Name: Lavaggio broncoalveolare (BAL) di ricerca; ottenere unadeguata Yield Esempio (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-03-24T19:45:00.000+00:00
Duration: 11 min 47 s
Description: Impara la tecnica di broncoaspirato lavaggio con aspirazione manuale a bassa pressione per raccogliere cellule immunitarie polmonari in sicurezza. Questo metodo preserva la vitalità cellulare per l'analisi in vitro.

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Grazie a Elena Mitsi (Assistente di ricerca) e suor Carole Hancock (infermiere Research) e personale del teatro per il loro contributo alla ripresa, e David Shaw (infermiere ricerca) per il suo supporto con i nostri broncoscopie di ricerca. Grazie anche al nostro volontario Rebecca Dunphy per consentire a questa procedura per essere girato.

1. I soggetti sono accolti all&#39;arrivo dal Nurse Research respiratoria <ol><li> L&#39;argomento è stato a digiuno per&gt; 4 ore per il cibo solido e 2 ore per liquidi chiari 1. </li><li> La procedura viene eseguita come un caso al giorno con gli opportuni controlli pre-e post-procedura (come da politica ospedaliera standard). </li><li> Il soggetto indossa un camice. </li><li> Una piccola cannula calibro viene inserito (idealmente in mano sinistra) e rimane in situ fino al termine del periodo di recupero post-procedura 1. </li><li> Osservazioni Preprocedure sono prese (pressione arteriosa, frequenza cardiaca, saturazione dell&#39;ossigeno [SATs]). </li><li> Il soggetto viene trasferito alla suite broncoscopia. </li></ol> 2. Il soggetto è preparato per la Procedura nella Suite da una ricerca Clinico respiratoria Esperto in broncoscopia <ol><li> Apparecchiature di monitoraggio è fissato tra cui: 3 derivazioni, pulsossimetro 1,10 e sfigmomanometro. AnesteticiSupporto ic non è necessario compreso il consenso informato scritto. </li><li> L&#39;ossigeno può essere distribuito mediante cannula nasale fino a 4 L / min, per ottenere SATs&gt; 90% 1. </li><li> L&#39;operatore controlla il broncoscopio, questo include la garanzia di aspirazione efficace aspirando soluzione fisiologica sterile. </li><li> Anestesia topica con lidocaina è raggiunto nei passaggi nasali (utilizzando Instillagel 1) e la mucosa orale (usando xylocaina) </li><li> Se la sedazione è appropriato e richiesto dal soggetto, midazolam per via endovenosa è somministrato 1. Un agente di inversione del caso (flumazenil) è immediatamente disponibile. </li><li> Attrezzature per la rianimazione devono essere prontamente disponibili 1,10. </li></ol> 3. Il broncoscopio è inserita e posizionata <ol><li> Intubazione è di solito tramite il naso. Se questo non è possibile a causa di polipi nasali, turbinati infiammate, o qualsiasi disagio allora il soggetto è intubato attraverso la bocca (un paradenti è usato per preveniredanneggiare la portata o denti del soggetto). </li><li> Anestesia topica alla laringe viene completata usando 4% lidocaina, di solito viene utilizzato un totale di 4-6 ml. Comunemente questo provoca tosse su instillazione. </li><li> Le corde vocali sono passati, ed ulteriori anestesia delle mucose con 2 ml di lidocaina al 2% alla carena, alla divisione del lobo inferiore destro (RLL) e del lobo medio destro (RML) e all&#39;ingresso RML. </li><li> Il broncoscopio è posizionato all&#39;interno della RML, idealmente nel segmento mediale, in una posizione in cui è sufficiente essere in una posizione sicura distale ma non troppo distale in modo che il collasso delle vie aeree quando si aspira (&#39;test Wink&#39; utilizzando il pulsante aspirazione ). </li><li> Buon posizionamento è indicato durante la prova wink da un broncoscopio che può essere completamente mantenuta in posizione dal broncoscopista e una via aerea che non fa chiudere completamente immediatamente aspirazione delicata. </li></ol> 4. Il BAL viene eseguito <ol><li> Quattro 60 ml siringhe preriempito con soluzione salina riscaldata - 60 ml, 50 ml, 50 ml e 40 ml in siringhe successive. Quando il soggetto e broncoscopista sono pronti prima siringa di soluzione salina viene instillata dall&#39;assistente broncoscopia mentre il broncoscopista mantiene la posizione nella RML. </li><li> Aspirazione mano delicata viene quindi eseguita l&#39;assistente utilizzando la stessa porta e 50 ml siringa. </li><li> Questa procedura viene poi ripetuta un ulteriore 3x, con un volume massimo di 200 ml utilizzati nella nostra tecnica specifica. </li><li> Il fluido BAL recuperato viene espulso delicatamente in contenitori etichettati già svoltasi il ghiaccio in fusione. Contenitori di vetro possono essere presiliconized per inibire l&#39;adesione cellulare e massimizzare il rendimento cella. </li><li> Il fluido BAL appare nebuloso contro la luce con superficie le bolle di sapone formati da tensioattivi. </li><li> Il broncoscopio sta lentamente completamente ritirata. </li><li> Il BAL viene trasportato immediatamente in ghiaccio per l&#39;elaborazione immediata. </li></ol> 5. Oggetto Recovery </p&gt; <ol><li> Il soggetto viene recuperato per 2-4 ore dalla nutrice di ricerca respiratorio in un reparto. </li><li> Durante questo periodo essi sono autorizzati a riposare e poi solo mangiare e bere&gt; 60 min 1 dopo la procedura (quando la loro rondine è valutato come sicuro), al fine di ridurre il rischio di aspirazione. </li><li> Osservazioni post procedurali sono monitorati e registrati. Un esame clinico si verifica prima della dimissione. </li><li> Il soggetto è informato pre-dimissione circa gli effetti collaterali più comuni (febbre, mite destra sottomammario dolore al petto, mal di gola) e dato un numero da contattare in caso di significativi effetti collaterali si verificano 1. </li><li> Il soggetto è un follow-up a 1-5 giorni post-procedura con un contatto clinico. Questo può essere sia per telefono o di persona. </li></ol> 6. Le cellule sono isolati in laboratorio - Eseguire su Melting Ice Dove Possibile <ol><li> Il volume di fluido BAL è registrato e filtrato attraverso un doppio strato di garza sterile tamponeper rimuovere i tappi di muco in prechilled, sterili provette da 50 ml centrifuga. </li><li> Le cellule vengono pellettizzate per centrifugazione a 500 xg a 4 ° C per 5-10 minuti e lavate vortex in 50 ml di soluzione fisiologica fredda. La centrifugazione viene ripetuto una volta. </li><li> Le cellule sono risospese in terreno di coltura (RPMI-1640 + siero bovino fetale al 10% + 2 mM L-glutammina + penicillina [40 UI / ml], streptomicina [75 UI / ml], e amfotericina B [0,5 UI / ml]) e conteggio differenziale effettuato con un volume uguale di trypan blu e un emocitometro. </li><li> La sospensione cellulare è normalizzata alla densità richiesta (usiamo 1 x 10 6 cellule / ml), introdotto pipettando nella opportune piastre di coltura tissutale, e incubate a 37 ° C per 3 ore per consentire macrofagi aderenza. 1 ml di questa sospensione di cellule per pozzetto è appropriato per piastre di coltura da 24 pozzetti. </li><li> Per il lavoro linfociti, dopo 3 ore di incubazione, il mezzo di coltura viene delicatamente pipettati su e giù 3x, e raccolto. Questo mezzo contiene linfocitie macrofagi non aderenti e può essere utilizzato per valutare la funzione dei linfociti, ma può essere utilizzato anche in fasi di purificazione ad esempio con CD14 biglie magnetiche per rimuovere i macrofagi. </li><li> Per lavoro macrofagi, dopo 3 h di incubazione, il mezzo viene accuratamente rimosso con pipettaggio minimo e sostituito con fresco, medio caldo senza antibiotici (RPMI 1640 + 10% siero fetale bovino + 2 mM L-glutammina). I macrofagi sono aderenti alla piastra di coltura tissutale (vedi Figura 1). </li></ol>

