Name: Nanoparticelle virali per In vivo Imaging Tumore (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-11-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 4 s
Description: Impara il targeting tumorale e l'imaging in vivo utilizzando nanoparticelle virali fluorescenti in modelli murini xenotrapiantati. Questo metodo permette di studiare la biodistribuzione e le potenziali applicazioni terapeutiche.

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Questo lavoro è stato sostenuto da NIH / NIBIB sovvenzioni R00 EB009105 (per NFS) e P30 EB011317 (per NFS), il NIH / NIBIB formazione concessione T32 EB007509 (a AMW), un Case Western Reserve University Interdisciplinare Alliance Investment Grant (per NFS), e una causa Comprehensive Cancer Center di sovvenzione P30 CA043703 (per NFS). Ringraziamo i ricercatori laboratorio per studenti universitari Steinmetz per le loro mani-sul sostegno: Nadia Ayat, Kevin Chen, Sourav (Sid) Dey, Alice Yang, Sam Alexander, Craig D&#39;Cruz, Stephen Hern, Lauren Randolph, Brian Quindi, e Paul Chariou .

1. VNP (CPMV, BMV, PVX e TMV) Propagazione <ol><li> Impostare la camera di impianto al coperto di controllo per 15 ore del giorno (100% di luce, 25 ° C, 65% di umidità) e 9 ore di notte (0% luce, 22 ° C, 60% di umidità). </li><li> Inoculare le piante in base alla timeline nella Tabella 1. </li></ol><table border="1"><tbody><tr><td> CPMV </td><td> PVX, TMV, e BMV </td></tr><tr><td rowspan="2"> Giorno 0: Stabilimento 3 fagiolo dall&#39;occhio semi / pot. </td><td> Giorno 0: Pianta ~ 30 N. benthamiana semi / pot. Concimare una volta alla settimana con 1 cucchiaio di concime / 5 L di acqua. </td></tr><tr><td> Giorno 14: Re-pot N. benthamiana a 1 pianta / vaso. </td></tr><tr><td> Giorno 10: Infect Foglie primarie con CPMV (5 μg/50 pl / foglia) da inoculazione meccanica con una leggera spolverata di carborundum. </td><td> Giorno 28: Infect tre a five lascia con PVX, TMV, o BMV (5 μg/50 pl / foglia) da inoculazione meccanica con una leggera spolverata di carborundum. </td></tr><tr><td> Foglie Harvest e conservarlo in -80 ° C.: Giorno 20 </td><td> Foglie Harvest e conservarlo in -80 ° C.: giorno 42 </td></tr></tbody></table> Tabella 1. Timeline per la coltivazione, infettando, e la raccolta foglie. Nota: solo propagazione CPMV è dimostrato come esempio. 2. VNP (CPMV, BMV, PVX e TMV) Purificazione Nota: Tutte le operazioni sono eseguite su ghiaccio oppure a 4 ° C. <ol><li> Omogeneizzare 100 g di foglie congelati in un frullatore standard utilizzando due volumi di tampone freddo (vedi Tabella 2). Filtrare 2-3 strati di garza. </li><li> Per PVX, regolare il pH a 6,5 ​​con 1 M HCl. Aggiungere 0,2% (w / v) di acido ascorbico e 0,2% (w / v) di sodio sulfite. </li><li> Centrifugare pianta omogenato grezzo a 5.500 xg per 20 min. Raccogliere il surnatante. </li><li> Per BMV, strato 25 ml di surnatante oltre 5 ml di 10% (w / v) di saccarosio. Centrifugare a 9000 xg per 3 ore e risospendere pellet in soluzione CsCl 38,5% (w / v). Mescolare agitando per 5 ore, poi continuare con il passo 2.12. </li><li> Estrarre materiale vegetale con l&#39;aggiunta di 0,7 volumi di 1:1 (v / v) cloroformio :1-butanolo. Mescolare impasto per 30-60 min. </li><li> Centrifugare soluzione a 5.500 xg per 20 min. Raccogliere la fase acquosa superiore. </li><li> Aggiungere a 0,2 M NaCl e l&#39;8% (w / v) PEG (MW 8000). Per TMV, anche aggiungere 1% (v / v) Triton X-100. Mescolare per almeno 1 ora, quindi lasciate riposare per almeno 1 ora. </li><li> Centrifugare soluzione a 15.000 xg per 15 min. Risospendere il pellet in 10 ml di tampone. Per PVX, aggiungere 0,1% β-mercaptoetanolo e urea a 0,5 M. </li><li> Centrifugare a 8000 xg per 30 minuti e raccogliere il supernatante. </li><li> Ultracentrifuga surnatante a 160.000 xg per 3 ore. Risospendere il pellet in 5 ml di tampone overnight. </li><li> Preparazione di un gradiente di saccarosio 10-40% con volumi pari al 10%, 20%, 30%, e 40% di saccarosio in tampone (più pesante prima). Lasciare che il gradiente di equilibrare notte a temperatura ambiente. </li><li> Ultracentrifuga sedimento risospeso su gradiente di saccarosio a 100.000 xg per 2 ore (24 ore per BMV). </li><li> Raccogliere banda light scattering e dializza contro tampone. </li><li> Caratterizzare le VNPs (sotto) e conservare a 4 ° C. Per la conservazione a lungo termine, conservare a -80 ° C. </li></ol><table border="1"><tbody><tr><td> CPMV e TMV </td><td> 0,1 M tampone fosfato di potassio (pH 7,0) 38,5 mM KH 2 PO 4 61,5 mM K 2 HPO 4 </td></tr><tr><td> PVX </td><td> 0,5 M tampone borato (pH 7,8) 0,5 M di acido borico Aggiustare il pH con NaOH </td></tr><tr><td> BMV </td><td> SAMA tampone (pH 4,5) 250 mM acetato di sodio 10 mM MgCl 2 2 mM β-mercaptoetanolo (aggiungere fresco) </td></tr></tbody></table> Tabella 2. Buffer e le loro ricette per ogni VNP. Nota: solo propagazione CPMV è dimostrato come esempio. 