Misurazione quantitativa della risposta immunitaria e nel sonno Drosophila

L'obiettivo generale del seguente esperimento è valutare il sonno e la funzione immunitaria nella drosofila. Ciò si ottiene in primo luogo registrando l'attività locomotoria dei moscerini infetti per misurare il sonno e la sopravvivenza come secondo passo dopo che i moscerini dell'infezione sono stati omogeneizzati, diluiti e diffusi su piastre di agar LB. Il numero di unità formanti colonie che crescono indica la capacità delle mosche di eliminare l'infezione.

Successivamente, i moscerini infetti che esprimono un transgene contenente il reporter di luciferasi NF kappa b vengono aggiunti a una piastra a 96 pozzetti contenente luciferiano, il substrato della luciferasi. La misurazione in tempo reale della kappa b luciferasi indica l'attivazione di una via di segnalazione NF kappa B durante l'infezione, con l'esito della sopravvivenza nel sonno. La clearance batterica e l'attività del reporter NF KB sono misure che forniscono informazioni meccanicistiche sul legame molecolare tra funzione immunitaria e comportamento.

In generale, le persone che non conoscono questo metodo o lottano perché ci vuole tempo e pratica per imparare a infettare manualmente le mosche con coerenza. Il vantaggio principale della tecnica Lucifer rispetto ai metodi esistenti come la QPCR è che l'attività di NF Kappa B può essere misurata continuamente in tempo reale in vita. Mosche Inizia incubando colture di drosofila messe in scena in tarda pupilla per tre o quattro giorni, in modo che gli adulti si adattino alle condizioni ambientali.

Qui le mosche sono poste sotto luce costante per eliminare l'influenza dell'orologio circadiano sulla risposta immunitaria e sul comportamento. Il prossimo carico di mosche da uno a quattro giorni entra nell'attività. I monitor registrano la loro attività per un minimo di tre giorni prima dell'infezione, un giorno prima dell'infezione programmata.

Prelevare una singola colonia di SIA con un puntale per pipetta sterile e immergere il puntale in una provetta di coltura contenente cinque millilitri di terreno LB per verificare la tecnica sterile. Non dimenticare di fare una finta coltura di controllo senza batteri. Far crescere i batteri durante la notte fino a raggiungere la fase di crescita esponenziale Il giorno successivo.

Misurare l'assorbanza della coltura a 600 nanometri. Includi un secondo Q vet come spazio vuoto. È pronto quando la concentrazione è compresa tra 0,5 e un'unità di assorbanza sottocoltura, o prolunga il tempo di coltura secondo necessità.

Ora prepara la soluzione batterica per infettare le mosche. Diluire i batteri con PBS a un'assorbanza prevista di 0,1 a 600 nanometri. Quindi aggiungere colorante alimentare per il controllo dell'iniezione.

Sostituire i batteri con LB medium. Conservare entrambe le soluzioni in ghiaccio. Successivamente, utilizzando un micro estrattore per pipette, realizzare aghi per iniezione con una punta sottile sotto un microscopio da dissezione.

Usa una pinza sottile per rompere la punta di ciascun ago in modo che l'apertura sia abbastanza grande da riempirsi di liquido di iniezione usando l'aspirazione, ma anche abbastanza piccola da ridurre al minimo i danni alla mosca. Collegare un ago di vetro a una siringa di plastica da tre cc con un tratto di tubo utilizzando la siringa. Il flusso del mezzo di iniezione è controllato manualmente.

Evitare di contaminare il tubo di gomma con il liquido per iniezioni poiché l'apparato a siringa viene utilizzato sia per l'iniezione infettiva che per quella di controllo. Verificare il flusso del mezzo di iniezione con l'uso di un fazzoletto di carta Kim. Due dettagli fondamentali per il successo delle iniezioni sono l'utilizzo della dimensione ottimale dell'ago e la tenuta sicura tra l'ago e la siringa.

Una volta che il sistema di iniezione è completamente preparato, anestetizzare le mosche utilizzando un flusso minimo di anidride carbonica, procedere rapidamente in modo che nessuna mosca anestetizzata per più di cinque minuti. Ora inietta le mosche infilando l'ago di vetro nella regione sopra il tellum obliquo del torace dorsale. Il passaggio del mezzo di iniezione nel moscerino è verificato dal colorante alimentare, che può essere visto mentre la soluzione iniettata si diffonde.

Prima di iniziare, assicurarsi che tutti i materiali utilizzati per questa procedura siano stati sterilizzati in autoclave anche con almeno un giorno di anticipo. Preparare piastre di Petri da 10 centimetri con LV agar medium. Il giorno dell'esperimento, anestetizzare e posizionare le mosche in provette da centrifuga da 1,5 millilitri.

Preparare un minimo di due gruppi di 10 mosche ciascuno per condizione sperimentale. Preparare anche un gruppo di controllo di mosche senza infezione, soprattutto quando si utilizza un ceppo batterico senza resistenza agli antibiotici. Conservare tutti i tubi caricati sul ghiaccio.

Quindi, aggiungere 400 microlitri di LB medium a ciascun tubo caricato al volo. Omogeneizzare le mosche usando una piccola bobina e farlo vicino a una fiamma per evitare contaminazioni. Utilizzando i puntali per pipette tagliati, diluire in serie l'omogeneizzato con fattori di 10 in volumi di 200 microlitri.