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</ol>

Andrea M. Collins è finanziato dalla Bill e Melinda Gates Foundation, e nessun potenziale conflitto di interessi. Ha ricevuto fondi dalla Merck (MSD) e GSK per partecipare a conferenze e le tasse universitarie. 50 Bals di ricerca svolte in modo indipendente. Jamie Rylance è finanziato dal Wellcome Trust, e non ha alcun conflitto di interessi. Egli non ha ricevuto altri fondi. 70 Bals di ricerca svolte in modo indipendente. Daniel G. Wootton è finanziato da un NIHR PhD Fellowship, e non ha conflitti di interesse. 40 Bals di ricerca svolte in modo indipendente. Angela D. Wright non ha alcun potenziale conflitto di interessi. Assist con oltre 100 Bals ricerca. Adam KA Wright non ha alcun potenziale conflitto di interessi. Ha elaborato oltre 50 campioni di BAL. Duncan G. Fullerton </strong&gt; Non ha alcun potenziale conflitto di interessi. 100 Bals di ricerca svolte in modo indipendente. Stephen B. Gordon non ha alcun potenziale conflitto di interessi. Ha ricevuto fondi dalla Merck (MSD) e Novartis per partecipare a conferenze. 400 Bals di ricerca svolte in modo indipendente.

Per ottenere buoni risultati i seguenti sono utili: <ol><li> Buona anesthetisation alla base della lingua e posteriore dell&#39;orofaringe. Questo è importante perché migliora la tolleranza procedurale del soggetto e comfort complessivo. </li><li> O una pediatrico (diametro esterno 3,4-3,6 mm) o broncoscopio adulto (diametro esterno 4,8-5,9 mm) possono essere utilizzati. </li><li> Se c&#39;è qualche disagio durante l&#39;intubazione nasale, intubazione orale è preferito. In generale, intubazione nasale o è una tecnica semplice, o dovrebbe essere abbandonato. </li><li> Dopo instillazione iniziale di lidocaina all&#39;orofaringe, il soggetto può preferire broncoscopio ritirata in attesa dell&#39;inizio dell&#39;anestesia, soprattutto se il broncoscopio viene inserito per via orale. </li><li> Garantire almeno 10 x 10 ml siringhe sono precompilati con solo 2-4 ml di lidocaina. L&#39;aria deve essere lasciato nelle siringhe che consentano un migliore consegna delle dell&#39;anestesia direttamente su corde e muco endobronchialesa. </li><li> Poiché tosse durante la procedura riduce significativamente BAL rendimento; utilizzando una soluzione salina riscaldata e con buone anestesia mucose sono importanti per ridurre questo. </li><li> I 50 ml siringhe devono essere pre-riempite con soluzione salina riscaldata. E &#39;comune per i primi 50 ml di soluzione salina normale instillato cedere tra 10-20 ml causa della perdita spazio morto e la restante esecuzione nelle vie aeree terminali. Ulteriori aliquote restituiscono una percentuale maggiore di fluido. </li><li> L&#39;operatore deve sempre controllare il broncoscopio prima di intubazione, compresa la garanzia di aspirazione efficace aspirando soluzione fisiologica sterile. Perdita di aspirazione può comunemente verificarsi a causa di attorcigliamento del tubo o perdite attorno alle connessioni con il broncoscopio o dispositivo di aspirazione. </li><li> Durante l&#39;aspirazione manuale, idealmente le vie aeree non deve crollare. Se l&#39;aspirazione crolla ricorrentemente le vie aeree, ritorna BAL ridurre al meccanismo a valvola, e infiammazione locale e sanguinamento è più probabile: questo a sua volta rende le vie aeree mminerale irritabile e tosse più probabile. La scelta del più appropriato ramo subsegmentali RML e con basse pressioni di aspirazione sono quindi entrambi importanti. </li><li> Quando l&#39;aria viene aspirata costantemente verificare nuovamente la connessione della siringa al broncoscopio e anche la posizione del broncoscopio nelle vie aeree distale. Se questo è un problema ricorrente, post-procedura assicurarsi che non ci siano buchi nel broncoscopio stessa. </li><li> BAL dai fumatori è spesso più scuro a causa della presenza di particelle intracellulari. I fumatori possono tollerare la broncoscopia meno bene, e hanno aumento della tosse. </li><li> La resa del volume BAL preferibile è&gt; 100 ml. Una resa di&gt; 150 ml è eccellente. Non abbiamo avuto alcun rendimenti&gt; 170 ml. Non esiste una relazione lineare tra il rendimento delle cellule e BAL resa volume. </li><li> I rendimenti di &lt;100 ml sono, nella nostra esperienza, più propensi a portare a effetti collaterali quali tosse, dolore toracico e febbre. Si consiglia che i soggetti con rese di &lt;100 ml essere recoVered in posizione laterale sinistra, puo aiutare il drenaggio di qualsiasi fluido polmone residuo. </li><li> Contatto clinico dovrebbe essere effettuato con il soggetto entro 1-5 giorni per