3. VNP (CPMV, BMV, PVX e TMV) Caratterizzazione <ol><li> Effettuare spettroscopia UV / visibile per determinare la concentrazione di VNPs. <ol><li> Misurare l&#39;assorbanza di 2 ml di campione utilizzando uno spettrofotometro NanoDrop. </li><li> Determinare la concentrazione di particelle e coloranti utilizzando la legge di Lambert-Beer (A = εcl, dove A è l&#39;assorbanza, ε è il coefficiente di estinzione, c è la concentrazione, ed L è la lunghezza del percorso). La lunghezza del percorso è di 0,1 cm per la NanoDrop. Le VNP-specifici coefficienti di estinzione sono: CPMV: 8.1 cm-1 mg 1 ml (a 260 nm) PVX: 2.97 cm-1 mg 1 ml (a 260 nm) TMV: 3.0 cm-1 mg 1 ml (a 260 nm) BMV: 5.15 cm-1 mg 1 ml (a 260 nm) </li></ol></li><li> Analizzare le particelle di dimensioni esclusione cromatografia liquida veloce proteine ​​(FPLC). <ol><li> Utilizzando un Superose 6 esclusione dimensionale e la colonna Explorer ÄKTA, carico 50-100 pg di VNPs in 200 pl di tampone fosfato di potassio 0,1 M (pH 7,0). </li><li> Impostare rivelatori a 260 nm (acido nucleico), 280 nm (proteine), e la lunghezza d&#39;onda di eccitazione di eventuali coloranti allegate. </li><li> A una velocità di flusso di 0,5 ml / min per 72 min. </li><li> Il profilo di eluizione e A260: A280 nm indica se la preparazione VNP è puro e se le particelle sono intatti e assemblati. Il seguente A260: 280 rapporti indicano una preparazione pura VNP: CPMV: 1.8 ± 0.1 PVX: 1,2 ± 0,1 TMV:1,1 ± 0,1 BMV: 1.7 ± 0.1 </li></ol></li><li> Eseguire la denaturazione (pre-cast NuPAGE) Bis-Tris poliacrilammide 4-12% elettroforesi su gel di pendenza di analizzare la purezza della preparazione e la coniugazione di proteine ​​di rivestimento individuali. <ol><li> Aggiungere 3 ml di tampone campione 4x LDS a 10 mg di particelle in 9 ml di tampone fosfato di potassio. Aggiungere un ulteriore 1 ml di tampone campione LDS 4x e 3 ml di β-mercaptoetanolo per BMV di ridurre l&#39;elevato numero di legami disolfuro. </li><li> Incubare in blocco termico per 5 minuti a 100 ° C. </li><li> Caricare i campioni su un gel SDS. </li><li> Eseguire i campioni a 200 V per 1 ora in esecuzione 1x MOPS buffer. </li><li> Documentare il gel sotto la luce UV per visualizzare proteine ​​di rivestimento fluorescenti. </li><li> Per non-proteina fluorescente, macchia con blu Coomassie (0,25% (w / v) Coomassie Brilliant Blue R-250, acido 30% (v / v) di metanolo, 10% (v / v) acetico) per 1 ora. </li><li> Decolorare con 30% metanolo, 10% acido acetico durante la notte. Change la soluzione, se necessario. </li><li> Documentare il gel sotto luce bianca. </li></ol></li><li> Analizzare l&#39;integrità delle particelle mediante microscopia elettronica a trasmissione (TEM). <ol><li> Diluire i campioni di 0,1-1 mg / ml in 20 ml di acqua deionizzata. </li><li> Mettere 20 gocce ul dei campioni su parafilm. </li><li> Coprire gocce con una griglia TEM e lasciate riposare per 2 min. Stoppino dalla soluzione in eccesso sulla griglia con carta da filtro. </li><li> Lavare griglia immissione in una goccia di acqua deionizzata quindi assorbente asciutto. </li><li> Stain griglia mettendo su una goccia 20 ml di 2% (w / v) di acetato di uranile per 2 min. Wick l&#39;eccesso macchia con carta da filtro. </li><li> Lavare rete ancora una volta in acqua. </li><li> Osservare griglia sotto un microscopio elettronico a trasmissione. </li></ol></li></ol> 4. Coniugazione chimica del VNPs con PEG e fluorofori, purificazione e caratterizzazione <ol><li> Per i calcoli per le reazioni di sotto, la massa molare dei VNPs sono: CPMV: 5.6x 10 6 g / mol PVX: 35 x 10 6 g / mol TMV: 41 x 10 6 g / mol BMV: 4,6 x 10 6 g / mol </li><li> Coniugare coloranti e PEG per lisine superficiali di CPMV e PVX usando un one-step N-idrossi succinimmide reazione di accoppiamento: Aggiungi 2500 equivalenti molari (tutti gli eccessi molari consultare eccesso molare per VNP) di Alexa Fluor 647 estere succinimidil e 4.500 equivalenti di NHS- PEG (MW 5000) disciolto in DMSO ad CPMV in 0,1 M tampone fosfato di potassio. Quando si lavora con PVX, aggiungere un eccesso molare di 10000 NHS-colorante e NHS-PEG. Regolare i volumi di tampone e DMSO tale che la concentrazione finale di CPMV e PVX è di 2 mg / ml di DMSO e il contenuto è 10% del volume totale di reazione. Incubare la miscela di reazione per una notte a temperatura ambiente al riparo dalla luce. CPMV e PVX avere 300 e 1270 lisine indirizzabili, rispettivamente. (Si rimanda ai seguenti riferimenti per ulteriori letturemodificazione chimica di CPMV e PVX: 13-15). </li><li> Coloranti Coniugato e PEG per tirosine di TMV con il raccordo di diazonio seguito da rame (I)-catalizzata azide-alchino cicloaddizione. <ol><li> Preparare sale di diazonio (alchini) mescolando 400 pl di 0,3 M p-toluensolfonico monoidrato, 25 pl di nitrito di sodio 3,0 M e 75 ml di 0,68 M distillata 3-ethynylaniline disciolto in acetonitrile a 4 ° C per 1 ora. </li><li> Aggiungere 3,3 ml di tampone borato, pH 8,8, contenente 100 mM NaCl a 1,25 ml di TMV (20 mg / ml di soluzione concentrata). </li><li> Reagiscono con il TMV 450 microlitri della sale di diazonio (alchini) soluzione in un bagno di ghiaccio per 3 ore per aggiungere una legatura alchino maniglia a TMV mediante accoppiamento di diazonio. La soluzione si trasformerà in un colore marrone chiaro. TMV ha 2140 tirosine disponibili per coniugazione. </li><li> Purificare il prodotto finale utilizzando un cuscino di saccarosio come descritto nel passaggio 4,4. </li><li> Collegare azide-funzionale Alexa Fluor 647 e PEG-azide (MW 5.000) using di rame (I)-catalizzata azide-alchino cicloaddizione (CuAAC). Aggiungere 2 equivalenti di coloranti e PEG-azide per proteina di rivestimento e incubare con 1 mM CuSO 4, 2 mM AMG, e 2 mM ascorbato di sodio a temperatura ambiente per 15 min. Regolare il volume di accumulo tale che la concentrazione di reazione finale di TMV è di 2 mg / ml. (Si rimanda ai seguenti riferimenti per ulteriori approfondimenti sulla modificazione chimica di TMV: 16,17). </li></ol></li><li> Coniugare tinture per lisine e PEG per cisteine ​​di cisteina mutante BMV (cBMV): <ol><li> Aggiungere 2.000 equivalenti molari di Oregon verde 488 succinimmidil estere disciolti in DMSO al cBMV in 0,1 M TNKM tampone (50 mM Tris base, 50 mM NaCl, 10 mM KCl, 5 mM MgCl 2, pH 7,4). Regolare i volumi di tampone e DMSO