti e attrezzature specifiche. </td></tr></tbody></table>

generazione rapida e efficiente di neuroni da cellule staminali umane pluripotenti in un formato piatto multititre

Rapid and Efficient Generation of Neurons from Human Pluripotent Stem Cells in a Multititre Plate Format

Protocolli esistenti per la generazione di neuroni da cellule staminali pluripotenti (hPSCs) sono spesso noioso in quanto sono procedure multistep coinvolgono l&#39;isolamento e l&#39;espansione di cellule precursori neurali, prima differenziazione terminale. In confronto a questi approcci in termini di tempo, abbiamo recentemente scoperto che l&#39;inibizione combinata di tre vie di segnalazione, TGFβ/SMAD2, BMP/SMAD1 e FGF / ERK, promuove la rapida induzione neuroectoderma da hPSCs, seguita da immediata differenziazione in neuroni funzionali. Qui, abbiamo adattato la nostra procedura per un nuovo formato di piastra multititre, per migliorare ulteriormente la sua riproducibilità e di renderlo compatibile con metà del throughput delle applicazioni. Esso si articola in quattro giorni di formazione neuroectoderma in sfere galleggianti (corpi embrionali), seguito da altri quattro giorni di differenziamento in neuroni in condizioni aderenti. La maggior parte delle cellule ottenute con questo protocollo sembrano essere i neuroni sensoriali bipolari. Inoltre,la procedura è altamente efficiente, non richiede particolari competenze esperte, e si basa su un mezzo chimicamente definito semplice con piccole molecole costo-efficienti. A causa di queste caratteristiche, la procedura può servire come piattaforma utile per un&#39;ulteriore indagine funzionale così come per la cella di screening avvicina richiedendo umani neuroni sensoriali o neuroni di qualsiasi tipo.

Nella nostra precedente relazione, in linea con molti altri, EBs da hPSCs potrebbe essere generato semplicemente replating aggregati al momento scissione di routine di hPSCs in basso attaccamento piatti 10. Questo di solito si traduce in una distribuzione gamma di formati EB risultanti (Figura 1C, in alto). Un altro problema derivante da questo è che EBs mantenute in sospensione tendono ad aggregarsi tra loro, portando ad una eterogeneità ancora maggiore di dimensioni EB. Per aggirare questi ...

Protocolli per la differenziazione neuronale di cellule staminali pluripotenti umane (hPSCs) sono spesso molto tempo e richiedono notevoli capacità di colture cellulari. Qui, abbiamo adattato una piccola molecola procedura basata differenziazione di un formato di piastra multititre, permettendo la generazione semplice, rapido, efficace e di neuroni umani in modo controllato.

Generazione rapida e efficiente di neuroni da cellule staminali umane pluripotenti in un formato piatto Multititre

I protocolli esistenti per la generazione di neuroni a partire da cellule staminali pluripotenti umane (hPSC) sono spesso laboriosi in quanto consistono in procedure composte da più fasi...

L'obiettivo generale del seguente esperimento è differenziare cellule staminali pluripotenti umane, o H PSCs, in neuroni utilizzando un formato a piastre con pozzetti multipli. Questo viene ottenuto raccogliendo e seminando una sospensione monocellulare di H PSCs in piastre a 96 pozzetti con fondo a V per formare corpi embrionali, o EBS, durante la notte.Successivamente, gli EBS vengono trasferiti in piastre ultra-low ad attacco a forma di U contenenti mezzo di differenziamento per indurre la formazione del neuroectoderma. In seguito, gli EBS vengono seminati in piatti rivestiti con matrigel per favorire l'espansione dei neuroni. I risultati possono essere ottenuti intorno al giorno otto e mostrano la presenza di marcatori neuronali tipici mediante immunofluorescenza.I protocolli di colorazione per differenziare cellule staminali umane pluripotenti in neuroni sono spesso complicati e laboriosi. In modo del tutto accidentale, abbiamo scoperto un procedimento molto semplice per ottenere neuroni da cellule staminali umane pluripotenti.Da un punto di vista tecnico, il principale vantaggio di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti è che è semplice da eseguire, rapida ed economicame

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Abbiamo stabilito un protocollo per l'induzione di neuroblasti pluripotenti direttamente da cellule staminali embrionali umane conservati in condizioni definite con piccole molecole, che permette la derivazione di una grande quantità di progenitori neuronali umane e tipi di cellule neuronali nel sistema nervoso centrale per lo sviluppo neurale riparazione.

