Name: Rapida analisi genetica di epitelio-mesenchimale segnalazione durante la rigenerazione dei capelli (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-02-28T12:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 9 s
Description: Scopri l'analisi genetica rapida della segnalazione epitelio-mesenchimale durante la rigenerazione dei capelli utilizzando cellule dermiche ed epidermiche isolate da topi neonati. Questo metodo innovativo permette di valutare rapidamente la funzione genica in vivo.

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Questo lavoro è stato sostenuto da NIH NRSA 1F32CA14208701 (SXA) e le sovvenzioni NIH AR052785 e AR046786 (AEO e W.-MW).

1. Preparare 0 a 2 giorni topi appena nati vecchi per dissezione pelle <ol><li> Eutanasia cuccioli di topo con un CO 2 da camera per almeno 20 min. Lascia cuccioli sul ghiaccio fino a un&#39;ora fino dissezione. P0-P2 topi sono altamente raccomandati come cellule preparate da topi più anziani hanno ridotto la capacità di cellule progenitrici che si traduce in rendimenti inferiori ad innesto. Preparare un piatto di etanolo al 70% (per il passo 1.3) e tre piatti di soluzione di lavaggio (per la fase 3) quando è pronto per eseguire la dissezione la pelle. Scongelare Soluzione dispasi e lasciarlo a 4 ° C. Cervicale dislocate cuccioli dopo CO 2 sovraesposizione per garantire l&#39;eutanasia. </li><li> Mettere cuccioli eutanasia in una piastra di coltura su ghiaccio e trasferimento in una cappa a flusso sterile. </li><li> Lavare cuccioli con una breve immersione in etanolo al 70% e il luogo sul piatto di coltura sterile. </li></ol> 2. Staccare la pelle del mouse <ol><li> Tagliare ogni arto e coda, alla base del tronco con forbici sterili. </li><li> Afferrare il corpo saldamente tra una coppia di cupinze restano riservati e fa un incisione lungo la pelle dorsale dalla testa alla coda con un bisturi senza penetrare la fascia sottostante. </li><li> Attentamente staccare la pelle lontano dalla linea mediana del mouse. </li><li> Afferrare il mouse esposto saldamente con il lato lungo delle pinze curve e inserire un altro paio di pinze curve sotto la pelle all&#39;estremità posteriore del mouse e tirare delicatamente sulla pelle anche verso la metà ventrale del mouse. </li><li> Cura pelle a buccia completamente fuori il mouse con un movimento uniforme ed eliminare la carcassa. </li></ol> 3. Lavare la pelle e Incubare con la soluzione dispasi <ol><li> Posizionare la pelle nel primo piatto di soluzione di lavaggio con derma rivolto verso il basso. Stendere la pelle fuori e agitare con una pinza. Lascia la pelle nel primo piatto di soluzione di lavaggio, mentre la dissezione la pelle successivo. </li><li> Dopo aver posizionato la pelle successivo sezionato nel piatto prima soluzione di lavaggio, trasferire la pelle prima del secondo piatto di soluzione di lavaggio. Tenere pelli in the seconda soluzione di lavaggio fino a quando tutte le pelli sono raccolti. Trasferire tutte le pelli per il lavaggio finale, agitare brevemente. </li><li> Aggiungere 10 ml dispasi ghiacciata a una sterile da 10 centimetri piatto di cultura. Trasferire la pelle alla Soluzione dispasi e appiattire la pelle derma rivolto verso il basso. </li><li> Galleggiare pelle per 8-16 ore a 4 ° C (opzione alternativa: 1 ora a 37 ° C). </li></ol> 4. Derma separata Epidermide <ol><li> Trasferimento pelle per un nuovo piatto cultura sterile e appiattire la pelle derma rivolto verso il basso. Attentamente tenere premuto il derma da un angolo con un bisturi. </li><li> Afferrare l&#39;epidermide con una pinza e lentamente staccarsi dal derma. Dell&#39;epidermide deve staccarsi come un unico pezzo. L&#39;epidermide sarà bianca e finissima e il derma deve essere marrone, più spessa e gelatinosa. </li><li> Separare i due tessuti in tre diverse capsule di coltura sterili. <ol class="lalpha"><li> Per effettuare una dermico specifico gene knockdown / iperespressione innesto, prendere derma e tritare in pezzi molto piccoli con two bisturi. Eliminare epidermide. Il giorno di infezione (passo 7), sezionare un altro insieme di pelli di topo per preparare freschi, cellule non trattate epidermiche di combinare con le cellule dermiche lentivirale-infetti. </li><li> Per effettuare una epidermica specifico gene knockdown / iperespressione innesto, tagliare ogni epidermide in 6 - 8 pezzi più piccoli. Eliminare derma. Il giorno di infezione (passo 7), sezionare un altro insieme di pelli di topo per preparare freschi, cellule non trattate dermiche di combinare con cellule epidermiche lentivirale-infetti. </li></ol></li></ol> 5. Separa celle principale del mouse cutanee (MDC) dal tessuto macinate <ol><li> Dissociare MDCS incubando pezzi dermici con una soluzione di collagenasi appena fatta a 37 ° C per 1 ora. Utilizzare 10 ml di soluzione di collagenasi per topo cucciolo. </li><li> Mescolare delicatamente