tale che la concentrazione finale di BMV è 1 mg / ml di DMSO e il contenuto è 10% del volume totale di reazione. Incubare la miscela di reazione per una notte a 4 ° C al riparo dalla luce. </li><li> Particelle Purificare con centrifugafiltri fugati, come descritto al punto 4.4. </li><li> Aggiungere 2.000 eccesso molare di PEG-maleimmide (MW 2000) utilizzando le stesse condizioni di reazione come prima e incubare la miscela di reazione per 2 ore a 4 ° C. cBMV dispone di 180 lisine reattivi e cisteine. (Si rimanda ai seguenti riferimenti per ulteriori letture sulla modificazione chimica di BMV: 18). </li></ol></li><li> Purificazione: Passare la soluzione attraverso un cuscino di saccarosio al 40% (w / v) a 160.000 xg per 2,5 ore. Nuovamente sciogliere il precipitato in un tampone. In alternativa, dializza contro tampone appropriato con 10 kDa di cut-off filtri rotativi. </li><li> Caratterizzazione: VNPs pegilato e marcato in fluorescenza vengono analizzate utilizzando i metodi sopra descritti: UV / visibile spettroscopia, elettroforesi su gel SDS, FPLC e TEM (non mostrato, tuttavia, fare riferimento alle figure 6 e 7). </li></ol> 5. Targeting tumorale e imaging utilizzando un modello Xenograft mouse<ol><li> Cultura HT-29 cellule umane di cancro al colon in mezzo RPMI supplementato con 5% FBS, 1% di penicillina-streptomicina, e 1% di L-glutammina a 37 ° C in 5% CO 2 con 175 centimetri due fiasche di coltura cellulare. </li><li> Lavare le cellule due volte con PBS sterile e raccolto mediante incubazione con 5 ml di tripsina-EDTA a 37 ° C per 5 min. Inattivare la tripsina con 5 ml di terreno RPMI. Raccogliere le cellule per centrifugazione a 500 xg per 5 min. a 4 ° C e risospendere in fresco RPMI a 5x10 6 cells/50 medie microlitri (determinare il numero totale delle cellule con Trypan Blue e un emocitometro). Mescolare con un volume uguale di matrigel prima dell&#39;iniezione (mantenere tutte le soluzioni e reagenti sterile). </li><li> Procurarsi sei settimana fa NCR nu / nu topi e mantenerli su una dieta di erba medica gratuita per 2 settimane. [Nota:. Tutte le procedure di polizia deve essere approvato IACUC] indurre xenotrapianti tumorali mediante iniezione sottocutanea di 5x10 6 cells/100 pl / tumore nei fianchi (2 tumori / mouse) utilizzando un 18 1/2 calibro sterileago. Monitorare gli animali regolarmente. Misurare la dimensione del tumore, utilizzando pinze e lasciare i tumori di crescere fino a un volume medio di 20 mm 3 (entro i prossimi 12 giorni). Assegnare i topi a due gruppi diversi in modo casuale: PBS e VNP (n = 3 animali / gruppo / ora punto). Utilizzando una siringa da 28 ml uno scartamento insulina, somministrare per iniezione endovenosa vena della coda 100 pl di PBS sterile o 10 mg / kg formulazione VNP. </li></ol> Nota: esperimenti di coltura dei tessuti e gli studi con animali vivi non sarà dimostrato. Hands-on dimostrazione sarà limitata alla lavorazione dei tessuti e acquisizione dati. Per un riferimento sul modello HT-29 xenograft tumorale, si rimanda il lettore al rif. 19 Tre tecniche sono utilizzate per valutare tumore homing di VNPs: <ol start="4"><li> Imaging di fluorescenza utilizzando Maestro Imaging System: topi Sacrifice a tempi diversi (2, 24, e 72 ore) con emissioni di CO 2gas. Staccare gli animali e tutti gli organi principali accise (cervello, cuore, polmoni, milza, reni e fegato), insieme con i tumori sui fianchi, posizionare i tessuti su parafilm, e analizzare con strumenti di imaging di fluorescenza con eccitazione giallo e filtri di emissione (800 ms esposizione) per rilevare la presenza di segnali fluorescenti nei tessuti (derivato da A647 etichetta coniugato ai VNPs). Salvare le immagini e analizzare le intensità di fluorescenza utilizzando ImageJ 1.44o software ( <a href="http://imagej.nih.gov/ij" target="_blank">http://imagej.nih.gov/ij</a> ). Confrontare il modello della captazione delle VNPs nei tumori con altri tessuti importanti con il tempo. </li><li> Dopo l&#39;imaging, tagliare ogni tessuto a metà e incorporare una metà in OCT per l&#39;analisi crio-sezionamento e confocale. Raccogliere l&#39;altra metà in pre-pesati crio-fiale e immediatamente congelare utilizzando liquido N 2. Conservare a -80 ° C fino al momento per l&#39;ulteriore elaborazione. </li><li> Fluorescenza quantificazione: Recordone tessuti pesi. Scongelare tessuti congelati a temperatura ambiente e metterli in separati provette Falcon da 50 ml contenenti 1 ml di PBS. Utilizzo di un omogeneizzatore palmare tessuto, omogeneizzare i tessuti per 2-3 min in PBS poi trasferire l&#39;omogeneizzato ai tubi microcentrifuga. Centrifugare omogenati per 10 minuti a 13.000 xg per rimuovere tessuto non omogeneizzato. </li><li> Pipettare 100 pl del supernatante dai tessuti di ogni gruppo (formulazioni PBS e VNP / punti temporali) in una piastra a 384 UV ben nero. Valutare l&#39;intensità di fluorescenza (Ex / Em lunghezze d&#39;onda 600/665) utilizzando un lettore di piastre. Normalizzare i valori ottenuti fluorescenti dai pesi dei tessuti. </li><li> Immunoistochimica: Preparare crio-microtomo sezioni (10 micron) e conservare a -20 ° C. Stain sezioni di tessuto per nuclei cellulari (DAPI) e marcatore delle cellule endoteliali (coniugati con fluoresceina anti-topo CD31 anticorpo). Effettuare analisi di microscopia confocale per mappare la localizzazione vascolare e intra-tumorale di fluorescenza marcata VNPs. </li></ol> Nota: Questa procedura non sarà dimostrato, dati rappresentativi sono mostrati in Figura 8. Per un riferimento immunoistochimica ed i metodi di colorazione descritti, si rimanda il lettore al rif. 19

