Genome-wide gene delezioni in

L'obiettivo generale di questa procedura è realizzare delezioni genomiche di singoli geni in Streptococcus sanguinis mediante PCR ad alta capacità. Questo viene ottenuto innanzitutto ottenendo tre ampliconi mediante amplificazione PCR ad alta capacità, inclusi il gene di resistenza all'antibiotico e le sequenze di DNA a monte e a valle del gene bersaglio. Il secondo passaggio consiste nell'ottenere l'amplicone lineare ricombinante mediante PCR, utilizzando i tre ampliconi PCR come stampi.

Successivamente, si preparano le cellule s sanguine competenti. L'ultimo passaggio consiste nel trasformare l'amplificone PCR ricombinante lineare in cellule s sanguineus competenti. Infine, un'amplificazione PCR del gene colon A e il sequenziamento del DNA vengono utilizzati per verificare la corretta ottenzione dei mutanti.

Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto ad altri metodi esaustivi come l'inserimento suicida di plasmidi per l'eliminazione genica, è che questo metodo permette di generare direttamente mutanti con delezioni su scala genomica mediante tecnologie ad alto rendimento. I primer per PCR possono essere progettati e sintetizzati come descritto nel protocollo scritto, utilizzando script interni basati sulla sequenza genomica di Streptococcus sanguineus SK36. Sono stati progettati tre set di primer per l'amplificazione della sequenza a monte di un chilobase rispetto al gene bersaglio, del gene ENC che codifica per la proteina di resistenza alla kanamicina A PHA tre, e della sequenza a valle di un chilobase rispetto al gene bersaglio.

Primeri specifici per il gene. R one e F three sono progettati in base alle sequenze a 5' e a 3' del gene bersaglio per amplificare in alto rendimento la regione di un chilobase a monte o a valle dei geni sanguinei bersaglio. Preparare innanzitutto una miscela di reazione PCR in ghiaccio in un tubo conico da 15 millilitri.

Vedere il testo per i componenti della miscela PCR contenente DNA genomico sanguigno; trasferire 23 microlitri della miscela in ciascun pozzetto di una piastra PCR a 96 pozzetti utilizzando una pipetta multicanale. Per la sequenza a monte del gene bersaglio, aggiungere un microlitro ciascuno dei primer F1 e R1 provenienti da piastre di primer lavorative da 10 micromolari alla piastra PCR utilizzando la pipetta multicanale. Ripetere l'operazione con i primer F3 e R3 per amplificare la sequenza a valle del gene bersaglio. Sigillare la piastra PCR ed eseguire l'amplificazione a 94 gradi Celsius per un minuto, seguito da 30 cicli di 94 gradi Celsius per 30 secondi.

54 gradi Celsius per 30 secondi e 68 gradi Celsius per 1,5 minuti. Dopo l'amplificazione, preparare un gel di agarosio al 1% contenente bromuro di etidio con 48 pozzetti adatti al caricamento con pipetta multicanale. Mescolare quattro microlitri del prodotto PCR con un microlitro di buffer di caricamento DNA 5X.

In una piastra a 96 pozzetti, caricare i campioni su un gel di aros utilizzando una pipetta multicanale da 10 microlitri. Eseguire l'elettroforesi a 135 volt per 30 minuti. Esaminare la banda sul gel mediante un sistema di documentazione e analisi UVP.

Purificare i prodotti PCR utilizzando il kit di purificazione PCR Pure Link 96 mediante centrifugazione, seguendo le istruzioni del produttore per l'elusione del DNA. Aggiungere 40 microlitri di acqua sterile doppia distillata in ciascun pozzetto della piastra di legame. Selezionare casualmente alcuni ampliconi purificati sulla piastra per esaminare le concentrazioni di DNA.