garantire l&#39;assenza di effetti collaterali. </li><li> Midazolam sedazione viene utilizzato per &lt;50% dei soggetti nel Regno Unito e &lt;5% in Malawi. Midazolam non sembra direttamente migliorare la tollerabilità, alcuni operatori ritengono che la sedazione a volte può essere controproducente nel mantenere un dialogo coerente (e rassicurante) con il soggetto. </li><li> Nella nostra esperienza, c&#39;è una curva di apprendimento significativo con questa tecnica. Per esempio il coordinamento tra medico e infermiere richiede tempo e rendimenti sono spesso inferiori all&#39;inizio del processo di apprendimento. </li><li> Nei soggetti HIV positivi, usiamo gli antibiotici a scopo profilattico prebronchoscopy. </li></ol>

Sfondo Broncoscopia a fibre ottiche è stato sviluppato per la pratica clinica, è ampiamente utilizzato sia diagnostico che terapeutico 1,2. Il lavaggio broncoalveolare (BAL) rimuove le cellule non aderenti e del polmone rivestimento liquido dalla superficie della mucosa, la biopsia viene usato per campionare mucosa e sottomucosa tessuti. In ambienti di ricerca, BAL permette di campionamento di innata (macrofagi polmonari 3-5), cellulare (B e le cellule T 6), e umorali (immunoglobuline 7) risposte all&#39;interno del polmone. BAL è accettata a livello internazionale per la ricerca 8 e dal 1999 la tecnica è stata eseguita in&gt; 1.000 soggetti nel Regno Unito e in Malawi dal nostro gruppo. Usiamo questa tecnica negli studi di risposte immunitarie innate, cellulari e umorali all&#39;antigene pneumococco inclusi sperimentale trasporto umano pneumococcica 9,17, biomassa fumo 5, HIV e la vaccinazione, e stu trattamento adiuvantemuore in recupero da polmonite. La nostra tecnica utilizza aspirazione a mano gentile di liquido instillato, questo è stato progettato per massimizzare il volume BAL restituiti e applicare una forza minima di taglio sulla epiteli ciliato al fine di preservare la struttura e la funzione delle cellule all&#39;interno del fluido BAL. In un contesto di ricerca BAL utilizza una tecnica diversa da quella praticata da medici di assistenza respiratoria e intensiva (lavare spesso definita bronchiale, lavaggi, di lavaggio, o BAL), che mirano a ottenere benefici diagnostico o terapeutico. La tecnica di ricerca è destinato a raccogliere le cellule e preservare la vitalità di facilitare la crescita delle cellule in coltura ex vivo. Per questi motivi la tecnica di ricerca utilizza un instillate volume più grande (tipicamente dell&#39;ordine di 200 ml) e impiega aspirazione manuale per ridurre il danno cellulare. I pazienti sono date anestesia locale, offerto sedazione cosciente (midazolam), e tollerano la procedura bene con effetti collaterali minimi. Soggettivi verbale e scrittainformazioni t migliora la tolleranza e il consenso informato scritto è obbligatoria 1. Scopo L&#39;obiettivo generale è che la procedura dovrebbe essere sicuro ed efficace. I soggetti non dovrebbero incontrare alcun disturbo fisiologico e gli operatori devono costantemente raccogliere in eccesso di 100 ml di BAL di soggetti. Dopo la procedura, i soggetti dovrebbero verificarsi effetti collaterali minimi. Sicurezza Sicurezza del soggetto è fondamentale. I soggetti vengono accuratamente selezionati con chiari criteri di inclusione ed esclusione. Questo protocollo include una descrizione dei rischi potenziali e le misure adottate per mitigarli. Controindicazioni alla broncoscopia ricerca possono essere espressi come assoluto o relativo, e sono inclusi nel nostro protocollo di studio come criteri di esclusione e di inclusione. I nostri soggetti sono tutti selezionati per garantire piena salute. Controindicazioni assoluteincludere rachide cervicale instabile, ipossia non risponde, angina instabile, diatesi emorragica e maligna aritmia cardiaca. Le controindicazioni relative, comprese quelle condizioni associate con l&#39;aumento del tasso di complicanze, comprendono: Generale: mal cooperativa soggetto 1, alcun significativo problema di salute generale ad esempio l&#39;epilessia, precedente broncoscopia mal tollerata, noto reazioni avverse ai lidocaina o midazolam, gravidanza, cattiva alimentazione. Respiratorio: ipossia [saturazioni (CST), in onda &lt;94%], ipercapnia, asma instabile 1, la funzione respiratoria significativa compromissione 1 (FEV1 &lt;1 L), ipertensione polmonare. Cardiovascolare: uremia, entro 6 settimane di infarto del miocardio 1, superior ostruzione della vena cava. Altro: immunosoppressione (il nostro gruppo si esibisce regolarmente questa proceduradura in soggetti HIV positivi). Vedi Tabella 1 - Rischi connessi con BAL per la ricerca.