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<li>Schlick, T. L., Ding, Z., Kovacs, E. W., Francis, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual-surface+modification+of+the+tobacco+mosaic+virus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Dual-surface modification of the tobacco mosaic virus.</a> J. Am. Chem. Soc. 127, 3718-3723 (2005).</li>
<li>Yildiz, I., Tsvetkova, I., Wen, A. M., Shukla, S., Masarapu, M. H., Dragnea, B., Steinmetz, N. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+of+Brome+mosaic+virus+for+biomedical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22RSC+Advances%22%5BJournal%5D)">Engineering of Brome mosaic virus for biomedical applications.</a> RSC Advances. , (2012).</li>
<li>Brunel, F. M., Lewis, J. D., Destito, G., Steinmetz, N. F., Manchester, M., Stuhlmann, H., Dawson, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrazone+ligation+strategy+to+assemble+multifunctional+viral+nanoparticles+for+cell+imaging+and+tumor+targeting%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Lett%22%5BJournal%5D)">Hydrazone ligation strategy to assemble multifunctional viral nanoparticles for cell imaging and tumor targeting.</a> Nano Lett. 10, 1093-1097 (2010).</li>
<li>Shukla, S., Ablack, A., Wen, A., Lee, K., Lewis, J., Steinmetz, N. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+tumor+homing+and+tissue+penetration+of+the+filamentous+plant+viral+nanoparticle+Potato+virus+X%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Pharmaceutics%22%5BJournal%5D)">Increased tumor homing and tissue penetration of the filamentous plant viral nanoparticle Potato virus X.</a> Molecular Pharmaceutics. , (2012).</li>
<li>Chatterji, A., Ochoa, W., Shamieh, L., Salakian, S. P., Wong, S. M., Clinton, G., Ghosh, P., Lin, T., Johnson, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+conjugation+of+heterologous+proteins+on+the+surface+of+Cowpea+mosaic+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Bioconjug.+Chem%22%5BJournal%5D)">Chemical conjugation of heterologous proteins on the surface of Cowpea mosaic virus.</a> Bioconjug. Chem. 15, 807-813 (2004).</li>
</ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Questo protocollo fornisce un approccio per la modifica chimica di VNPs e delle loro applicazioni per imaging in vivo del tumore. Le tecniche di imaging di fluorescenza animale, quantificazione fluorescenza, l&#39;immunoistochimica e presentati in questa sede sono utili per lo studio di biodistribuzione e la valutazione del tumore homing. Queste tecniche forniscono informazioni importanti per quanto riguarda l&#39;accesso delle nanoparticelle al tumore attraverso l&#39;effetto EPR. Combinando i risultati dei va...

