Nanoparticelle virali per In vivo Imaging Tumore

L'obiettivo generale di questa procedura è studiare il targeting tumorale in vivo e la biodistribuzione di nanoparticelle virali marcate in fluorescenza. Nei modelli tumorali murini prima propagano e purificano il virus, quindi coniugano i coloranti e si attaccano alle particelle. Dopo aver caratterizzato le particelle funzionalizzate, procedere all'iniezione in topi con xenotrapianti tumorali.

I risultati dell'imaging maestro, dell'intensità della fluorescenza, delle misurazioni dell'omogeneità dei tessuti e dell'immunofluorescenza mostrano la localizzazione delle nanoparticelle virali nel tumore e in vari organi in tutto il corpo. Piattaforma. Le nanoparticelle o BMP sono piattaforme promettenti per applicazioni in biomedicina. Qui descriviamo le procedure per il PLA VMP, la propagazione, la caratterizzazione della purificazione e la coniugazione intestinale.

Infine, mostriamo l'applicazione di V mps per l'homing e l'imaging tumorale utilizzando un modello di innesto di malino e imaging a fluorescenza. Attualmente, un certo numero di nanoparticelle diverse sono in fase di studio per applicazioni nell'imaging e nella terapia. I principali vantaggi dell'utilizzo di nanoparticelle biologiche rispetto a materiali sintetici come i nanomateriali metallici o polimerici è che i BMP delle piante sono dispersi nei monitor e le loro strutture sono note alla risoluzione atomica.

I virus delle piante possono essere prodotti su larga scala attraverso l'agricoltura molecolare e sono modificabili sia dall'ingegneria genetica che da quella chimica. In questa dimostrazione, mostriamo la modifica chimica delle nanoparticelle virali con Fluor fours e peg. Il Fluor fours sarà utilizzato per il miglioramento dell'imaging e il PEG sarà utilizzato per migliorare la farmacocinetica.

Le modifiche chimiche possono essere estese per caricare nanoparticelle virali con terapie e agenti di contrasto per l'imaging clinico come la risonanza magnetica. Qui abbiamo dimostrato lo studio della biodistribuzione di nanoparticelle virali ate come altre nanoparticelle. Il ronzio tumorale di V NPS si basa su una maggiore permeabilità e ritenzione, che viene descritta come homemaking passivo del tumore.

Recentemente abbiamo scoperto che i profili di biodistribuzione dei diversi virus delle piante sono distinti. Per questa dimostrazione, utilizzeremo il virus della copia mosa, che è considerato il gold standard per la tecnologia N virale. Abbiamo un particolare interesse per lo sviluppo, l'ingegnerizzazione e lo studio dei nanomateriali provenienti da virus vegetali.

Il mio laboratorio si concentra sull'acquisizione di una comprensione fondamentale di come il virus del mosaico Ed cow p, il virus del mosaico del bro, il virus del mosaico del bacca a forma di roccia e il virus filamentoso della patata X interagiscono con il sistema dei mammiferi. In particolare, ci piace imparare in che modo la forma e la flessibilità influiscono sulle proprietà degli EVO e come adattarle al meglio per applicazioni come l'imaging tessuto-specifico e la somministrazione di farmaci. Questo manoscritto descrive in dettaglio la preparazione del virus del mosaico kalp, del virus della patata X, del virus del mosaico bruno e del virus del mosaico del tabacco.

Da Vic, Gil e Nicotiana, descriviamo la loro funzionalizzazione e applicazione in un modello murino preclinico. In questa dimostrazione, utilizzeremo il virus del mosaico P della mucca in una camera di incubazione interna. Pianta tre semi di mucca P per vaso.

Il giorno 10, infettare ogni foglia con 0,1 microgrammi per microlitro di CPMV mediante inoculazione meccanica utilizzando una leggera spolverata di carum seguita da un leggero sfregamento delle foglie. Dopo 10 giorni, raccogli le foglie e conservale a una temperatura negativa di 80 gradi Celsius. In un frullatore standard, omogeneizzare 100 grammi di foglie congelate in due volumi di tampone fosfato di potassio molare freddo 0,1 molare pH sette, filtrare l'omogeneizzato attraverso tre strati di garza e centrifugare a 5.500 G per 20 minuti.