derma soluzione contenente ogni 10 min. Controllare il grado di dissociazione sotto un microscopio, la sospensione cellulare digerito deve essere principalmente cellule singole. La soluzione dovrebbe cambiare da chiaro a nuvoloso comecellule dermiche sono dissociate dal derma. </li><li> Aggiungere alla soluzione di collagenasi FBS contenente derma ad un volume finale di 10% per ridurre l&#39;attività della collagenasi. </li><li> Passare la sospensione cellulare attraverso un colino 70 micron cella in un nuovo tubo da 50 ml per la rimozione di grandi grumi non digeriti e follicoli interi. Aggiungere 10 ml di DMEM/10% FBS a 30 ml del flusso passante per diluire ulteriormente la collagenasi. </li><li> Provette contenenti derma digerito a 30 xg in una centrifuga da tavolo per 5 minuti per rimuovere ulteriormente follicoli interi. </li><li> Cura trasferire il supernatante in una nuova tubo da 50 ml. Pellet di cellule per centrifugazione a 200 xg in una centrifuga da tavolo per 5 min. </li><li> Risospendere le cellule con DMEM/10% FBS (1 ml per pup) e contare le cellule. Celle a piastre con Amniomax C-100 supporti per l&#39;infezione (punto 7), o da abbinare a lentivirus con infezione da KC per l&#39;innesto (punto 9). Rendimento tipico è di 20 x 10 6 cellule per cucciolo. </li></ol> 6. Dissociate cheratinociti primarias (KC) dal tessuto macinate <ol><li> Dissociare KC incubando pezzi epidermici con appena scongelati 0,05% tripsina-EDTA a 37 ° C per 15 min. Uso 7 ml di Tripsina-EDTA per topo cucciolo. </li><li> Delicatamente soluzione turbinio contenente epidermide ogni 5 min. </li><li> Aggiungere uguale volume di soluzione neutralizzante per Tripsina-EDTA contenente epidermide per ridurre l&#39;attività della tripsina. </li><li> Pellet di cellule per centrifugazione a 200 xg in una centrifuga da tavolo per 5 min. Rimanente tessuto non digerito deve galleggiare sulla parte superiore. </li><li> Versare con cautela fuori la maggior parte del surnatante con il tessuto non digerito. Rimuovere il surnatante rimanente con una pipetta 10 ml senza pellet inquietante. Risospendere il pellet di cellule con PBS. In KCs caso non sono completamente pellettizzati, travasare la maggior parte del surnatante e ripetere la centrifugazione fino maggior parte delle cellule sono in pellet. </li><li> Strain sospensione cellulare a 70 micron filtro cella in un nuovo tubo per rimuovere il tessuto rimanente o grumi. </li><li> Cellule pellet di centrifugazionea 200 xg in una centrifuga da tavolo per 5 min. </li><li> Risospendere le cellule in CnT-07 mezzi o PBS (1 ml per pup) e le cellule di conteggio. Utilizzare CNT-07 per le celle galvaniche per l&#39;infezione (punto 7), utilizzare PBS da abbinare a lentivirus-infetti MDCS per l&#39;innesto (punto 9). Rendimento tipico è di 3-10 x 10 6 cellule per cucciolo. </li></ol> 7. Infettare le cellule primarie con Lentivirus contenenti shRNA o cDNA Il giorno di infezione sezionare un altro set di pelli del mouse per preparare freschi, non trattati KC primarie o MDCS di combinare con cellule infettate da virus del giorno di innesto (punto 9). <ol><li><ol class="lalpha"><li> Per MDCS, piastra 4 x 10 6 MDCS per 10 cm di piastra con AmnioMAX-C100 media e incubare a 37 ° C + 5% di CO 2 per l&#39;infezione del giorno dopo alla densità cellulare del 50%. Piastre di solito 3-4 MDCS sono utilizzati per generare un innesto, e un totale di 10-12 piastre sono necessarie per generare tre innesti in un esperimento. In alternativa, lascia MDCS collegare e diffondere fo un minimo di 2 ore a 37 ° C + 5% di CO 2 ed eseguire infezione stesso giorno della placcatura cella. MDCS avrà fibroblasto-come morfologia. </li><li> Per KC, piastra 12 x 10 6 KC per 10 cm di piastra con CNT-07 media e incubare a 37 ° C + 5% di CO 2 per il giorno dopo l&#39;infezione. In alternativa, lasciate KC collegare e diffondere per un minimo di 2 ore a 37 ° C + 5% di CO 2 ed eseguire infezione nello stesso giorno. Piastre solitamente 3-4 di KC sono utilizzati per generare un innesto. Un totale di 10-12 piastre sono necessarie per generare tre innesti per un esperimento. KC avrà morfologia ciottoli. </li></ol></li><li> Preincubare cellule per 5-10 min con 8 mg / ml Polybrene soluzione a 37 ° C + 5% di CO 2. </li><li> Borsa media e aggiungere lentivirus + 8 mg / ml Soluzione Polybrene. Titolo lentivirale varierà a seconda del costrutto usato e deve essere determinato prima dell&#39;infezione. </li><li> Centrifugare le piastre a 200 xg in una centrifuga da tavolo per 1 ora a 32 °, C per infettare le cellule con lentivirus. </li><li> Rimuovere lentivirus contenenti media e aggiungere mezzi freschi. Per KC, lavare le cellule una volta con PBS prima di aggiungere indietro mezzi freschi. Cellule infettate solito recuperare notte a 37 ° C + 5% di CO 2. In alternativa, consentire almeno due ore di recupero a 37 ° C + 5% CO 2 prima