Utilizzando uno spettrofotometro NanoDrop, regolare la concentrazione degli amplificati nella piastra a circa 10 nanogrammi per microlitro. Successivamente, utilizzare eco R uno per digerire un plasmide contenente la resistenza alla kanamicina gisette in modo che possa fungere da modello per la PCR. Purificare il plasmide digerito utilizzando il kit di purificazione rapida per PCR kayak e regolare il DNA plasmidico lineare a una concentrazione finale di DNA di 10 nanogrammi per microlitro.

Assemblare una miscela PCR di 25 microlitri per l'amplificone del cassetto di resistenza alla kanamicina, inclusi i primer F due e R due elencati nella procedura scritta. In abbinamento a questo video, procedere con l'amplificazione PCR come indicato qui. Per analizzare il prodotto PCR, eseguire l'elettroforesi su gel in agarosio al 1%.

Quindi, raggruppare un quantitativo consistente degli ampliconi del cassetta di resistenza cany provenienti da 10 individui purificati tramite PCR. Regolare la concentrazione degli ampliconi a 10 nanogrammi per microlitro. L'aspetto più difficile di questa procedura consiste nell'ottenere l'applicante PCR linearmente competente finale dai suoi tre applicanti PCR.

Per garantire il successo, i tre ter dell'applicante PCR vengono regolati a quantità quasi uguali. Combinare un microlitro di ciascuno dei tre aons PCR a 10 nanogrammi per microlitro in una piastra PCR, insieme al template PCR. Preparare quindi la miscela di PCR, inclusi i tre primer F1 e R elencati nella procedura scritta.

Successivamente, eseguire l'amplificazione PCR dei campioni. Analizzare gli AMPLICONI PCR su un gel all'agarosio dopo la purificazione e la quantificazione degli ampliconi PCR. Come in precedenza, congelare gli ampliconi PCR ricombinati a meno 20 gradi Celsius.

Per iniziare, preparare il mezzo Todd Hewitt e siero equino come indicato nella procedura scritta allegata a questo video; aliquotare due millilitri di mezzo e 10 millilitri di mezzo in due provette coniche da 15 millilitri. Inoculare cinque microlitri di ceppo scongelato di s sanguine SK 36, precedentemente congelato a -80 gradi Celsius, in due millilitri di mezzo. Incubare la coltura, ben chiusa, tutta la notte a 37 gradi Celsius.

Incubare anche il tubo da 10 millilitri di mezzo nelle stesse condizioni dopo un'incubazione notturna. Trasferire 50 microlitri della coltura nel tubo da 10 millilitri di mezzo. Incubare il tubo a 37 gradi Celsius per tre ore.

Immediatamente dopo l'incubazione, aggiungere due microlitri di 70 nanogrammi di peptide stimolante la competenza sanguineous, SK 36 e due microlitri di amplicone PCR ricombinante lineare a provette einor su un blocco a 96 pozzetti e preriscaldarli a 37 gradi Celsius. Trasferire 330 microlitri della coltura SK 36 incubata per tre ore in ciascuna provetta. Sostituire il DNA con acqua distillata sterile come controllo.

Incubare i tubi a 37 gradi Celsius per un'ora dopo l'incubazione. Porre il blocco sul ghiaccio e distribuire 100 microlitri di ogni trasformazione su piastre di agar al brodo cerebrale cardiaco o piastre BHI con 500 microgrammi per millilitro di canamicina; incubare le piastre a 37 gradi Celsius per due giorni in condizioni microaerofile. Per ciascun mutante sostituito, selezionare casualmente due colonie singole e inoculare ciascuna colonia in cinque millilitri di BHI contenente 500 microgrammi per millilitro di canamicina. Incubare ciascun inocolo tutta la notte a 37 gradi Celsius in condizioni microanaerobiche.

Criopreservare ogni coltura in glicerolo al 30% a meno 80 gradi Celsius. Per verificare se il mutante contiene la sostituzione genica prevista, eseguire una PCR su colonie per ogni mutante utilizzando i primer F1 e R3 in una piastra PCR a 96 pozzetti.

