Misurazione quantitativa della risposta immunitaria e nel sonno

L'obiettivo generale del seguente esperimento è valutare il sonno e la funzione immunitaria in Drosophila. Questo viene innanzitutto ottenuto registrando l'attività locomotoria delle mosche infette per misurare il sonno e la sopravvivenza; in un secondo passaggio, dopo l'infezione, le mosche vengono omogeneizzate, diluite e seminate su piastre di agar LB. Il numero di unità formanti colonie che si sviluppano indica la capacità delle mosche di eliminare l'infezione.

Successivamente, moscerini infetti che esprimono un transgene contenente il reporter della luciferasi NF kappa b vengono aggiunti a una piastra a 96 pozzetti contenente la luciferina, il substrato della luciferasi. La misurazione in tempo reale della luciferasi kappa b indica l'attivazione di una via di segnalazione NF kappa B durante l'infezione, nel complesso l'esito relativo al sonno e alla sopravvivenza. La capacità di eliminazione dei batteri e l'attività del reporter NF KB sono parametri che forniscono informazioni meccanicistiche sul collegamento molecolare tra funzione immunitaria e comportamento.

Generalmente, le persone alle prime armi con questo metodo incontrano difficoltà perché è necessario del tempo e molta pratica per imparare a infettare manualmente le mosche in modo costante. Il principale vantaggio della tecnica con il reporter Lucifer rispetto ai metodi esistenti, come la QPCR, è che l'attività di NF Kappa B può essere misurata in modo continuo in tempo reale nei soggetti vivi. Iniziare incubando colture di Drosophila allo stadio pupale avanzato per tre o quattro giorni, in modo che gli adulti si adattino alle condizioni ambientali.

Qui le mosche vengono poste in condizioni di luce costante per eliminare l'influenza dell'orologio circadiano sulla risposta immunitaria e sul comportamento. Successivamente, caricate una a quattro mosche di un giorno in monitor di attività. Registrare la loro attività per un minimo di tre giorni prima dell'infezione, un giorno prima dell'infezione programmata.

Scegliere una singola colonia di SIA con una punta di pipetta sterile ed immergere la punta in un tubo di coltura contenente cinque millilitri di terreno LB per verificare la tecnica asettica. Non dimenticare di preparare una coltura controllo fittizia senza batteri. Far crescere i batteri durante la notte fino al raggiungimento della fase esponenziale di crescita il giorno successivo.

Misurare l'assorbanza della coltura a 600 nanometri. Includere un secondo Q vet come bianco. La coltura è pronta quando la concentrazione è compresa tra 0,5 e 1 unità di assorbanza, oppure prolungare il tempo di coltura secondo necessità.

Ora preparare la soluzione batterica per infettare le mosche. Diluire i batteri con PBS fino a un'assorbanza prevista di 0,1 a 600 nanometri. Quindi aggiungere un colorante alimentare come controllo per l'iniezione.

Sostituire i batteri con mezzo LB. Conservare entrambe le soluzioni sul ghiaccio. Successivamente, utilizzando un tiratore di micropipette, preparare aghi per iniezione con una punta fine sotto un microscopio stereoscopico.

Utilizzare pinzette fini per staccare la punta di ciascun ago in modo che l'apertura sia sufficientemente ampia da poter essere riempita con il liquido di iniezione mediante aspirazione, ma abbastanza piccola da ridurre al minimo i danni alla mosca. Fissare un ago di vetro a una siringa di plastica da tre cc mediante un tratto di tubo utilizzando la siringa. Il flusso del mezzo di iniezione è controllato manualmente.

Evitare di contaminare il tubo di gomma con il liquido di iniezione poiché l'apparato della siringa viene utilizzato sia per iniezioni infettive che per iniezioni di controllo. Verificare il flusso del mezzo di iniezione utilizzando un fazzoletto di carta Kim. Due aspetti fondamentali per il successo delle iniezioni sono l'utilizzo della dimensione ottimale dell'ago e la tenuta stagna tra l'ago e la siringa.

Una volta che il sistema di iniezione è completamente preparato, anestetizzare le mosche utilizzando un flusso minimo di anidride carbonica, procedendo rapidamente in modo che nessuna mosca rimanga anestetizzata per più di cinque minuti. Iniettare ora le mosche inserendo l'ago di vetro nella regione sopra lo scutello del torace dorsale. L'ingresso del mezzo di iniezione nella mosca viene verificato grazie al colorante alimentare, che risulta visibile mentre la soluzione iniettata si diffonde.

Prima di iniziare, assicurarsi che tutti i materiali utilizzati per questa procedura siano stati sterilizzati in autoclave almeno un giorno in anticipo. Preparare piastre di Petri da 10 centimetri con mezzo agar LV. Nel giorno dell'esperimento, anestetizzare e trasferire le mosche in provette centrifughe da 1,5 millilitri.

Preparare almeno due gruppi di 10 moscerini ciascuno per ogni condizione sperimentale. Preparare anche un gruppo di controllo di moscerini non infetti, in particolare quando si utilizza un ceppo batterico privo di resistenza agli antibiotici. Conservare tutte le provette caricate sul ghiaccio.

Successivamente, aggiungere 400 microlitri di mezzo LB in ogni provetta contenente le mosche. Omogeneizzare le mosche utilizzando un piccolo pestello, operando vicino a una fiamma per prevenire contaminazioni. A questo punto, utilizzando le punte di pipetta tagliate, effettuare diluizioni seriali dell'omogenato di fattori 10 in volumi di 200 microlitri.