trypsinizing le cellule per innesti. Continuano a cultura una piccola porzione di cellule infette per controllare l&#39;efficienza dell&#39;infezione come descritto nella sezione rappresentativa Risultati. </li></ol> 8. Preparare cellule infette per l&#39;innesto <ol><li> Isolare freschi MDCS primari o KCS da pelle con passi 4-6. Risospendere le cellule in ghiaccio freddo PBS sterile. Contare le cellule. </li><li><ol class="lalpha"><li> Per dermico specifico gene knockdown / iperespressione graft, dissociare MDCS infetti da lastre con 0,05% tripsina-EDTA a 37 ° C per 8 min. </li><li> Per epidermica specifico gene knockdown / iperespressione del trapianto, si dissociano KC infetti da piastre USIng 0,125% tripsina-EDTA a 37 ° C per 15 min. </li></ol></li><li> Neutralizzare attività tripsina con FBS DMEM + 10% (MDC) o una soluzione neutralizzante (KC). Trasferire le cellule tripsinizzate una provetta da 50 ml. </li><li> Pellet di cellule per centrifugazione a 200 xg in una centrifuga da tavolo per 5 min. </li><li> Risospendere le cellule in ghiaccio freddo PBS sterile. Contare le cellule. </li><li> Combinare le cellule infettate dal virus, con il tipo di cellule non trattate appena preparata controparte. Per un innesto, combinare 7-10 x 10 6 MDCS con 7-10 x 10 6 KCs in PBS sterile ghiacciata e il pellet cellulare slurry in una centrifuga da tavolo a 4 ° C. Risospendere le cellule in 50 microlitri ghiacciata -100 PBS sterile. Mantenere le cellule in ghiaccio fino al nu / nu camere del mouse sono pronti. </li></ol> 9. Creare letto della ferita e della Camera Fix su &#39;Indietro&#39; del nu / nu mouse Un giorno prima dell&#39;innesto, sterilizzare strumenti chirurgici con le camere di silicio autoclave e sterile da immersione in etanolo al 70%. Sostituire il etano 70%nol con PBS sterile prima di utilizzare le camere. <ol><li> Anesthetize nu / nu topo (7-12 settimane di età femmine) con ketamina (8 mg / ml) / xilazina (1,6 mg / ml) mediante iniezione intraperitoneale (100 μl/10 g di peso corporeo) o altro metodo preferito. Applicare lubrificante occhio. Luogo piastra elettrica sotto il mouse. </li><li> Disinfettare nuda pelle di nuovo mouse con iodio e pulire con salviettine imbevute di alcool. </li><li> Aggiungere 1-3 gocce di 0,25% Bupivicaine al sito di incisione per via topica. Stringere la nuda pelle indietro del mouse alla base del collo con una pinza. </li><li> Tagliare un piccolo foro circolare (~ 1 cm di diametro) in pelle sollevata con le forbici sterili. </li><li> Posizionare camera sterile sul letto della ferita e coprire i bordi da camera con cute circostante. </li><li> Camera di sicuro in posizione con suture lungo spigoli camera (6 punti per camera) come mostrato nella Figura 2A. </li><li> Quando le camere sono pronte, delicatamente cellule liquami turbinio e redige in 23 ago attaccato ad una siringa da 1 ml. Se slurry cella è condensata in basso, delicatamenterisospendere con 1 ml di punta della pipetta prima di disegnare nell&#39;ago. </li><li> Camera di puntura con l&#39;ago e lentamente gocciolare cellule su ferita. </li><li> Luogo topi in gabbie pulite, autoclave. Casa 2 topi per gabbia e aggiungere antibiotici e Tylenol (3 mg / ml) per le acque potabili. Nella nostra esperienza, due topi femmina per gabbia non hanno portato a un trauma negativo alla camera, innesto, o animali. </li><li> Mettere pad riscaldamento meno della metà della gabbia e osservare topi fino anestesia svanisce. </li></ol> 10. Rimuovere Camera dopo 7-9 giorni <ol><li> Anestetizzare chambered nu / nu topo come al punto 9.1. Applicare lubrificante occhio. </li><li> Disinfettare la pelle intorno a camera con iodio e pulire con salviettine imbevute di alcool. </li><li> Tagliare con cautela punti e rimuovere dalla camera. </li><li> Rimuovere delicatamente da camera del mouse. Se i nuovi bastoni trapianto cutaneo alla camera, sollevare una parte della camera e innesto delicatamente separato dalla camera con l&#39;pinze. Tenere premuto innesto durante la rimozione della camera. Graft dovrebbe look noioso e opaco come nella figura 2B. </li><li> Applicare un non aderente pad con un sottile strato di antibiotici sulla ferita aperta e sutura in posizione (2 punti). </li><li> Avvolgere benda intorno mouse per fissare il pad e proteggere la ferita. Suturare fasciatura in posizione. </li><li> Le camere vengono pulite di silicio con il lavaggio con sapone neutro e risciacquate con acqua deionizzata. Mettere a bagno le camere in etanolo 70% durante la notte, aria secca, e conservare. </li></ol> 11. Esaminare il mouse per la crescita dei capelli <ol><li> Rimuovere bende e pad dopo 3 giorni di camera di rimozione. Innesto deve essere asciutto e opaco a marrone. </li><li> Controllare periodicamente i topi per la crescita dei capelli. Capelli dovrebbe iniziare a mostrare a 16 giorni dopo l&#39;innesto. </li></ol> Procedura Outline 1 ° giorno (2-3 ore): Sacrificio cuccioli appena nati, togliere la pelle, e lasciare in posa dispasi a 4 ° C per una notte. 