<table><tbody><tr><td>Broncoscopio a fibre ottiche, luce e sorgente di aspirazione</td><td>non specificato</td><td></td><td> </td></tr><tr><td> Camice chirurgico, guanti sterili </td><td>non specificato</td><td></td><td> </td></tr><tr><td> Sfignomanometro </td><td>non specificato</td><td></td><td> Per il monitoraggio continuo del paziente </td></tr><tr><td> Pulsossimetro </td><td>non specificato</td><td></td><td> Per il monitoraggio continuo del paziente </td></tr><tr><td>Monitor ECG a 3 derivazioni</td><td>non specificato</td><td></td><td> Per il monitoraggio continuo del paziente </td></tr><tr><td>Erogazione nasale di ossigeno 2-4 L/min</td><td>non specificato</td><td></td><td> </td></tr><tr><td> Lidocaina spray al 10% (xilocaina) </td><td>AstraZeneca</td><td></td><td>Per anestesia topica</td></tr><tr><td> Lidocaina cloridrato 2% </td><td>non specificato</td><td></td><td>Per anestesia topica</td></tr><tr><td> Lidocaina gel (Instillagel) </td><td>Farco-Pharma, Germania</td><td></td><td> Prodotti alternativi disponibili da altri fornitori </td></tr><tr><td>Soluzione salina normale, sterile, 200 ml</td><td>non specificato</td><td></td><td>Caldo a 30 &#176; C</td></tr><tr><td>10 ml siringa conica (x10)</td><td>non specificato</td><td></td><td> Per somministrazione di lidocaina </td></tr><tr><td>Cannula endovenosa 18 G</td><td>non specificato</td><td></td><td> Per somministrazione di midazolam </td></tr><tr><td> Midazolam </td><td>non specificato</td><td></td><td> Per sedazione </td></tr><tr><td> Flumazenil </td><td>non specificato</td><td> <</td><td>p>Inversione della sedazione con benzodiazepine (solo per uso di emergenza) </td></tr><tr><td>Siringhe coniche da 60 ml (x4)</td><td>non specificato</td><td></td><td>Per la normale iniezione di soluzione salina e il prelievo di liquidi BAL. Potrebbe essere necessario un connettore per il collegamento al porta di iniezione del broncoscopio.</td></tr><tr><td> Tampone di garza sterile </td><td>Vernaid, Regno Unito<</td><td>p></td><td> Prodotti alternativi disponibili da altri fornitori </td></tr><tr><td> Contenitore sterile per fluido BAL </td><td>Vedi testo e commenti</td><td></td><td>I flaconi di vetro siliconato riducono l'aderenza dei macrofagi. In alternativa, è possibile utilizzare provette da centrifuga da 50 ml (capacità totale 200 ml)</td></tr><tr><td> Sigmacote </td><td>Sigma, UK</td><<td>p>SL2</td><td> Solo se si utilizzano bottiglie di vetro siliconate. NB: Nocivo e infiammabile. Se utilizzato, seguire le precauzioni dettagliate nel manuale del produttore s MSDS </td></tr><tr><td> Centrifuga </td><td>non specificato</td><td></td><td>Capacità di almeno 4 provette da 50 ml. Refrigerazione a 4 &#176; C preferito.</td></tr><tr><td> Centrifuga Shandon Cytospin </td><td>Thermo Scientific, UK</td><<td>p></td><td> Solo per conta differenziale </td></tr><tr><td> Terreno RPMI 1640 con L-glutammina </td><td>Sigma, UK</td><td>R8758</td><td> Prodotti alternativi disponibili da altri fornitori </td></tr><tr><td> Siero fetale bovino </td><td>Sigma, UK</td><<td>p>F6178</td><td> Prodotti alternativi disponibili da altri fornitori </td></tr><tr><td> Penicillina-Streptomicina </td><td>Sigma, UK</td><<td>p>P4333</td><td> Prodotti alternativi disponibili da altri fornitori</tr><tr><td> > Amfotericina B </td><td>Sigma, UK</td><<td>p>A2942</td><td> Prodotti alternativi disponibili da altri fornitori </td></tr><tr><td> Piastre per colture tissutali </td><td>Greiner Bio-One, UK</td><<td>p>662160</td><td> Prodotti alternativi disponibili da altri fornitori </td></tr><tr><td> Vetrini per microscopio </td><td>non specificato</td><td></td><td> Solo per conteggio differenziale </td></tr><tr><td> Shandon cytofunnel </td><td>Thermo Scientific, UK</td><<td>p>A78710003 </td><td> Solo per conta differenziale </td></tr><tr><td> Shandon cytoclip </td><td>Thermo Scientific, UK</td><<td>p>59910052</td><td> Solo per conta differenziale </td></tr><tr><td> Set di colorazione Hemacolor (fissativo, reagenti rossi e blu) </td><td>Merck, Germania<</td><td>p>111661</td><td> Uso secondo il produttore' Istruzioni per l'uso </td></tr></tbody></table>