Raccogliere il surnatante, quindi eseguire un'estrazione organica del materiale vegetale con 0,7 volumi di cloroformio uno a uno per un butanolo, mescolando la miscela per almeno 30 minuti. Dopo aver centrifugato la soluzione a 5, 500 G per 20 minuti. Raccogliere la fase acquosa superiore e ultracentrifugare.

Aggiungere 160.000 g per tre ore. Quindi, risospendere il pellet in cinque millilitri di tampone fosfato e incubare il campione a quattro gradi Celsius durante la notte. Inoltre, prepara un gradiente di saccarosio dal 10 al 40% utilizzando un volume uguale di 10, 20, 30 e 40% di saccarosio in tampone.

Posizionando prima il più pesante, equilibrare il gradiente per una notte a temperatura ambiente. Sovrapporre la palette RESUSPENDED sul gradiente di saccarosio e centrifugare a 100.000 G per due ore. Raccogliere la banda di diffusione della luce e dializzare contro il tampone per coniugare i coloranti e fissare i residui di lisina superficiale a 2.500 equivalenti molari di Fluor e 4.500 equivalenti di NHS PEG a CPMV.

Dopo aver purificato la reazione, misurare lo spettro di assorbanza di due microlitri di campione utilizzando la nano goccia, annotando i valori a 260, 280 e 651 nanometri. Procedere con l'analisi delle particelle in base alle dimensioni, all'esclusione, alla cromatografia liquida rapida delle proteine per una colonna di esclusione super oh a sei dimensioni e ACTA Explorer carica da 50 a 100 microgrammi del campione VNP. In 200 microlitri di tampone fosfato di potassio molare 0,1 molare.

Il pH 7,0 imposta i rivelatori a 260 nanometri per gli acidi nucleici e 280 nanometri per le proteine. Impostare anche la lunghezza d'onda di assorbanza di tutti i coloranti attaccati. Eseguire la separazione a una velocità di flusso di 0,5 millilitri al minuto per 72 minuti.

Il profilo Elluciano nel rapporto 2 62 80 indica se la reazione è pura e che le V NPS sono completamente assemblate e intatte. Successivamente, preparare un'elettroforesi su gel SDS denaturante per analizzare la coniugazione alle singole proteine del rivestimento. Per ogni campione, aggiungere tre microlitri di quattro tampone XLDS a 10 microgrammi di particelle in nove microlitri di tampone fosfato di potassio denaturare in un blocco termico per cinque minuti a 100 gradi Celsius.

Caricare i campioni su un gel SDS e farlo funzionare a 200 volt per un'ora. In uno X mop tampone in esecuzione documentare il gel sotto luce bianca. Dopo la colorazione, queste nanoparticelle virali sono ora pronte per il targeting del tumore e l'imaging utilizzando un modello murino di xenotrapianto.

Tipicamente, utilizziamo un'iniezione della vena caudale per somministrare queste particelle e per via endovenosa per valutare l'homing tumorale di VN ps. Analizzare i tessuti con lo strumento di imaging a fluorescenza maestro. Utilizzare filtri di eccitazione ed emissione gialli con esposizione di 800 millisecondi per rilevare la presenza di segnali fluorescenti derivati dall'etichetta A 6 47 coniugata al VN PS per la quantificazione della fluorescenza.

Omogeneizzare i tessuti per due o tre minuti in PBS. Quindi trasferire le provette omogenee per ciascuna formulazione di PBS e VNP per punto temporale, trasferire 100 microlitri di campione di Senna in una piastra UV nera a 384 pozzetti. Misura l'intensità della fluorescenza utilizzando una lunghezza d'onda di eccitazione ed emissione di sei e 665 nanometri.