2 ° giorno (2-3 ore): Isolare cellule primarie da pelle epiastra a densità raccomandata. 3 ° giorno (3-4 ore): infettare le cellule con lentivirus. Togliere la pelle di un altro gruppo di cuccioli appena nati e lasciare in posa dispasi a 4 ° C per una notte. 4 ° giorno (6-8 ore): Isolare cellule primarie di pelle, contare, e lasciare sul ghiaccio. Recuperare lentivirus cellule infettate da tripsinizzazione e centrifugazione, contare, e combinare 7-10 x 10 6 cellule del derma e cheratinociti in 50-100 ml di PBS per trapianto. Crea letto della ferita al passaggio del mouse, collegare da camera, e si applicano miscela cellulare al letto della ferita. Procedura alternativa Contorni Contorni procedura alternativa si riduce la procedura da quattro giorni a tre. <ol><li> Combinare giorni 1 e 2 trattando pelli topo in dispasi a 37 ° C per un&#39;ora (hr tempo stimato 5-7). </li><li> Combina il Day 2 e Day 3 infettando le cellule con lentivirus dopo che le cellule placcatura per due ore (h tempo stimato 5-7). </li></ol>

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Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Saggi di ricostituzione dei capelli fornire un unico modello di rigenerazione degli organi per l&#39;esame il meccanismo di formazione de novo follicolo pilifero. Qui, descriviamo una versione modificata del test di capelli camera utile per determinare la funzione dei geni nella formazione del follicolo pilifero. La nostra analisi si basa sul dosaggio riportato ricostituzione capelli camera 5, 6,11, che abbiamo modificato per introdurre una tecnica per ottenere un&#39;espressione lentivirale sovraespressione del gene knockdown o in entrambi i tipi di cellule dermiche o epidermica. Il nostro saggio fornisce una rapida alternativa a generare tessuto-specifica knockout genetico. Questa analisi ci permette di dimostrare la funzione dei geni nella formazione del follicolo dei capelli in meno di tre settimane dalla infettare le cellule primarie con lentivirus alla raccolta innesto. La nostra analisi può essere estesa ad affrontare interazioni genetiche usando combinazione shRNA / consegna cDNA da lentivirus in un tipo cellulare 12, nonché permette di esaminare segnalazione tra il tip cellula epidermica e dermicaes. La nostra analisi dei capelli è più adatto per la rilevazione di forti fenotipi-guadagno o la perdita di funzione nella rigenerazione del follicolo, mentre i difetti sottili sono più difficili da osservare. Abbiamo dimostrato con successo per via cutanea specifica funzione genica di alcuni geni che utilizzano il nostro saggio rigenerazione dei capelli 1,12. Basato sul marcatore GFP co-espressa dal vettore lentivirus esprimere shRNA 10, abbiamo dimostrato che la esprimono shRNA cellule donatrici dermiche persistito negli innesti capelli rigenerati. GFP-positive cellule erano presenti nella papilla dermica (DP) dei follicoli piliferi rigenerate (Figura 3). Le cellule DP probabilmente costituito da diversi livelli di knockdown gene come cellule espresso diversi livelli di GFP, quindi il fenotipo osservato follicolo pilifero è una gamma di genetica hypomorph a null. Un miglioramento di questo saggio sarà quello di stabilire una selezione veloce ed efficiente per le cellule che esprimono alti shRNA prima Grafting come usando FACS per purificare forti GFP-esprimenti cellule. Un&#39;alternativa è quella di sostituire le cellule knockout mutante o condizionato in questo dosaggio 9. D&#39;altra parte, un sistema di coltura che può preservare la funzione delle cellule DP è molto utile come potenza DP è gradualmente persa una volta che le cellule dermiche primarie sono diversi passaggi. Sistemi di coltura potenziali includono l&#39;uso di biomateriali derivati ​​da colture di nicchia artificiale o di aggregazione 2,7,8,13. Un altro miglioramento sarà generare un affidabile epidermica metodo di congelamento delle cellule con un alto tasso di recupero delle cellule, che riducono l&#39;uso della seconda serie di cuccioli di topo (passo 7) per generare cheratinociti freschi in dermico specifico perdita o guadagno di funzione studi. Questo saggio camera capelli follicolo produce densità dei capelli e di qualità simile alla pelle normale mouse, anche se la crescita dei capelli è un po &#39;meno sincronizzato e l&#39;orientamento follicolo è più casuale. A poche limitazioni del saggio rigenerazione dei capelli genetica come il requisito della grande quantità di lentivirus e numero di cellule, ed è molto laboriosa in termini di metodi chirurgici rispetto ad altre forme di saggi capelli ricostituzione come il cerotto e saggi patta 3,4,14. Tuttavia, la qualità dei follicoli piliferi e calendario per rilevare la crescita dei capelli è superiore ad altri test 4. Il nostro obiettivo saggio rigenerazione dei capelli fornisce un compagno veloce e conveniente esistenti modelli genetici.