lavaggio broncoalveolare (bal) di ricerca; ottenere un&#39;adeguata yield esempio

Bronchoalveolar Lavage (BAL) for Research; Obtaining Adequate Sample Yield

Descriviamo una tecnica di ricerca per la broncoscopia a fibre ottiche con lavaggio broncoalveolare (BAL) con mano il manuale di aspirazione possedute al fine di rimuovere le cellule non aderenti e liquido rivestimento del polmone dalla superficie della mucosa. In ambienti ricerca, BAL permette di campionamento di innata (macrofagi polmoni), cellulari (cellule T B e) e umorali (immunoglobulina) risposte all&#39;interno del polmonare. BAL è accettata a livello internazionale per scopi di ricerca e dal 1999 la tecnica è stata eseguita in&gt; 1.000 soggetti nel Regno Unito e in Malawi dal nostro gruppo. La nostra tecnica utilizza aspirazione portatile delicato da fluido instillato, questo è stato progettato per massimizzare il volume BAL restituito e applicare una forza minima al taglio su epiteli ciliati al fine di preservare la struttura e la funzione delle cellule all&#39;interno del BAL e preservare la vitalità di facilitare la crescita di cellule in coltura ex vivo. La tecnica di ricerca utilizza pertanto un più ampio volume di insstillato (tipicamente dell&#39;ordine di 200 ml) e impiega aspirazione manuale per ridurre il danno cellulare. I pazienti sono date anestesia locale, offerto sedazione cosciente (midazolam), e tollerano la procedura bene con effetti collaterali minimi. Informazioni soggette verbale e scritta migliora la tolleranza e il consenso informato scritto è obbligatoria. Sicurezza del soggetto è fondamentale. I soggetti vengono accuratamente selezionati con chiari criteri di inclusione ed esclusione. Questo protocollo include una descrizione dei rischi potenziali e le misure adottate per mitigare loro, un elenco di controindicazioni, pre e verifiche post-procedura, nonché precise tecniche di broncoscopia e di laboratorio.