Derivazione efficiente di progenitori neuronali umane e Neuroni pluripotenti da cellule staminali embrionali umane con induzione piccole molecole

Qui mostriamo un protocollo semplice ed efficace per la generazione di iPSCs umani da 3-4 ml di sangue periferico utilizzando un singolo vettore lentivirale riprogrammazione. La riprogrammazione delle cellule del sangue prontamente disponibili promette di accelerare l'utilizzo della tecnologia iPSC rendendola accessibile ad una comunità di ricerca più ampio.

Generazione di cellule pluripotenti indotte umane staminali da sangue periferico mediante il STEMCCA lentivirale Vector

Il video mostra un metodo per staccare e reimpiantare neuroni derivati da cellule staminali pluripotenti umane utilizzando un enzima proteolitico delicato. Dopo la filtrazione e la centrifugazione, i neuroni vengono riposizionati su una piastra multipozzetto rivestita per l'incubazione, favorendo l'adesione e la maturazione.

Replating di neuroni differenziati derivati da cellule staminali pluripotenti umane

Questo video dimostra il processo di differenziazione dei corpi embrioidi (EB) in aggregati neuroepiteliali e la loro successiva divisione in cellule neuronali e gliali. Questo metodo consente la generazione efficiente di cellule neuronali e gliali in vitro, che fungono da sistemi di test per i test di tossicità e per la valutazione delle diverse vie coinvolte nella neurotossicità.

Generazione di neuroni e cellule gliali da corpi embrioidi derivati da cellule staminali pluripotenti indotte umane

Questo video descrive un metodo per preparare vetrini coprioggetti rivestiti con poliornitina e laminina per migliorare l'adesione e la crescita delle cellule staminali neurali. La tecnica prevede incubazioni e lavaggi sequenziali, facilitando la formazione di una matrice di supporto che promuove la crescita e la differenziazione delle cellule neuronali, imitando le strutture presenti nei neuroni.

Generazione di neuroni piramidali corticali da cellule staminali neurali umane

Qui vi presentiamo il nostro metodo stabilito per riprogrammare cellule somatiche umane in libera-transgene iPSCs umane con virus di Sendai, che mostra esito coerente e una maggiore efficienza.

Efficiente generazione indotta umane pluripotenti cellule staminali da cellule somatiche umane con Sendai-virus

Spine dendritiche di neuroni piramidali sono i siti di maggior sinapsi eccitatorie in mammiferi corteccia cerebrale. Il metodo descrive un'analisi quantitativa 3D di morfologie della colonna vertebrale nei neuroni piramidali glutamatergici corticali umane derivate da cellule staminali pluripotenti indotte.

Quantificazione tridimensionale di spine dendritiche da piramidale neuroni derivate da cellule staminali umane pluripotenti indotte

Modifichiamo e implementare un protocollo precedentemente pubblicato che descrive la differenziazione rapida, riproducibile ed efficiente di indotto umani cellule staminali pluripotenti (hiPSCs) in eccitatorio neuroni corticali 12. In particolare, la nostra modifica permette il controllo della densità delle cellule neuronali e uso su array micro-elettrodi per misurare le proprietà elettrofisiologiche a livello di rete.

Rapid neuronale differenziazione delle cellule staminali pluripotenti indotte per misurare l&#39;attività di rete su array Micro-elettrodo

Questo protocollo descrive una procedura dettagliata per la resuspending e la coltura di neuroni derivati da cellule staminali umane che in precedenza erano differenziati dai progenitori neurali in vitro per più settimane. La procedura facilita i saggi basati sull'imaging di neuriti, sinapsi e marcatori neuronali che esprimono tardivamente in un formato compatibile con la microscopia leggera e lo screening ad alto contenuto.

Replatazione post-differenziazione dei neuroni derivati da cellule staminali pluripotenti umane per lo screening ad alto contenuto di neuritogenesi e maturazione delle sinapsi

Mostriamo l'automazione delle colture di cellule staminali pluripotenti indotte dall'uomo (hiPSC) e delle differenziazioni neuronali compatibili con l'imaging e l'analisi automatizzati.

Produzione automatizzata di neuroni corticali e dopaminergici pluripotenti indotti dall'uomo con monitoraggio integrato delle cellule vive

Il presente protocollo descrive un sistema di induzione retinica neurale 3D ottimizzato che riduce l'adesione e la fusione degli organoidi retinici con elevata ripetibilità ed efficienza.

Generazione di retina neurale da cellule staminali pluripotenti umane

Scopri un protocollo rapido ed efficiente per differenziare cellule staminali pluripotenti umane in neuroni utilizzando piastre multititre. Questo metodo semplificato facilita la ricerca neuroscientifica con marcatori tipici visibili già dal giorno otto.

Generazione rapida e efficiente di neuroni da cellule staminali umane pluripotenti in un formato piatto Multititre

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