Il successo della propagazione del VNP può essere determinato dalla comparsa di sintomi a mosaico sulle foglie circa una settimana dopo l'inoculazione meccanica. La spettroscopia UV visibile può essere utilizzata per valutare la purezza delle particelle. L'assorbanza a 260 nanometri è proporzionale alla concentrazione di acido nucleico e l'assorbanza a 280 nanometri è proporzionale alla concentrazione proteica.

Questi profili di eluizione per esclusione dimensionale di VN PS sono stati ottenuti utilizzando un purificatore Superos a sei colonne e ACTA. Come per gli spettri visibili UV, il rapporto A due 60 a due 80 può essere utilizzato per valutare la purezza delle preparazioni VNP. Inoltre, il profilo eluciano può essere utilizzato per determinare la purezza delle particelle.

L'elettroforesi su gel SDS separa le subunità proteiche del rivestimento denaturate. Le particelle CPMV sono formate da due proteine, una grande proteina da 42 kilodalton e una piccola proteina da 24 kilodalton. Nota. La proteina più piccola ha due forme elettroforetiche in queste immagini TEM di particelle virali.

Le griglie TEM sono state colorate negativamente con acetato di orinatoio al 2%, in modo che le particelle appaiano chiare su uno sfondo scuro. Le particelle CPMV hanno una dimensione di 30 nanometri. Il V NPS può quindi essere funzionalizzato tramite chimica bioconiugata.

Ad esempio, i CPMV contengono lisine che possono essere utilizzate per reagire con gli esteri NHS funzionalizzati per confermare la funzionalizzazione della caratterizzazione delle NPS V utilizzando gli stessi metodi precedentemente eseguiti per le particelle purificate. Si tratta di dati rappresentativi di VN ps marcato in fluorescenza e pegilato. Le particelle funzionalizzate possono quindi essere utilizzate per applicazioni a valle, come lo studio della biodistribuzione e dell'homing tumorale con VN ps pegilato e marcato con coscia.

Qui, la biodistribuzione di CPMV viene valutata in topi nudi impiantati con xenotrapianti umani HT 29 e l'homing tumorale viene valutato utilizzando l'imaging maestro dei tessuti. Ex vivo non è stata osservata alcuna fluorescenza per il controllo PBS. Mentre per il CPMV coniugato con un 6 47 e un peg, c'era una fluorescenza prominente nel fegato e un po' nella milza a causa della pulizia da parte del sistema reticoloendoteliale.

Una fluorescenza prominente nel tumore indica l'homing tumorale attraverso l'aumento della permeabilità e dell'effetto di ritenzione. Questi dati quantitativi sono stati ottenuti tramite misurazione della fluorescenza di tessuti omogeneizzati normalizzati in base al peso tissutale. Come previsto, i dati indicano la clearance del CPMV da parte del fegato e della milza.

Il CPMV viene rilevato anche nel tumore. Un'ulteriore localizzazione intratumorale mediante immunocolorazione di tessuti criosezionati mostra la localizzazione intratumorale di CPMV. Il CPMV è mostrato in rosso.

Il blu sono i nuclei e il verde è un vaso sanguigno colorato con anti CD 31. Il CPMV è stato trovato principalmente vicino al sistema vascolare del tumore. Le tecniche descritte hanno portato l'applicabilità a una varietà di sistemi di bio nanoparticelle.

Il laboratorio Stein studia i VMP, come il virus del mosaico della mucca, il virus del mosaico del bro, il virus X della patata e il virus del mosaico del tabacco. Le metodologie, tuttavia, potrebbero essere applicate a qualsiasi altra nanoparticella virale o nanostruttura proteica come le proteine da shock termico. Seguendo questa procedura, è possibile eseguire metodi aggiuntivi come R-T-P-C-R o Western Block come metodi indipendenti.

La criosezione e l'immunoistochimica possono essere utilizzate per ottenere ulteriori informazioni sulla posizione intratumorale delle v ps e sulla potenziale colocalizzazione con macrofagi associati al tumore o altri organelli. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come propagare, purificare, funzionalizzare e caratterizzare le nanoparticelle virali e come studiare la distribuzione in vivo utilizzando un modello murino tumorale.