Buoni risultati clinici sono un volume BAL con oltre 100 ml e un soggetto che ha sperimentato al massimo, disagio minore (vedere Tabella 1). Ciò richiede un soggetto rilassato e cooperativo. Il medico deve essere sicuro, pienamente preparati (Materiali), e comprensione verso il volontario. Variabilità inter-e intra-soggetto della resa cellulare (compresa la conta differenziale) è stato descritto. Conta delle cellule differenziali di soggetti sani sono in genere&gt; 90% macrofagi con un piccolo numero di neutrofili (&lt;2%) e linfociti (5-10%). Cellule BAL centrifugati su vetrini da microscopio possono essere colorati con una macchia nucleare differenziale per ottenere queste informazioni (Figura 1). In Figura 1, le cellule BAL sono state fissate e colorate con Hemacolor colorazione secondo le istruzioni del produttore. Almeno 300 celle devono essere contati per ottenere risultati affidabili per i macrofagi,neutrofili e linfociti; 500 cellule per i tipi di cellule più rari. <table border="1" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Pericolo </td><td> Rischio </td><td> Ridotto in questo protocollo da: </td></tr><tr><td colspan="3"> Effetto della broncoscopia e BAL 1, 14 </td></tr><tr><td> Lieve disagio </td><td> &lt;25% 14 # </td><td> Analgesia e sedazione adeguata. Approccio fiducioso e attento al soggetto. </td></tr><tr><td> Epistassi </td><td> &lt;1% # </td><td> Leggera pressione solo per intubazione nasale. Se il soggetto fastidio o un diaframma più chiuso - intubazione orale invece. </td></tr><tr><td> Emorragia endobronchiale (emottisi) </td><td> &lt;0,1% * 15 </td><td> Nessun biopsie prese. Attento controllo durante la broncoscopia - evitando mucosa respiratoria. </td></tr><tr><td> Nausea, vomito e polmonite da aspirazione </td><td> &lt;0,02% 14, # </td><td> Il digiuno per cibo solido&gt; 4 ore preprocedure 1. Adeguata anestesia topica. Posizione semiseduta durante la procedura. Un&#39;attenta osservazione post-procedura. </td></tr><tr><td> Febbre </td><td> 0.01 14-1% # 16 </td><td> Si riferisce a infiammazione, e può minimizzato raccolta massima di BAL. Lobo singolo BAL solo. # </td></tr><tr><td> Naso Mal / di gola e raucedine </td><td> &lt;25% 14 # </td><td> Adeguate anestesia topica del naso, della gola e della laringe (minimizzando tosse). </td></tr><tr><td> Infezione </td><td> &lt;0,1% in HIV negativo, 1% in pazienti HIV positivi 14 # </td><td> Procedura broncoscopio lavaggio standard 1. Lobo singolo BAL solo. # Il riconoscimento precoce di infezione: esame clinico entro 1 ora did contatto clinica 1-5 giorni dopo la broncoscopia. </td></tr><tr><td> Dolore toracico / tosse </td><td> &lt;0,2% 14, # </td><td> Lobo solo single BAL. Raccolta massima BAL. # </td></tr><tr><td colspan="3"> Effetti dei farmaci: lidocaina, midazolam </td></tr><tr><td> Aritmia </td><td> Molto raro * </td><td rowspan="3"> Massimo di 5 mg / kg 14 lidocaina utilizzati. Riscaldato soluzione fisiologica instillato. # Pulsossimetria (satelliti&gt; 90% con la supplementazione di ossigeno), il monitoraggio cardiaco tutta procedura. Benzodiazepine antagonista (flumazenil) immediatamente disponibile. </td></tr><tr><td> Disorientamento / agitazione </td><td> &lt;0,1% † # </td></tr><tr><td> Depressione respiratoria Cardio </td><td> Molto raro * </td></tr></tbody></table> * Non sperimentato nel nostro gruppo in oltre 1.500 procedure di ricerca. † idiosyncratic anziché reazione dose-dipendente. # Esperienza del nostro gruppo in oltre 1.500 procedure di ricerca. Tabella 1. Rischi connessi con BAL per la ricerca. Questo include pericolo o del rischio e come questo viene ridotto usando la tecnica descritta. Effetti della broncoscopia / BAL e anche gli effetti di tutte le droghe medicinali utilizzati sono inclusi. <img alt="Figura 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/4345/4345fig1highres.jpg" width="500" /> Figura 1. Un vetrino da microscopio Mostro BAL macrofagi e neutrofili occasionale. Cellule BAL sono stati fissati in metanolo e colorate con Hemacolor rosso (eosina Y) e blu (azzurro B).

Descriviamo una tecnica di ricerca per la broncoscopia a fibre ottiche e di lavaggio broncoalveolare con l&#39;aspirazione a bassa pressione. La tecnica è utilizzata per raccogliere cellule immunitarie dalle superfici bronco polmonare. Viene utilizzato anestesia locale e sedazione cosciente lieve (midazolam). Soggetti tollerano gli effetti collaterali minimi procedura di bene e di esperienza.

Lavaggio broncoalveolare (BAL) di ricerca; ottenere un&#39;adeguata Yield Esempio

We describe a research technique for fiberoptic bronchoscopy with bronchoalveolar lavage (BAL) using manual hand held suction in order to remove ...