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome </td><td> Azienda </td><td> Catalogare # </td><td> Commenti </td></tr><tr><td> PBS </td><td> Invitrogen </td><td> 14190-144 </td><td></td></tr><tr><td> HBSS </td><td> Invitrogen </td><td> 14170-122 </td><td></td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Invitrogen </td><td> 11995-065 </td><td></td></tr><tr><td> 0,25% tripsina-EDTA </td><td> Invitrogen </td><td> 25200-056 </td><td></td></tr><tr><td> Cnt-07 </td><td> Cella N Tec </td><td> CnT-07 </td><td></td></tr><tr><td> AminoMAX-C100 </td><td> Invitrogen </td><td> 17001-074 </td><td></td></tr><tr><td> AminoMAX-C100 Supplemento </td><td> Invitrogen </td><td> 12556-015 </td><td></td></tr><tr><td> FBS </td><td> Invitrogen </td><td> 26140-079 </td><td></td></tr><tr><td> Penicillina / streptomicina </td><td> Invitrogen </td><td> 15140-122 </td><td></td></tr><tr><td> Fungizone </td><td> Invitrogen </td><td> 15290-018 </td><td></td></tr><tr><td> Gentamicina </td><td> Invitrogen </td><td> 15710-064 </td><td></td></tr><tr><td> Dispasi </td><td> Roche </td><td> 4942078001 </td><td></td></tr><tr><td> Collagenasi, tipo 1 </td><td> Sigma </td><td> C-0130 </td><td></td></tr><tr><td> Polibrene </td><td> Sigma </td><td> 107689-10G </td><td></td></tr><tr><td> Tissue cultura piatto </td><td> Fisher Scientific </td><td> 08-772E </td><td></td></tr><tr><td> Forbici per dissezione </td><td> Fisher Scientific </td><td> 11-999 </td><td></td></tr><tr><td> Forcipe </td><td> Fisher Scientific </td><td> 10-275 </td><td> curvo </td></tr><tr><td> Scalpal </td><td> Medex alimentazione </td><td> GRF-2975 # 10 </td><td> Dimensione n. 10 </td></tr><tr><td> 70 pm coloratore cella </td><td> VWR </td><td> 21008-952 </td><td></td></tr><tr><td> 15 ml tubo da centrifuga conica </td><td> Fisher Scientific </td><td> 14-959-49D </td><td></td></tr><tr><td> Tamponi imbevuti di alcool </td><td> Fisher Scientific </td><td> 1368063 </td><td></td></tr><tr><td> 23 gauge </td><td> Fisher Scientific </td><td> 14-821-13F </td><td></td></tr><tr><td> Eye lubrificante </td><td> CVS </td><td> 8883660 </td><td></td></tr><tr><td> Providone-Lodine tamponi </td><td> Fisher Scientific </td><td> NC0116841 </td><td></td></tr><tr><td> Silicon Chambers </td><td> Renner GmbH </td><td> F2U, 30268 </td><td></td></tr><tr><td> Suture </td><td> Acuderm </td><td> SUP3524 </td><td></td></tr><tr><td> Fasciatura flessibile </td><td> Fisher Scientific </td><html><td> 22-363-100 </td><td></td></tr><tr><td> Medicazione non aderente </td><td> Telfa </td><td> 1050 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Materiale </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Soluzione di lavaggio PBS 500 pg / ml di penicillina / streptomicina 12,5 ug / ml Fungizone 100 pg / ml di gentamicina Dispasi soluzione HBSS 2,5 mg / ml finale dispasi 100 pg / ml di gentamicina Supporti neutralizzanti HBSS 15% (v / v) FBS Collagenasi soluzione 0,25% (w / v) Collagenase, Tipo 1 ONTENUTO &quot;&gt; 100 pg / ml di penicillina / streptomicina 2,5 mcg / ml Fungizone 50 ug / ml di gentamicina Polibrene soluzione HBSS 8 mg / mL (w / v) Polybrene </td></tr></tbody></table>

rapida analisi genetica di epitelio-mesenchimale segnalazione durante la rigenerazione dei capelli

Rapid Genetic Analysis of Epithelial-Mesenchymal Signaling During Hair Regeneration

Morfogenesi follicolo dei capelli, un processo complesso che richiede l&#39;interazione tra epiteli derivati ​​cheratinociti e il mesenchima sottostante, è un sistema interessante modello per studiare lo sviluppo di organi e tessuto-specifica segnalazione. Anche se lo sviluppo del follicolo dei capelli è geneticamente trattabile, l&#39;analisi rapida e riproducibile di fattori essenziali per questo processo rimane una sfida. Qui si descrive una procedura per generare sovraespressione mirati o shRNA-mediata knockdown di fattori usando lentivirus in un tessuto-specifica. Utilizzando una versione modificata di un modello di rigenerazione dei capelli 5, 6, 11, possiamo ottenere robusta guadagno o perdita di funzione di analisi in cheratinociti primari di topo o cellule dermiche di facilitare lo studio delle vie di segnalazione epiteliali mesenchimali che portano alla morfogenesi follicolo pilifero . Si descrive come isolare nuovi cheratinociti primari di topo e cellule cutanee, che contengono cellule della papilla dermica e dei loro precursori, consegnare lentivirus conteNing sia shRNA cDNA o ad una delle popolazioni cellulari, e combinare le cellule per generare follicoli piliferi completamente formate sul dorso dei topi nudi. Questo approccio permette l&#39;analisi del tessuto-specifici fattori necessari per generare follicoli dei capelli entro tre settimane e fornisce un compagno veloce e conveniente alle esistenti modelli genetici.