Se l'omogenato viene prodotto immediatamente dopo l'infezione con sia, fare dilu fino a 1000, ma per 24 ore, dopo l'infezione, fare fino a 100.000. Il seme successivo, i due più grandi diluiscono su piastre da 10 centimetri utilizzando sfere di vetro per garantire una distribuzione uniforme, incubano le piastre durante la notte. Il giorno successivo, conta il numero di colonie sulla piastra mediante osservazione diretta o tramite software di conteggio delle colonie.

Quindi calcola il numero di unità formanti colonie per mosca. Questo test utilizza mosche transgeniche che trasportano il reporter di luciferasi kappa b al momento opportuno. Il test richiede anche batteri in coltura come SCIA preparati per l'iniezione come descritto nella sezione precedente.

Regola le mosche in base alle condizioni di illuminazione sperimentali. In questo esempio, i moscerini kappa b luciferasi di età compresa tra uno e quattro giorni sono alloggiati in fiale contenenti il 5% di saccarosio, il 2% di terreno alimentare e poste in luce costante per due giorni. Ora prepara una micropiastra da 96 pozzetti per le mosche.

Riempi ogni pozzetto con due strati di cibo. Medium prima, aggiungere 300 microlitri di saccarosio al 5%, soluzione di agar al 2% a ciascuno. Copri bene la piastra con un panno a maglie fini e lascia asciugare completamente la piastra per un massimo di un'ora.

Quindi, aggiungi uno strato superiore da 50 microlitri a ciascun pozzetto contenente il 5% di saccarosio, l'1% di agar e due millimolari di Lucifero. Poiché Lucifer è sensibile alla luce, lascia asciugare la piastra al buio e in avanti. Ridurre al minimo l'esposizione alla luce della lastra.

Una volta che l'agar si è raffreddato, coprire la piastra con una pellicola adesiva trasparente. Quindi, utilizzando un ago sottile, perforare la pellicola due volte su ogni pozzetto. Questi fori permettono il ricambio d'aria e l'anestesia gassosa.

Successivamente, per facilitare il caricamento al volo, utilizzare una lama affilata e un bordo dritto per introdurre un taglio tra ogni colonna. Anestetizzare le mosche con anidride carbonica e caricarle una ad una su ogni pozzetto colonna per colonna. Se una mosca dovesse rimanere attaccata alla pellicola, datele l'opportunità di liberarsi prima di intervenire.

Rimettere la piastra a micropozzetti nell'incubatore sotto luce costante per otto-24 ore. Per anestetizzare le mosche ben legate, utilizzare una punta per micropipetta collegata a una linea di anidride carbonica a bassa pressione. Assicurarsi che il gas sia a bassa pressione innocua e posizionare la punta della micropipetta direttamente sopra i fori di ventilazione per anestetizzare una mosca in gruppi di otto individualmente.

Trasferisci ogni mosca su un cuscinetto di CO2 e infettala con i batteri come in precedenza. Quindi rimetti ogni mosca al suo pozzetto originale e richiudi la micropiastra. Misura la luminescenza in ogni mosca utilizzando un luminometro alloggiato in una stanza a temperatura controllata secondo un programma di illuminazione definito.

Caricare le piastre nella cassetta di impilamento, assicurandosi di impilare le piastre contenenti le mosche tra le piastre vuote trasparenti. Programmate il luminometro secondo le specifiche del produttore e raccogliete le letture ogni ora per un minimo di 24 ore. In questo esempio, i rivelatori sono programmati per leggere ogni pozzetto per 10 secondi.

Una volta completato, esporta i file di dati in un foglio di calcolo ed esegui un'analisi standard che rappresenta graficamente i risultati. I dati di esempio possono essere analizzati. Gli sconti al secondo erano in media di tre letture per pozzo.

Il tipo selvatico Canton S vola e assapora. I moscerini mutanti E 20 privi del gene NF kappa B sono stati caricati in due monitor di attività in luce costante e infettati con sia. In questo esempio, l'infezione ha favorito il sonno.

Era chiaro che i mutanti E 20 hanno sperimentato meno sonno rispetto alle mosche di controllo di Canton s. Dopo l'infezione. Coerentemente con i risultati precedenti, anche i mutanti del gusto E 20 hanno rapidamente ceduto all'infezione rispetto alle mosche di tipo selvatico.

La maggior parte dei moscerini è sopravvissuta all'iniezione di controllo asettico, indicando che i moscerini hanno ceduto all'infezione e non alla ferita dovuta all'iniezione. Poiché i mutanti del gusto morivano così rapidamente, solo le mosche di Canton venivano utilizzate per dimostrare la carica batterica dopo l'infezione. Sia ha continuato a proliferare nel moscerino 24 ore dopo l'infezione.

L'attività di reporter di Lucifer ha mostrato una grande variazione tra le singole mosche e tra il successo dei punti dati. Sebbene il segnale derivi da tutti i tessuti all'interno della mosca, non ci si aspetta che ogni tessuto emetta la stessa quantità di segnale e la visibilità del tessuto al rilevatore varierebbe man mano che la mosca si muove. In questo esempio, i moscerini sono stati infettati e confrontati con un gruppo di controllo manipolato.

Le mosche morte sono state escluse dall'analisi in un gruppo di mosche. L'attività del reporter di Kappa b Luciferasi aumenta costantemente dopo l'infezione. Anche l'attività del reporter Kappa b Luciferase è aumentata costantemente dopo un infortunio asettico.

Il picco di attività è stato di circa 12 ore sia per il post-infortunio che per il post-infezione. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come quantificare la funzione immunitaria e il sonno in SSO dopo l'infezione. Possiamo misurare il sonno, la sopravvivenza, il tempo, l'eliminazione batterica e l'attività in tempo reale di un reporter di trascrizione senza copie.