<table><tbody><tr><td colspan="4">&lt;em&gt;&lt;forte&gt;Produzione di VNP&lt;/strong&gt;&lt;/em&gt;</td></tr><tr><td>Camera per piante da interno</td><td>Percival Scientific</td><td>E-41L2</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;V. unguiculata&lt;/em&gt; semi (California black-eye n. 5)</td><td>Burpee</td><td>51771A</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;N. benthamiana&lt;/em&gt; semi</td><td></td><td></td><td>&lt;em&gt;I semi di N. benthamiana sono stati un dono dell'Istituto Salk. I semi vengono prodotti attraverso la propagazione vegetale.&lt;/em&gt;</td></tr><tr><td>Carborundum</td><td>Fisher</td><td>C192-500</td><td></td></tr><tr><td>Terriccio Pro-mix BX</td><td>Premier Horticulture</td><td>713400</td><td></td></tr><tr><td>Fertilizzante Jack's Professional 20-10-20 Peat-Lite</td><td>JR Peters</td><td>77860</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;em&gt;&lt;forte&gt;Attrezzatura&lt;/strong&gt;&lt;/em&gt;</td></tr><tr><td>rotore 50.2 Ti</td><td>Beckman</td><td>337901</td><td></td></tr><tr><td>rotore SW 32 Ti</td><td>Beckman</td><td>369694</td><td></td></tr><tr><td>Optima L-90K ultracentrifuga</td><td>Beckman</td><td>365672</td><td></td></tr><tr><td>rotore SLA-3000</td><td>Thermo Scientific</td><td>07149</td><td></td></tr><tr><td>rotore SS-34</td><td>Thermo Scientific</td><td>28020</td><td></td></tr><tr><td>Sorvall RC-6 Plus centrifuga</td><td>Thermo Scientific</td><td>46910</td><td></td></tr><tr><td>Bottiglia di polipropilene</td><td>Beckman</td><td>355607</td><td>Per rotore SLA-3000</td></tr><tr><td>Bottiglia in policarbonato</td><td>Beckman</td><td>357002</td><td>Per rotore SS-34</td></tr><tr><td>Tubo Ultra-Clear</td><td>Beckman</td><td>344058</td><td>Per gradiente di saccarosio e rotore SW 32 Ti</td></tr><tr><td>Bottiglia in policarbonato</td><td>Beckman</td><td>355618</td><td>Per la centrifugazione e rotore 50.2 Ti</td></tr><tr><td>spettrofotometro NanoDrop</td><td>Thermo Scientific</td><td>NanoDrop2000c</td><td></td></tr><tr><td>Sistema di gel preconfezionati PowerEase 500</td><td>Invitrogen</td><td>EI8675EU</td><td></td></tr><tr><td>Colonna a esclusione dimensionale Superose 6 10/300 GL (24 ml)</td><td>GE Healthcare</td><td>17-5172-01</td><td></td></tr><tr><td>&amp;#196;Cromatografo KTA Explorer 100</td><td>GE Healthcare</td><td>28-4062-66</td><td></td></tr><tr><td>Allegra X-12R</td><td>Beckman</td><td>392302</td><td>Centrifuga da banco</td></tr><tr><td>Criocongelatore</td><td>Leica</td><td>CM1850</td><td></td></tr><tr><td>Maestro 2</td><td>Caliper Life Sciences</td><td></td><td>&lt;em&gt;in vivo&lt;/em&gt; sistema di imaging</td></tr><tr><td>Tissue-Tearor</td><td>Biospec Products</td><td>985370-395</td><td></td></tr><tr><td>Lettore di micropiastre</td><td>Tecan</td><td>Infinite-200</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio elettronico a trasmissione</td><td>ZEISS</td><td>Libra 200FE</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio confocale a scansione laser FluoView</td><td>Olympus</td><td>FV1000</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;em&gt;&lt;forte&gt;Prodotti chimici e reagenti&lt;/strong&gt;&lt;/em&gt;</td></tr><tr><td>3-etinilanilina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>498289-5G</td><td></td></tr><tr><td>Piastra nera a 384 pozzetti</td><td>BD Biosciences</td><td>353285</td><td></td></tr><tr><td>Gel elettroforetico SDS-PAGE NuPAGE Bis-Tris 4-12%</td><td>Invitrogen</td><td>NP0321BOX</td><td></td></tr><tr><td>Tampone di campionamento 4X LDS</td><td>Invitrogen</td><td>NP0008</td><td></td></tr><tr><td>Acido acetico</td><td>Fisher</td><td>A385-500</td><td></td></tr><tr><td>Acetonitrile</td><td>Sigma Aldrich</td><td>271004-1L</td><td></td></tr><tr><td>azide Alexa Fluor 647</td><td>Invitrogen</td><td>A10277</td><td></td></tr><tr><td>acido carbossilico Alexa Fluor 647, estere succinimidilico</td><td>Invitrogen</td><td>A20006</td><td></td></tr><tr><td>Filtri centrifughi Amicon Ultra-0,5 ml</td><td>Millipore</td><td>UFC501096</td><td>cutoff di 10 kDa</td></tr><tr><td>Aminoguanidina cloridrato</td><td>Acros Organics</td><td>36891-0250</td><td></td></tr><tr><td>Acido borico</td><td>Fisher</td><td>A74-500</td><td></td></tr><tr><td>Coomassie Brilliant Blue R-250</td><td>Fisher</td><td>BP101-25</td><td></td></tr><tr><td>CsCl</td><td>Acros Organics</td><td>42285-1000</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>MP