Nella figura 1 si mostra il risultato di dermo-specifica knockdown shRNA particelle lentivirali di levigato (Smo), un componente critico Shh di segnalazione, in un innesto di 3 settimana fa i capelli rigenerativa. Innesti di controllo che utilizzano vettori lentivirali da solo mostra una forte crescita dei capelli (Figura 1A). Per contro, dermo-specifica knockdown dei risultati SMO nella perdita della crescita (figura 1B). Ematossilina ed eosina raffigura la fase di follicoli piliferi di controllo e le condizioni sperimentali (Figura 1C, D). Il fenotipo crescita dei capelli da trattamenti simili può essere variabile tra esperimenti, tra cui il controllo positivo con l&#39;infezione da vettori lentivirali da solo. Innesti di controllo positivi pertanto devono sempre essere inclusi in ogni esperimento come riferimento il 30% di innesti può fallire a causa di cicatrici o fissaggio di innesti incompleta. In caso di verifica un&#39;interazione tra due fattori come overexpressing cDNA di un fattore di riSCUE shRNA-mediata knockdown di un altro fattore, si dovrebbe sempre includere innesti atterramento solo per manifestare la perdita-di-funzione di risultato in ogni esperimento. Ciò fornirà la copertura necessaria per determinare come un particolare gene perturba il follicolo dei capelli percorso di rigenerazione e di come due geni interagiscono. La rimozione della camera (Figura 2A) deve essere fatto con cura. L&#39;innesto di nuova formazione dovrebbe essere leggermente opaco con una superficie opaca (Figura 2B). L&#39;innesto può aderire alla camera, così sollevando delicatamente un lato è importante assicurarsi che l&#39;innesto rimane attaccata al letto della ferita. L&#39;innesto è abbastanza stabile dopo tre giorni e dovrebbe presentare poche difficoltà quando si rimuove la medicazione. La crescita dei capelli robusta deve osservare dopo tre settimane (Figura 2C). Omettendo sia MDCS o KCS si tradurrà in un sito di ferita recuperato senza capelli (Figura 2D) 11. Cellule morte o perdita di cellule in uno deitipi cellulari comporta anche senza capelli, in contrasto con la rigenerazione dei capelli ridotta in dermo-Smo knockdown come mostrato in figura 1B. Per assicurare un dosaggio efficace, è fondamentale per ottenere maggiore del 90% infezione virale delle cellule con sovraespressione appropriato o efficienza knockdown prima dell&#39;innesto. A causa dei limiti di tempo della procedura di innesto, si consiglia di problemi di efficienza di scatto infezioni virali prima di iniziare un esperimento di innesto, e salvare sempre una piccola porzione di cellule il giorno di un innesto procedura per verificare la perdita o il guadagno-di-espressione. Titolo lentivirale varierà a seconda del costrutto usato e deve essere determinato prima dell&#39;infezione a raggiungere 90-100% di efficienza. Monitoriamo efficienza infezione virale con GFP coexpressed dal vettori lentivirali. Abbiamo routine effettuare PCR quantitativa e / o Western blot per determinare l&#39;entità del knockdown o sovraespressione. Utilizzando dual-vettori di espressione con tag fluorescenti di etichettarecellule infettate da virus fornisce un modo per segnalare perdurance di segnale e il numero di cellule che esprimono costrutti in nostri innesti maturi. Usiamo GFP guidata da un promotore CMV dal vettore lentivirale pSicoR-CMV-GFP 10 in combinazione con Smo shRNA. In figura 3, si mostra a 3 settimana fa dermo-specifico innesto in cui GFP è lentivirally-espresso in papilla dermica di un follicolo pilifero rappresentante. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/4344/4344fig1.jpg" /> Figura 1. L&#39;analisi istologica di crescita dei capelli follicolo. (A) Veduta di rigenerazione dei capelli trapianto di controllo con cellule del derma infettate con vettori lentivirali vuoto e cheratinociti non trattati. (B) atterramento Smoothened con shRNA particelle lentivirali in cellule del derma in combinazione con cheratinociti non trattati risultati in perdita di follicoli piliferi. (C) e la colorazione ematossilina eosina mostra f capelli anagenollicles in innesti di controllo si estendono verso il basso nel derma e (D) levigato follicoli piliferi atterramento rimangono stentata e in gran parte assente. Tutte le immagini sono tre settimane dopo l&#39;innesto. Bar Scala denota 100 micron. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/4344/4344fig2.jpg" /> Figura 2. Innesto cellule primarie. (A) nu / nu mouse con suturate camera di alloggiamento pile derma e cheratinociti. (B) la rimozione della camera espone neonata pelle che è noioso e opaco nel carattere. (C) peli completamente coltivati ​​a innesto con wild- tipo primario cellule del derma e cheratinociti a tre settimane dopo l&#39;innesto. (D) aggiunta di primarie cellule del derma senza cheratinociti porta a senza capelli dopo tre settimane. Risultati simili sono visti con aggiunta di cheratinociti primari senza cellule dermiche. Figura 3. Manutenzione di espressione GFP in papilla dermica. Immagini confocali di papilla dermica da un 3 settimane innesto vecchio rigenerato. GFP è stato espresso nella popolazione cellulare dermica da un vettore lentivirale e rilevato nella papilla dermica (verde). Versicano (rosso) delimita la papilla dermica e nuclei erano etichetta con Hoechst (blu). GFP nota è espressa specificamente in cellule dermiche, ma non nei cheratinociti circostanti. Bar Scala denota 20 pm.