Lo scopo generale di questa procedura è eseguire un lavaggio broncoalveolare in modo sicuro ed efficace. Questo viene raggiunto innanzitutto assicurando la sicurezza, la collaborazione e il comfort dei soggetti selezionati, utilizzando criteri di inclusione ed esclusione chiari.Vengono eseguiti anche controlli e osservazioni pre-procedurali. Successivamente, una volta nella sala di broncoscopia, dopo aver verificato tutta l'apparecchiatura, al soggetto viene somministrato anestetico locale e viene offerta una sedazione cosciente. Poi, dopo l'intubazione delle corde vocali, il broncoscopio viene avanzato in una posizione adeguata all'interno del LBR.Questo garantisce un buon rendimento in volume del liquido di lavaggio broncoalveolare (BAL). Infine, il liquido di BAL viene raccolto mediante aspirazione manuale delicata ed è quindi trasportato senza ritardo su ghiaccio per l'immediata lavorazione in laboratorio. In definitiva, questa tecnica permette di raccogliere le cellule preservandone la vitalità, favorendone la crescita in colture es vivo.Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti utilizzati dai medici specializzati in pneumologia e terapia intensiva, spesso definiti lavaggi bronchiali, lavaggio broncoalveolare o lavaggio intestinale, volti a ottenere un beneficio diagnostico o terapeutico, consiste nell’utilizzo di un’aspirazione manuale delicata del liquido instillato. Questa procedura è progettata per massimizzare il volume di liquido recuperato dall’intestino e applicare una forza di taglio minima sull’epitelio cigliato, al fine di preservare la struttura e la funzionalità delle cellule presenti nel liquido intestinale. La procedura di lavaggio broncoalveolare viene eseguita in regime ambulatoriale, con appropriati controlli prima e dopo l’intervento secondo le linee guida standard dell’ospedale, inclusa la verifica che il modulo di consenso informato sia stato correttamente firmato e datato.All'arrivo, il soggetto viene accolto dall'infermiere specializzato nella ricerca respiratoria, che effettua tutti i controlli preliminari necessari, verificando in particolare che il soggetto sia a digiuno da almeno quattro ore per cibi solidi e da due ore per liquidi. Se il soggetto soddisfa tutti i criteri richiesti, indossa un camice ospedaliero e vengono effettuate le osservazioni pre-procedura, inclusi i rilevamenti di pressione arteriosa, frequenza cardiaca e saturazione di ossigeno. Viene inserita una cannula di piccolo calibro, preferibilmente nella mano sinistra.Questo rimarrà in C due fino al termine del periodo di recupero post-procedura. Il soggetto viene quindi trasferito nell'ambiente per broncoscopia, dove è presente un broncoscopista esperto in ricerca respiratoria. Successivamente, l'apparecchiatura di monitoraggio viene collegata al soggetto.Questo include un ECG a tre derivazioni, un manometro A, fig o e un ossimetro di pulso. Non è necessario un supporto anestetico. Una cannula nasale viene applicata a tutti i volontari prima dell'inserimento del broncoscopio; l'ossigeno viene somministrato se la saturazione scende al di sotto del 96%, fino a quattro litri al minuto.A questo punto, l'operatore esegue controlli preliminari sul broncoscopio. Ciò include verificare l'efficacia dell'aspirazione aspirando soluzione fisiologica sterile. Una volta accertato che il broncoscopio funziona in modo ottimale, viene somministrata un'anestesia topica ai passaggi nasali e alla mucosa orale del soggetto, applicando rispettivamente instillagel e Xylocaine.Se la sedazione è appropriata ed è stata richiesta dal soggetto, viene somministrata per via endovenosa una dose adeguata di midazolam. Come per tutte le procedure che prevedono l'uso di anestetici, un agente antagonista appropriato deve essere immediatamente disponibile. Inoltre, assicurarsi che siano presenti anche apparecchiature per la rianimazione.Il soggetto viene intubato attraverso il naso. Se ciò non è possibile, l'intubazione può essere effettuata attraverso la bocca, a condizione che venga utilizzata una pinza adatta a livello della laringe. L'anestesia topica viene somministrata utilizzando da quattro a sei millilitri di lidocaina al 4% una volta superate le corde vocali.Inoltre, si somministra un'anestesia mucosale utilizzando aliquote di due millilitri di lidocaina al 2% alla carina, al punto di divisione del lobo inferiore destro e del lobo medio destro o LMD, e all'ingresso del LMD. Infine, il broncoscopio raggiunge il lobo medio destro e idealmente viene posizionato nel segmento mediale in una posizione distale sicura. Eseguire il test del battito di ciglia utilizzando il pulsante di aspirazione per assicurarsi che il broncoscopio non sia posizionato troppo in profondità, condizione che potrebbe causare un collasso delle vie aeree.Quattro siringhe da 60 millilitri sono riempite in anticipo con un volume di 60 millilitri, due volumi da 50 millilitri e un volume da 40 millilitri di soluzione salina sterile riscaldata. Quando il soggetto e il broncoscopista sono pronti, la prima siringa di soluzione salina viene instillata dall'assistente alla broncoscopia. Mentre il broncoscopista mantiene la posizione nel LBM (Lobo Medio Destro), l'assistente esegue un'aspirazione manuale delicata utilizzando lo stesso canale e la stessa siringa.La procedura viene quindi ripetuta altre tre volte, utilizzando ciascuna delle siringhe successivamente con un volume massimo di 200 millilitri impiegato in questa tecnica specifica; il liquido di lavaggio broncoalveolare (BAL) recuperato viene espulso delicatamente in contenitori di plastica che possono essere già pre-siliconati e mantenuti su ghiaccio fondente. La pre-siliconizzazione inibisce l'adesione cellulare e massimizza il recupero cellulare. Il liquido di BAL appare torbido alla luce, con bolle superficiali simili a sapone formate da proteine e surfattanti.Infine, il broncoscopio viene lentamente ed completamente rimosso. Il soggetto viene quindi trasferito per il recupero monitorato e il liquido di lavaggio broncoalveolare viene trasportato senza indugio su ghiaccio. Per l'elaborazione immediata, consentire al soggetto di riprendersi fino a quattro ore sotto la supervisione di un'infermiera specializzata in ricerca respiratoria.Durante questo periodo, consentire al soggetto di riposare ma di non mangiare né bere fino a quando non siano trascorsi almeno 60 minuti dalla procedura. Una volta che la capacità di deglutire è stata valutata come sicura, questa misura ha lo scopo di ridurre il rischio di aspirazione. Le osservazioni post-procedurali vengono monitorate e registrate.Viene effettuata un'esame clinico prima della dimissione. Al soggetto vengono inoltre illustrate le comuni effetti collaterali e fornito un numero di contatto nel caso si verifichino effetti collaterali significativi. Un appuntamento di follow-up con il soggetto viene effettuato da uno specialista o da un'infermiere da uno a cinque giorni dopo la procedura.Questo può avvenire sia per telefono che di persona. Una volta in laboratorio di ricerca, eseguire tutte le manipolazioni su ghiaccio bagnato, quando possibile.Per prima cosa, registrare il volume del lavaggio broncoalveolare. Quindi filtrare il liquido attraverso un doppio strato di garza sterile per rimuovere i tappi di muco e raccogliere il filtrato in provette sterili da 50 millilitri. Centrifugare i tubi per ottenere il pellet cellulare mediante centrifugazione a 500 G a quattro gradi Celsius per cinque-dieci minuti.Rimuovere il surnatante e lavare con 50 millilitri di soluzione salina normale fredda. Ripetere la centrifugazione. Una volta ancora, risospendere le cellule in un volume appropriato di mezzo di coltura.Di solito, due millilitri forniscono una buona densità cellulare per il conteggio. Eseguire quindi il conteggio cellulare utilizzando un emocitometro e il blu di trian in base alle procedure standard; aggiustare la densità della sospensione cellulare a un milione di cellule per millilitro (1 × 10⁶ cellule/mL) aggiungendo un volume appropriato di mezzo. Successivamente, trasferire un millilitro di sospensione cellulare in ciascun pozzetto di una piastra a 24 pozzetti.Incubare le cellule in una piastra a pozzetti a 37 gradi Celsius per tre ore per consentire l'adesione dei macrofagi ai linfociti. Dopo tre ore di incubazione, il mezzo di coltura viene pipettato delicatamente su e giù per tre volte e raccolto. Questo mezzo contiene linfociti e macrofagi non aderenti e può essere utilizzato per valutare la funzione dei linfociti.Può inoltre essere utilizzato in ulteriori passaggi di purificazione per lavori sui macrofagi. Dopo tre ore di incubazione, aspirare con attenzione il mezzo e sostituirlo con mezzo fresco e caldo senza antibiotici; in questo punto i macrofagi sono aderenti alla piastra per colture cellulari. Le cellule BAL sono state centrifugate su un vetrino utilizzando un citocentrifugo Thermo Shandon ed colorate con un colorante nucleare differenziale per rivelare i tipi cellulari.La maggior parte delle cellule sono macrofagi, come la cellula indicata con M, ma si osservano occasionalmente anche un neutrofilo indicato con N e un linfocita indicato con L. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come eseguire in modo sicuro ed efficace la broncoscopia e il lavaggio broncoalveolare a fini di ricerca utilizzando questa tecnica, elementi fondamentali dei quali sono un'adeguata anestesia della base della lingua e della faringe posteriore, il controllo del broncoscopio per verificarne l'efficacia del sistema di aspirazione e l'assenza di perdite d'aria prima della procedura, e la scelta del settore subsegmentale più appropriato nel lobo medio destro. Gli operatori dovrebbero raccogliere costantemente oltre cento millilitri di lavaggio broncoalveolare da soggetti che presentano effetti collaterali minimi.