Biomedicals</td><td>157574</td><td></td></tr><tr><td>Dimetilsolfossido</td><td>Fisher</td><td>BP231-100</td><td></td></tr><tr><td>Carta da filtro</td><td>Fisher</td><td>09-801K</td><td>Grado P5</td></tr><tr><td>FITC anti-topo CD31</td><td>BioLegend</td><td>102406</td><td></td></tr><tr><td>Siero di capra</td><td>Invitrogen</td><td>16210-064</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Fisher</td><td>BP366-500</td><td></td></tr><tr><td>sale sodico dell'acido L-ascorbico</td><td>Acros Organics</td><td>35268-0050</td><td></td></tr><tr><td>Metanolo</td><td>Fisher</td><td>A412P-4</td><td></td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Fisher</td><td>BP214-500</td><td></td></tr><tr><td>Vetrini per microscopio</td><td>Fisher</td><td>12-544-3</td><td></td></tr><tr><td>Vetrino coprioggetto per microscopio</td><td>VWR</td><td>48366-277</td><td></td></tr><tr><td>tampone MOPS</td><td>Invitrogen</td><td>NP0001</td><td></td></tr><tr><td>mPEG-mal</td><td>Nanocs</td><td>PG1-ML-2k</td><td>PM 2000</td></tr><tr><td>mPEG-N3</td><td>Nanocs</td><td>PG1-AZ-5k</td><td>PM 5000</td></tr><tr><td>mPEG-NHS</td><td>Nanocs</td><td>PG1-SC-5k</td><td>PM 5000</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher</td><td>BP358-212</td><td></td></tr><tr><td>Oregon Green 488 estere succinimidilico *isomero 6*</td><td>Invitrogen</td><td>O-6149</td><td></td></tr><tr><td>acido p-toluensolfonico monoidrato</td><td>Acros Organics</td><td>13902-0050</td><td></td></tr><tr><td>Permount</td><td>Fisher</td><td>SP15-100</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato di potassio bibasico</td><td>Fisher</td><td>BP363-1</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato monopotassico</td><td>Fisher</td><td>BP362-1</td><td></td></tr><tr><td>acetato di sodio</td><td>Fisher</td><td>BP333-500</td><td></td></tr><tr><td>nitrito di sodio</td><td>Acros Organics</td><td>42435-0050</td><td></td></tr><tr><td>Solfito di sodio</td><td>Amresco</td><td>0628-500G</td><td></td></tr><tr><td>Saccarosio</td><td>Fisher</td><td>S6-500</td><td></td></tr><tr><td>griglia per microscopia elettronica a trasmissione</td><td>Ted Pella</td><td>FCF-400Cu</td><td></td></tr><tr><td>Tris base</td><td>Fisher</td><td>BP152-500</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>EMD Chemicals</td><td>TX1568-1</td><td></td></tr><tr><td>&amp;#946;-mercapto&amp;#8211;etanolo</td><td>Fisher</td><td>O3446I-100</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;em&gt;&lt;forte&gt;Coltura cellulare&lt;/strong&gt;&lt;/em&gt;</td></tr><tr><td>siero fetale bovino</td><td>Invitrogen</td><td>12483-020</td><td></td></tr><tr><td>Emocitometro</td><td>Fisher</td><td>0267110</td><td></td></tr><tr><td>Cellule HT-29</td><td>ATCC</td><td>HTB-38</td><td></td></tr><tr><td>L-glutammina</td><td>Invitrogen</td><td>25030-080</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Cellgro</td><td>21-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>Penicillina-streptomicina</td><td>Invitrogen</td><td>10378-016</td><td></td></tr><tr><td>RPMI-1640</td><td>Invitrogen</td><td>31800-089</td><td></td></tr><tr><td>Flaconi per coltura cellulare</td><td>Corning</td><td>431080</td><td>175 cm&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt;</td></tr><tr><td>Trypan Blue</td><td>Thermo Scientific</td><td>SV30084.01</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina, 0,05% (1X) con EDTA 4Na, liquido</td><td>Invitrogen</td><td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;em&gt;&lt;forte&gt;Studi sugli animali&lt;/strong&gt;&lt;/em&gt;</td></tr><tr><td>Dieta per roditori con 18% di proteine</td><td>Harlan Teklad</td><td>Teklad Global 2018S</td><td>Dieta priva di erba medica</td></tr><tr><td>Siringa per insulina</td><td>BD Biosciences</td><td>329410</td><td>ago da 28 gauge</td></tr><tr><td>Isoflurano</td><td>Baxter</td><td>AHN3637</td><td></td></tr><tr><td>Matrice di membrana basale Matrigel</td><td>BD Biosciences</td><td>356234</td><td></td></tr><tr><td>Topi NCR nu/nu</td><td></td><td></td><td>Scuola CWRU&lt;br/&gt; della Facoltà di Medicina, Struttura Centrale per Animali Atimici e Trapianti eterologhi</td></tr><tr><td>Siringa sterile</td><td>BD Biosciences</td><td>305196</td><td>18 1/2 gauge</td></tr><tr><td>Tissue-Tek CRYO-OCT Compound</td><td>Andwin Scientific</td><td>4583</td><td></td></tr></tbody></table>