Se l'omogenato viene preparato immediatamente dopo l'infezione con sia, effettuare un'ulteriore diluizione fino a uno a 1000; tuttavia, per l'omogenato prelevato 24 ore dopo l'infezione, diluire fino a uno a 100.000. Successivamente, seminare le due diluizioni più elevate su piastre da 10 centimetri utilizzando sfere di vetro per garantire una distribuzione uniforme, quindi incubare le piastre per tutta la notte. Il giorno seguente, contare il numero di colonie presenti sulla piastra mediante osservazione diretta o tramite software di conteggio colonie.

Quindi calcolare il numero di unità formanti colonie per moscerino. Questo saggio utilizza moscerini transgenici portatori del reporter luciferasi kappa b al momento appropriato. Il saggio richiede inoltre batteri coltivati, come SCIA, preparati per iniezione come descritto nella sezione precedente.

Adattare le mosche alle condizioni sperimentali di illuminazione. In questo esempio, mosche di uno-quattro giorni con luciferasi kappa b vengono allevate in provette contenenti un mezzo alimentare di saccarosio al 5% e agar al 2%, e collocate in luce continua per due giorni. Preparare ora una micropiastra a 96 pozzetti per le mosche.

Riempire ogni pozzetto con due strati di cibo. Prima il mezzo: aggiungere 300 microlitri di soluzione di saccarosio al 5% e agar al 2% in ciascun pozzetto. Coprire quindi la piastra con un tessuto a maglia fine e lasciare asciugare completamente per un massimo di un'ora.

Successivamente, aggiungere uno strato superiore di 50 microlitri in ogni pozzetto contenente saccarosio al 5%, agar al 1% e lucifero a due millimolari. Poiché il lucifero è sensibile alla luce, lasciare asciugare la piastra al buio e, in seguito, ridurre al minimo l'esposizione della piastra alla luce.

Una volta che l'agar è raffreddato, coprire la piastra con un film adesivo trasparente. Quindi, utilizzando un ago sottile, perforare il film due volte sopra ciascun pozzetto. Questi fori permettono lo scambio d'aria e l'anestesia gassosa.

Successivamente, per facilitare il caricamento dei drosofili, utilizzare una lama affilata e un bordo dritto per praticare un taglio tra ogni colonna. Anestetizzare i drosofili con anidride carbonica e caricarli uno alla volta in ciascun pozzetto, colonna per colonna. Se un drosophila dovesse rimanere attaccato al film, dargli la possibilità di liberarsi prima di intervenire.

Riportare la piastra a pozzetti nell'incubatore sotto luce costante per otto-24 ore. Per anestetizzare le mosche presenti nei pozzetti, utilizzare una punta di pipetta collegata a una linea di anidride carbonica a bassa pressione. Assicurarsi che il gas sia a una pressione sufficientemente bassa da non arrecare danni e posizionare la punta della micropipetta direttamente sopra i fori di ventilazione per anestetizzare le mosche, otto alla volta, singolarmente.

Trasferire ogni moscerino su un pad di CO2 e infettarlo con batteri come precedentemente descritto. Quindi reinserire ogni moscerino nel suo pozzetto originale e sigillare nuovamente la micropiastra. Misurare la luminescenza di ogni moscerino utilizzando un luminometro collocato in una stanza a temperatura controllata e con un programma luminoso definito.

Caricare le piastre nel cassetto di impilamento, assicurandosi di posizionare le piastre contenenti le mosche tra piastre vuote trasparenti. Programmare il luminometro secondo le specifiche del produttore e acquisire le letture ogni ora per un minimo di 24 ore. In questo esempio, i rivelatori sono programmati per leggere ogni pozzetto per 10 secondi.

Una volta completato, esportare i file di dati in un foglio di calcolo ed eseguire un'analisi standard rappresentando graficamente i risultati. I dati di esempio possono essere analizzati. Sconti al secondo mediati da tre letture per pozzetto.

Due gruppi di moscerini selvatici Canton S e moscerini mutanti relish. E 20 privi del gene NF kappa B sono stati inseriti in due monitor di attività in luce costante e infettati con sia. In questo esempio, l'infezione ha favorito il sonno.

Era chiaro che i mutanti relish E 20 presentavano una quantità di sonno inferiore rispetto ai controlli Canton s dopo l'infezione. In accordo con risultati precedenti, i mutanti relish E 20 sono inoltre deceduti rapidamente a causa dell'infezione rispetto alle mosche di tipo selvatico.

La maggior parte delle mosche è sopravvissuta all'iniezione di controllo asettica, indicando che le mosche sono morte a causa dell'infezione e non per il danno provocato dall'iniezione. Poiché i mutanti relish sono morti molto rapidamente, solo le mosche Canton s sono state utilizzate per dimostrare il carico batterico dopo l'infezione. Sia ha continuato a proliferare nella mosca 24 ore dopo l'infezione.

L'attività del reporter Lucifer ha mostrato una notevole variabilità tra singoli esemplari di moscerini e tra la riuscita dei punti dati. Sebbene il segnale derivi da tutti i tessuti all'interno del moscerino, non ci si aspetta che ogni tessuto emetta la stessa quantità di segnale e la visibilità del tessuto rispetto al rivelatore varia mentre il moscerino si muove. In questo esempio, i moscerini sono stati infettati e confrontati con un gruppo di controllo manipolato.

Le mosche decedute sono state escluse dall'analisi all'interno di un gruppo di mosche. L'attività del reporter Luciferase Kappa b aumenta costantemente dopo l'infezione. L'attività del reporter Luciferase Kappa b è aumentata costantemente anche dopo una lesione asettica.

L'attività massima si è verificata intorno alle 12 ore sia dopo la lesione che dopo l'infezione. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come quantificare la funzione immunitaria e il sonno nell'SSO dopo un'infezione. Possiamo misurare il sonno, la sopravvivenza, il tempo, l'eliminazione batterica e l'attività in tempo reale di un reporter della trascrizione non copiata.