Tessuto-specifica analisi di un modello di rigenerazione del follicolo usando lentivirus mediare guadagno o perdita di funzione.

Rapida analisi genetica di epitelio-mesenchimale segnalazione durante la rigenerazione dei capelli

La morfogenesi del follicolo pilifero, un processo complesso che richiede l'interazione tra i cheratinociti derivati dall'epitelio e il mesenchima sottostante, è un...

L'obiettivo generale di questa procedura è studiare le funzioni specifiche dei tessuti nei percorsi di segnalazione fondamentali per la formazione dei follicoli piliferi. Questo viene raggiunto isolando innanzitutto cellule dermiche ed epidermiche primarie da topi neonati. Successivamente, l'espressione genica viene modificata infettando le cellule primarie con lentivirus.Il terzo passaggio consiste nell'unire le popolazioni cellulari epidermiche e dermiche in camere fissate a un letto di ferita su un topo nudo. Il trapianto viene quindi monitorato per la crescita dei peli. Infine, l'effetto della manipolazione genica sulla formazione dei follicoli piliferi può essere valutato visivamente e mediante colorazione istologica del sito del trapianto.Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come il modello murino nacale, è che il trapianto può essere completato in tre settimane. Questo metodo può rispondere a domande fondamentali nel campo della biologia dello sviluppo, ad esempio in che modo fattori presenti in un tessuto possono influenzare la segnalazione e la funzione in un altro tessuto. Abbiamo avuto per la prima volta l'idea di questo metodo quando volevamo analizzare le funzioni specifiche dei tessuti delle molecole di rivestimento nella formazione del follicolo pilifero, dopo aver lavato un topo che era stato soppresso per asfissia.Recidere ogni arto e la coda alla base del tronco con forbici sterili. Successivamente, afferrare saldamente il corpo tra un paio di pinze curve ed effettuare un'incisione lungo la pelle dorsale dalla testa alla coda utilizzando un bisturi. Non penetrare la fascia sottostante.Ora, rimuovere con attenzione la pelle lungo la linea mediana del topo. Afferrare saldamente il topo esposto con il lato lungo delle pinzette curve ed inserire un'altra coppia di pinzette curve al di sotto della pelle all'estremit&agrave; posteriore del topo. A questo punto, staccare con cura la pelle completamente dal topo con un unico movimento fluido e scartare la carcassa.Posizionare la pelle nel primo contenitore con la soluzione di lavaggio, con il lato dermico rivolto verso il basso. Stendere la pelle nella soluzione e agitarla con la pinzetta. Lasciare quindi la pelle nella soluzione di lavaggio mentre si procede alla dissezione della pelle successiva.Dopo aver posizionato il successivo pezzo di pelle dissezionato nel primo contenitore con soluzione di lavaggio, trasferire il pezzo precedente nel secondo contenitore con soluzione di lavaggio. Mantenere i pezzi di pelle nella seconda soluzione di lavaggio fino a quando non sono stati raccolti tutti i campioni. Dopo l'ultimo lavaggio, trasferire fino a cinque pezzi di pelle in un contenitore contenente soluzione di disbe fredda.Stendere le pelli con il lato dermico verso il basso e lasciarle galleggiare per otto-sedici ore a quattro gradi Celsius. Trasferire una pelle dai bagni freddi a una nuova piastra. Stenderla con il lato dermico verso il basso.Afferrare l'epidermide con una pinzetta ed estrarla lentamente dal derma. L'epidermide dovrebbe staccarsi in un unico pezzo, sarà bianca e sottile, mentre il derma apparirà marroncino, più spesso e gelatinoso. Separare i due tessuti in piatti di coltura distinti per iniziare l'isolamento cellulare.Per isolare le cellule dermiche, tritare il derma in pezzi molto piccoli con due bisturi. Incubare il tessuto dermico tritato con una soluzione di collaghenasi appena preparata a 37 gradi Celsius per un'ora, agitando delicatamente la miscela cellulare ogni 10 minuti; al termine della digestione, completare l'operazione.La sospensione dovrebbe essere composta principalmente da cellule singole e la soluzione dovrebbe essere diventata torbida da limpida. Aggiungere ora il 10% in volume di FBS alla sospensione cellulare. Farle passare attraverso un filtro cellulare da 70 micron in provette da 50 millilitri.Raccogliere fino a 30 millilitri di flusso attraverso per provetta. Proseguire con l'isolamento delle cellule dermiche secondo il protocollo scritto. Per isolare i cheratinociti, tagliare ciascun epidermide in sei a otto pezzi più