nanoparticelle virali per<em&gt; in vivo</em&gt; imaging tumore

Viral Nanoparticles for In vivo Tumor Imaging

L&#39;uso di nanomateriali ha il potenziale per rivoluzionare scienza dei materiali e della medicina. Attualmente, un certo numero di differenti nanoparticelle sono stati studiati per applicazioni di imaging e terapia. Nanoparticelle virali (VNPs) derivati ​​da piante può essere considerata autoassemblati bionanomaterials con dimensioni e forme definite. Virus di piante in esame in laboratorio Steinmetz sono particelle formate icosaedrici dal virus del mosaico Cowpea (CPMV) e virus del mosaico Brome (BMV), entrambi i quali sono 30 nm di diametro. Stiamo anche sviluppando strutture a forma di bastoncello e filamentose derivati ​​dai virus delle piante seguenti: virus del mosaico del tabacco (TMV), che costituisce aste rigide con dimensioni di 300 nm da 18 nm, e Virus X della patata (PVX), che formano le particelle filamentose 515 nm di lunghezza e 13 nm in larghezza (si rimanda il lettore al refs. 1 e 2 per ulteriori informazioni sulla VNPs). <p class="jove_content"&gt; Dal punto uno scienziato dei materiali di vista, VNPs sono elementi interessanti per diversi motivi: le particelle sono monodisperse, può essere prodotta con facilità su larga scala in planta, sono eccezionalmente stabili e biocompatibili. Inoltre, VNPs sono &quot;programmabili&quot; unità, che possono essere specificamente progettati utilizzando modificazione genetica o metodi chimici bioconjugation 3. La struttura di VNPs è noto risoluzione atomica, e modifiche possono essere effettuate con precisione spaziale a livello atomico 4, un livello di controllo che non può essere raggiunto utilizzando nanomateriali di sintesi con le attuali state-of-the-art. In questo articolo, si descrive la propagazione di CPMV, PVX, TMV, e BMV a Vigna ungiuculata e piante di Nicotiana benthamiana. Protocolli di estrazione e purificazione di ogni VNP sono dati. Metodi per la caratterizzazione dei purificato e VNPs chimicamente etichettati sono descritti. In questo studio, ci concentriamo su chetichettatura emical di VNPs con fluorofori (es. Alexa Fluor 647) e polietilenglicole (PEG). I coloranti facilitare il monitoraggio e la rilevazione dei VNPs 5-10, e PEG riduce immunogenicità delle nanoparticelle proteici migliorando loro farmacocinetica 8,11. Dimostriamo tumore homing di VNPs pegilati utilizzando un modello di topo xenotrapianto del tumore. Una combinazione di imaging di fluorescenza di tessuti ex vivo utilizzando Maestro Imaging System, quantificazione fluorescenza nei tessuti omogeneizzati, e microscopia confocale viene utilizzato per studiare biodistribuzione. VNPs vengono cancellati tramite il sistema reticolo-endoteliale (RES); tumore homing avviene passivamente attraverso la permeabilità maggiore e ritenzione (EPR) effetto 12. La nanotecnologia VNP è un potente plug-and-play della tecnologia per l&#39;immagine e il trattamento di siti di malattia in vivo. Stiamo sviluppando ulteriormente VNPs portare carichi di droga e frazioni di imaging clinicamente rilevanti, così come tessuto-specifici ligandi dibersaglio i recettori molecolari sovraespresse nel cancro e malattie cardiovascolari.

<img alt="Analisi comparativa della crescita delle piante; configurazione sperimentale, studio della variazione del colore delle foglie, metodo della clorosi." src="/files/ftp_upload/4352/4352fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figura 1"> 
 Figura 1. Piante infette da virus vegetali. Piante di Vigna unguiculata infette con CPMV (A). Piante di Nicotiana benthamiana infette con PVX (B), TMV (C) e BMV (D). Le immagini sono state sc...

Nanoparticelle vegetali virali (VNPs) sono promettenti piattaforme per le applicazioni in campo biomedico. Qui, descriviamo le modalità di propagazione delle piante VNP, purificazione, caratterizzazione e bioconjugation. Infine, mostriamo l&#39;applicazione di VNPs per homing tumore e immagini utilizzando un modello di xenotrapianto mouse e imaging di fluorescenza.

Nanoparticelle virali per<em&gt; In vivo</em&gt; Imaging Tumore

L'impiego di nanomateriali ha il potenziale di rivoluzionare la scienza dei materiali e la medicina. Attualmente, un numero di diverse nanoparticelle è in fase di...

L'obiettivo generale di questa procedura è studiare in vivo il targeting tumorale e la biodistribuzione di nanoparticelle virali marcate con fluorocromi. Nei modelli murini di tumore, inizialmente coltivare e purificare il virus, quindi coniugare i coloranti e il PEG alle particelle. Dopo aver caratterizzato le particelle funzionalizzate, procedere con l'iniezione nei topi portatori di xenotrapianti tumorali.I risultati ottenuti dall'imaging con Maestro, dalle misurazioni dell'intensità di fluorescenza, dall'omogeneità del tessuto e dall'immunofluorescenza mostrano il localizzarsi delle nanoparticelle virali nel tumore e in vari organi lungo tutto il corpo. Piattaforma. Le nanoparticelle o i BMP rappresentano piattaforme promettenti per applicazioni in biomedicina. Qui descriviamo le procedure per il PLA VMP, la propagazione, la purificazione, la caratterizzazione e la coniugazione intestinale.Infine, mostriamo l'applicazione di V mps per l'omotassi tumorale e l'imaging mediante un modello di trapianto malino e l'imaging a fluorescenza. Attualmente, un certo numero di nanoparticelle diverse sta venendo studiato per applicazioni in imaging e terapia. I principali vantaggi dell'uso d

viral-nanoparticles-for-in-vivo-tumor-imaging

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Bioingegneria

Vi presentiamo un nuovo approccio per quantificare la localizzazione delle nanoparticelle nei vasi di tumori umani xenotrapiantati utilizzando dinamica, imaging in tempo reale intravitale in un modello di embrione aviaria.