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Fonte: Venuprasad, K., et al. Somministrazione intratracheale di Haemophilus influenzae in modelli murini per studiare l'infiammazione delle vie aeree. J. Vis. Exp. (2016)Questo video mostra la raccolta e l'elaborazione del liquido di lavaggio broncoalveolare da un topo eutanasia infetto da Haemophilus influenzae non tipizzabile per l'analisi a valle.

Raccolta di liquido di lavaggio broncoalveolare da un modello murino infetto da Haemophilus influenzae non tipizzabile

Questo video dimostra l'uso della citometria a flusso per identificare e contare varie cellule immunitarie nel liquido di lavaggio broncoalveolare. Inizialmente, le singole cellule immunitarie vengono identificate utilizzando un colorante di vitalità, seguito dalla colorazione differenziale delle proteine marcatrici di superficie, consentendo l'enumerazione precisa di ciascun tipo di cellula.

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La risposta immunitaria dell'ospite all'infezione patogeno è un processo strettamente regolata. Utilizzando un polmone modello di esposizione lipopolisaccaride nei topi, è possibile effettuare valutazioni ad alta risoluzione dei complessi meccanismi associati alla patogenesi della malattia.

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Questo articolo descrive le tecniche broncoscopiche nel polmone bovino in condizioni sperimentali, vale a dire l'inoculazione broncoscopicamente guidate, lavaggio broncoalveolare, spazzolatura bronchiale e biopsia transbronchiale.

Il polmone bovino in ricerca biomedica: Visivamente guidata broncoscopia, intrabronchiale Semina ed<em&gt; In Vivo</em&gt; Tecniche di campionamento

Lo stato di salute del polmone si riflette il tipo e il numero di cellule immunitarie che sono presenti nei bronchioli dei polmoni. Descriviamo una tecnica di lavaggio broncoalveolare che consente di isolare e studio delle cellule non aderenti e fattori solubili dal tratto respiratorio inferiore dei topi.

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Qui, descriviamo due protocolli di isolamento delle vescicole extracellulari, centrifugazione di ultrafiltrazione e ultracentrifugazione con centrifugazione su gradiente densità, per isolare le vescicole extracellulari da campioni di liquido di lavaggio broncoalveolare murino. Le vescicole extracellulari derivate dal fluido di lavaggio broncoalveolare murino con entrambi i metodi sono quantificate e caratterizzate.

Isolamento delle vescicole extracellulari dal fluido di lavaggio broncoalveolare murino usando una tecnica di centrifugazione di ultrafiltrazione

Descriviamo un metodo per la lavorazione del fluido di lavaggio bronchoalveolar e corrisponde al sangue periferico di individui cronicamente affetti da HIV sulla terapia antiretrovirale per valutare i serbatoi polmonari di HIV. Questi metodi portano all'acquisizione di cellule T CD4 altamente pure e macrofagi alveolar che possono successivamente essere utilizzati per immunofenofizzazione e quantificazioni HIV DNA/RNA mediante reazione a catena di polimerasi ultrasensibili.

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