Aortica trapianto ortotopico in Mouse per lo studio della malattia vascolare

Lo scopo di questa procedura è trapiantare l'aorta addominale di un topo donatore in un topo ricevente allogenico. Questo viene realizzato innanzitutto ottenendo l'aorta del donatore. Successivamente, il sito dell'innesto viene costruito nell'animale ricevente.

L'aorta nativa dell'animale ricevente viene quindi dissezionata e divisa. L'ultimo passaggio consiste nell'utilizzare due anastomosi vascolari estremità-estremità per impiantare l'aorta del donatore. In definitiva, questa procedura può essere utilizzata per studiare lo sviluppo della malattia vascolare post-trapianto in combinazioni di ceppi allogenici.

Il vantaggio di questo metodo rispetto, ad esempio, al trapianto eterotopico di cuore, è che risulta più semplice effettuare un'analisi morfometrica poiché i vasi hanno dimensioni uniformi. Inoltre, il vaso non è circondato da tessuto parenchimale, che potrebbe essere a sua volta circondato da infiltrati cellulari e da altri elementi in grado di complicare l'analisi dei dati ottenuti. L'uso di questa tecnica può risultare particolarmente utile per illustrare i meccanismi coinvolti nella malattia vascolare post-trapianto, una problematica ancora irrisolta nei trapianti clinici umani.

Per ridurre al minimo gli effetti dello stress e massimizzare le riserve energetiche, mantenere gli animali nel vivario per almeno 72 ore prima dell'intervento chirurgico. Nel giorno dell'intervento, posizionare una tavola chirurgica in metallo sopra un tappetino riscaldante impostato tra 35 e 38 gradi Celsius. Successivamente, dopo l'anestetizzazione, rimuovere i peli dall'addome ventrale dell'animale.

Utilizzare del nastro da laboratorio per fissare l'animale in posizione supina sulla tavola operatoria, quindi disinfettare per tre volte l'intera area rasata dell'animale con un disinfettante seguito da etanolo, usando forbici sterili. Successivamente, praticare un'incisione attraverso la parete corporea per esporre le viscere addominali. Poi, utilizzare un bastoncino di cotone sterile per spostare le viscere lateralmente su un pezzo di garza sterile inumidita con soluzione salina tiepida, esponendo così i grossi vasi dell'addome.

Ora, con molta attenzione, dissezionare in modo ottuso l'aorta addominale dai tessuti circostanti, compresa la vena cava inferiore, quindi sollevare con cura e cauterizzare l'arteria lombare. Il tratto di aorta da dissezionare deve trovarsi al di sotto dei vasi renali e al di sopra della biforcazione dell'aorta nelle arterie femorali. Dopo aver identificato l'area, posizionare un punto di sutura appena al di sotto delle arterie renali e un altro appena al di sopra della biforcazione.

Successivamente, utilizzare le forbici per dividere l'aorta e quindi tenere con molta attenzione un'estremità del vaso e far gocciolare soluzione salina eparinizzata in modo che scorra attraverso il vaso per gravità. Quindi manipolare il meno possibile le estremità del vaso. Rimuovere la protesi e posizionarla immediatamente in un contenitore con soluzione salina fredda con ghiaccio.

Dopo aver somministrato anestesia e analgesia all'animale ricevente, rasare l'addome ventrale come appena mostrato. Applicare un unguento oftalmico a base di gentamicina sugli occhi per prevenire che si secchino, quindi sanificare l'addome come appena dimostrato per garantire un'adeguata disinfezione. Effettuare ora un'incisione mediana attraverso la cute e la parete corporea in stadi successivi.

Quindi inserire un divaricatore per mantenere aperta l'incisione addominale, orientando il gruppo a vite verso l'estremità posteriore dell'animale per tenere la maggior parte della pinza fuori dalla zona di lavoro. Successivamente, posizionare una garza sterile inumidita con soluzione salina sopra gli intestini. Quindi tenere delicatamente la garza in posizione con un dito.

Inserire un tampone sterile di cotone sotto gli intestini e rifletterli delicatamente in modo che gli intestini si trovino sopra la garza. Posizionare un altro pezzo di garza sterile sugli intestini e inumidirlo con soluzione fisiologica. Dopo aver rimosso delicatamente qualsiasi tessuto adiposo che copre l'ATA e la vena cava inferiore, utilizzare la pinzetta per dissezionare con attenzione l'aorta infrarenale dalla vena cava inferiore.