piccoli.Incubare il tessuto tagliato con tripsina EDTA 0,05% appena scongelata a 37 gradi Celsius per 15 minuti. Proseguire con l'isolamento dei cheratinociti secondo il protocollo scritto, anestetizzare un topo nudo femmina di sette-dodici settimane utilizzando chetamina e xilazina o un metodo preferito. Assicurarsi di applicare un lubrificante oculare e posizionare il topo su un tappetino riscaldante.Ora disinfettare la cute dorsale con iodio, seguito da tamponi alcolici. Utilizzando una pinza, afferrare la cute alla base del collo e praticare un foro di un centimetro di diametro nella cute pinzata. Posizionare la camera sul letto della ferita e coprire i bordi della camera con la cute circostante.Fissare la camera con circa sei punti di sutura. Attaccare una sola camera per topo, lungo i suoi bordi. Una volta fissata la camera, verificare il sospensione cellulare. Se le cellule si sono concentrate sul fondo, risospendere delicatamente con una punta da pipetta da un millilitro.Ora ruotare delicatamente la sospensione cellulare e aspirarla in un ago da 23 gauge collegato a una siringa da un millilitro. Forare ogni camera con l'ago e lasciare gocciolare lentamente nel sito della ferita le cellule sospese in PBS. Quando i topi si saranno ripresi dall'anestesia, posizionarli in gabbie sterili, due per gabbia.Assicurarsi di somministrare antibiotici e Tylenol tramite l'acqua da bere. Dopo sette-nove giorni, anestetizzare il topo nudo trattato come fatto in precedenza. Disinfettare la pelle intorno alla camera con iodio e pulirla con tamponi alcolici.Tagliare con attenzione i punti e rimuoverli dalla camera. Rimuovere delicatamente la camera se la nuova pelle vi aderisce. Separare delicatamente l'innesto dalla camera.Utilizzando una pinzetta, tenere premuto il trapianto. Durante la rimozione della camera, il trapianto dovrebbe apparire opaco e senza lucentezza. Applicare una medicazione non aderente con un sottile strato di antibiotico sulla ferita aperta e fissarla con punti di sutura utilizzando due punti.Avvolgere una benda attorno al topo per fissare il tampone e proteggere la ferita. Suturare la benda in posizione. Dopo tre giorni, rimuovere le bende e il tampone. Non è necessario anestetizzare il topo durante questo passaggio.L'innesto deve essere secco e di colore opaco fino a marrone. Controllare periodicamente l'innesto per la crescita dei peli, che dovrebbe iniziare a manifestarsi 16 giorni dopo l'innesto. È stato realizzato un silenziamento specifico del gene smoothened nelle cellule dermiche isolate, un componente fondamentale della via di segnalazione sonic hedgehog.Queste cellule sono state applicate a innesti per la ricostituzione del follicolo pilifero seguendo il protocollo descritto. Dopo tre settimane di crescita, gli innesti di controllo positivo con solo vettore lentivirale hanno mostrato una crescita robusta dei capelli. Tuttavia, la riduzione dell'espressione del gene smoothened ha determinato una marcata riduzione della crescita del pelo.Gli innesti di controllo negativo, in cui venivano omessi o i fibroblasti dermici primari o i cheratinociti, hanno portato a un sito di ferita riparato senza alcun pelo. Analogamente, la morte cellulare o la perdita di uno dei tipi cellulari nell'innesto ha comportato l'assenza di crescita del pelo. Si è determinato che il vettore lentivirale aveva una buona efficienza di infezione prima dell'esperimento di innesto, ed era inoltre progettato per produrre GFP insieme a questa proteina Smoothened, S-H-R-N-A.Quindi, l'osservazione della papilla dermica dei follicoli piliferi mediante ottiche a fluorescenza ha rappresentato un controllo utile per confermare la durata dell'espressione lentivirale. Dopo tre settimane, la colorazione H e d viene utilizzata per mostrare la fase di crescita dei follicoli piliferi nel trapianto di controllo e la loro fase di sviluppo ritardata in seguito all'abbassamento dell'espressione di smoothened. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in 14 ore nell'arco di tre giorni, se effettuata correttamente. Questa tecnica può essere estesa per esplorare la relazione tra tumore e stroma durante la progressione del cancro nel campo della biologia del cancro.Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come studiare la funzione genica nella formazione del follicolo pilifero. Utilizza il nostro saggio rapido di ricostituzione del pelo come alternativa ai tradizionali knockout genetici.

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