Valutazione della captazione nanoparticelle nei tumori in tempo reale utilizzando intravitale Imaging

Fonte: Kim, B. D., et al. Consegna di nanoparticelle di un carico utile di oligonucleotidi in un modello animale di glioblastoma multiforme. J. Vis. Exp. (2024)Questo video mostra l'iniezione endovenosa di nanoparticelle terapeutiche in un topo portatore di glioblastoma. Il metodo consente la somministrazione mirata attraverso la barriera emato-encefalica e supporta l'imaging non invasivo per valutare la biodistribuzione delle nanoparticelle e l'efficacia terapeutica nei tumori cerebrali.

Somministrazione endovenosa di nanoparticelle terapeutiche in un modello di glioblastoma murino

Il video dimostra un metodo di imaging a fluorescenza per la localizzazione di anticorpi in vivo in un modello di xenotrapianto tumorale di topo. Prevede l'iniezione di cellule tumorali in un topo per generare xenotrapianti solidi sotto la pelle. La successiva iniezione di anticorpi fluorescenti conferma la localizzazione specifica attraverso segnali di fluorescenza potenziati all'interno dello xenotrapianto tumorale.

Imaging a fluorescenza in vivo per localizzare gli anticorpi in un modello di xenotrapianto tumorale di topo

Questo video dimostra una tecnica che coinvolge un radioimmunoconiugato per l'imaging in vivo di un tumore in un modello murino. Dopo l'iniezione del radioimmunoconiugato, gli anticorpi del coniugato si legano a uno specifico antigene di membrana sulle cellule tumorali. Il radiotracciante del coniugato emette positroni che interagiscono con gli elettroni vicini per produrre energia, che viene rilevata da uno scanner per tomografia a emissione di positroni (PET) per creare un'immagine del tumore.

Una tecnica di imaging PET in vivo per rilevare tumori in un modello murino utilizzando anticorpi radiomarcati

Questo articolo descrive le procedure per l'analisi di immagini ottiche delle nanoparticelle tumore-mirato, Herdox. In particolare, l'uso dettagliato del dispositivo di imaging multimodale per la rilevazione del tumore orientare e valutare la penetrazione del tumore è descritta qui.

Analisi delle Targeted proteina virale nanoparticelle distribuito HER2 + Tumori

Questo protocollo delinea i passaggi necessari per eseguire la convalida ex vivo di esperimenti di imaging di xenotrapianto a fluorescenza nel vicino infrarosso in vivo nei topi utilizzando nanocorpi marcati con fluorofori e anticorpi convenzionali.

Validazione di Nanobody e anticorpi Based<em&gt; In Vivo</em&gt; Esperimenti tumore xenotrapianto NIRF imaging nei topi mediante<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Citometria di flusso e microscopia

La scarsa comprensione delle prestazioni in vivo delle nanomedicine ostacola la loro traduzione clinica. Qui sono descritte le procedure per valutare il comportamento in vivo dei nanofarmaci antitumorali a livello sistemico, tissutale, di singola cellula e subcellulare in topi immunocompetenti portatori di tumore. Questo approccio può aiutare i ricercatori a identificare promettenti nanofarmaci antitumorali per la traduzione clinica.

Una procedura completa per valutare il<em&gt; In Vivo</em&gt; Prestazioni del Cancro nanomedicina

Descriviamo un protocollo per il rilevamento di preclinici in vivo della metastasi del cancro. Si basa su un reporter del radionuclide-fluorescenza combinando lo symporter dello ioduro di sodio, rilevato da non-invasiva [18F] tetrafluoroborate-PET e una proteina fluorescente per semplificata ex vivo conferma. Il metodo è applicabile per preclinici in vivo delle cellule di rilevamento di là di biologia del tumore.

Del radionuclide-fluorescenza Reporter Gene Imaging per monitorare la progressione del tumore nei modelli del roditore del tumore

Qui, presentiamo metodi dettagliati per la preparazione e la valutazione del vaccino tumorale nanoemulsione autoassemblato nasale in vitro e in vivo.

Preparazione, caratteristiche, tossicità e valutazione dell'efficacia del vaccino tumorale nanoemulsione autoassemblato nasale in vitro e in vivo

Presentiamo un nuovo approccio per la microscopia a due fotoni della somministrazione tumorale di nanoparticelle di ossido di ferro marcate con fluorescenza al glioblastoma in un modello murino.

Microscopia intravitale a due fotoni del glioblastoma in un modello murino

La barriera emato-encefalica è un ostacolo significativo nella somministrazione di terapie per il glioblastoma, una malattia per la quale non esiste una cura. Qui, riportiamo una nano piattaforma terapeutica di ossido di ferro guidata da immagini in vivo che può bypassare questa barriera fisiologica in virtù delle dimensioni e accumularsi nel tumore.

Consegna di nanoparticelle di un carico utile di oligonucleotidi in un modello animale multiforme di glioblastoma

Impara il targeting tumorale e l'imaging in vivo utilizzando nanoparticelle virali fluorescenti in modelli murini xenotrapiantati. Questo metodo permette di studiare la biodistribuzione e le potenziali applicazioni terapeutiche.

Nanoparticelle virali per

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