Ora liberare un'area sufficientemente ampia da ospitare due morsetti e un numero di vasi tale che, una volta divisi, ci sia abbastanza vaso a cui poter suturare l'innesto. Si noti che il filo nero può essere utilizzato per percepire il proprio peso lungo il vaso. Durante la dissezione, cercare i rami vascolari, cauterizzandoli con un cauterizzatore a bassa temperatura, se necessario.

Successivamente, inserire una pinza vascolare appena al di sotto dell'arteria renale e un'altra pinza vascolare appena al di sopra della biforcazione. Quindi tagliare l'aorta. In questo caso, il taglio viene effettuato più vicino alla biforcazione perché un vaso collaterale è stato cauterizzato vicino al centro delle due pinze, creando un'apertura per l'anastomosi; le estremità dell'aorta di solito si ritraggono, lasciando uno spazio di circa cinque millimetri.

Verificare l'emostasi. Se le pinze funzionano correttamente, dovrebbe fuoriuscire solo una piccola quantità di sangue dopo il taglio. Successivamente, risciacquare le estremità tagliate dell'aorta con soluzione salina eparinizzata e quindi asportare la soluzione in eccesso con un tampone.

Ora fissare il trapianto in posizione utilizzando tre suture distanziate a ciascuna estremità. Successivamente, suturare un lato dell'anastomosi a ciascuna estremità e completare il resto con sette-otto suture distanziate. Se si preferisce una sutura continua, prestare attenzione affinché le pareti del vaso rimangano rilassate e non si verifichi una stenosi all'atto dell'anastomosi.

Ora rimuovere con attenzione la pinza all'estremità craniale dell'aorta e verificare la presenza di perdite lungo le linee di sutura. Successivamente, premere delicatamente sull'aorta sopra il sito di anastomosi con un applicatore di cotone inumidito e rimuovere la seconda pinza. Premere e rilasciare leggermente l'aorta alcune volte per verificare che il vaso sia pervio. Il trapianto verrà perfuso immediatamente e dovrebbe essere visibile un polso.

Ora, rimuovere la garza che copre gli intestini e riposizionarli, mantenendo la loro normale orientazione anatomica ed evitando torsioni. Utilizzare un punto di sutura in Vicryl cinque zero per chiudere lo strato muscolare e quindi chiudere la cute con un punto di sutura in proline cinque zero o sei zero. Trattare il topo per via sottocutanea con carprofene per potenziare l'analgesia prima di interrompere l'anestesia, quindi somministrare al topo da 0,5 a 0,8 millilitri di soluzione salina per la stessa via.

Infine, posizionare il topo in una gabbia riscaldata per il recupero e monitorare attentamente l'animale. A 12 e 24 ore dall'intervento, somministrare rispettivamente buprenorfina e carprofene per via sottocutanea all'animale. Questa prima figura mostra un innesto aortico.

Si notino le linee di sutura indicate dalle frecce bianche. È rappresentato un esperimento tipico in cui la sopravvivenza dei riceventi è stata monitorata per un periodo di 56 giorni. Il gruppo di controllo era costituito da topi riceventi di tipo selvatico C57BL/6 x FVB trapiantati con aorte intestinali.

Il gruppo sperimentale era composto da riceventi C57BL6xFVB, carenti nell'espressione dell'eme ossigenasi uno. Questo knockout provoca la trombosi degli innesti entro 24 ore. In modo significativo, ciò ha portato alla morte di tutti i riceventi.

Quest'ultima figura mostra le misurazioni ecografiche della vena cava inferiore e dell'aorta addominale in un animale normale e in un ricevente di trapianto. Si noti che il graft è pervio e presenta un aspetto simile a quello dell'aorta non trapiantata. Come hai potuto osservare, i tessuti sono molto delicati e di piccole dimensioni, quindi è importante tenere presente che questa procedura è sicuramente una competenza acquisita e, pertanto, richiederà una buona dose di pratica prima di poter essere eseguita con successo e in modo routinario, una volta padroneggiata.

Questa tecnica può essere eseguita entro un'ora se viene effettuata correttamente.