Utilizzare circa un microlitro di coltura notturna proveniente da ciascuna singola colonia come stampo di DNA in una reazione di amplificazione PCR da 25 microlitri. Procedere con l'amplificazione PCR per confermare la sostituzione del gene mutato e identificare con precisione i mutanti con doppia banda o gli ampliconi PCR contaminati. Analizzare l'amplicone PCR mediante elettroforesi su gel per quattro ore su un gel più lungo di 12 centimetri.

Gel di agarosio al 2% con colorazione al bromuro di etidio in queste condizioni di elettroforesi su gel di agarosio. Eventuali amplificati con una differenza maggiore o uguale a 100 paia di basi possono essere chiaramente identificati. In alternativa, quando si prevede che le bande risultanti dall'amplificazione della cassetta di resistenza alla kanamicina e del gene di tipo selvaggio differiscano di meno di 100 paia di basi, utilizzare un primer interno T uno del gene bersaglio per determinare se il gene di tipo selvaggio può essere rilevato mediante PCR.

Per confermare ulteriormente l'eliminazione, purificare gli ampliconi mediante il kit di purificazione PCR Pure Link 96 e sequenziare utilizzando il primer P one, che si lega al cassetta di resistenza alla kanamicina; conservare solo i mutanti corretti confermati mediante sequenziamento dopo l'amplificazione PCR utilizzando i primer F1 e R one per la sequenza a monte e F three e R three per la sequenza a valle. Circa un chilobase a monte e a valle di ciascun gene di s. sanguineus è stato ottenuto in formato 96 pozzetti nelle condizioni di PCR e con i primer progettati.

Un prodotto specifico è stato amplificato dal DNA genomico di s sanguineus in ciascuna reazione PCR, indicando che i primer erano altamente specifici per le sequenze bersaglio di s sanguineus attraverso la riamplificazione PCR utilizzando i primer F1 e R3 e tre ampliconi come template di DNA. Sono stati creati costrutti PCR ricombinanti lineari ad alta resa. Su una piastra a 96 pozzetti costituita da una regione a monte di ciascun gene bersaglio, un cassetta canR e una regione a valle di ciascun gene bersaglio in quest'ordine, i costrutti PCR ricombinanti sono stati quindi trasformati in s sanguineus SK36 e selezionati mediante canR su piastre di agar BHI.

Per la maggior parte delle trasformazioni, su ciascuna piastra sono state ottenute oltre 1000 colonie dopo un'incubazione microaerobica di due giorni. Quando queste colonie sono state amplificate mediante PCR utilizzando F1 e R tre, è stata osservata un'unica banda di DNA corrispondente alla dimensione attesa del mutante tramite elettroforesi su gel, nel tentativo di eliminare geni potenzialmente essenziali. Non dovrebbero essere ottenute colonie nella maggior parte delle trasformazioni per l'eliminazione di alcuni geni essenziali.

Tuttavia, sono state comunque ottenute colonie dopo la trasformazione, seguita dall'amplificazione mediante PCR di queste colonie utilizzando i primer F1 e R; due bande di DNA 2D corrispondenti alle dimensioni previste per il mutante e per il tipo selvatico sono apparse, come rivelato dall'elettroforesi su gel. Per alcuni mutanti, le dimensioni previste del prodotto di amplificazione PCR del mutante e del tipo selvatico erano troppo simili per essere separate mediante gel agarosio lungo. In questo caso, è stato progettato un primer interno T1 del gene bersaglio in base alla sequenza del gene di tipo selvatico.

La PCR è stata eseguita utilizzando il primer interno T uno e il primer F1. Il ceppo di tipo selvaggio SK 36 è stato utilizzato come controllo positivo per questa PCR. Se una banda della dimensione prevista è stata amplificata dal mutante utilizzando il primer interno, il gene è stato identificato come gene essenziale.

Dato che la presenza del cassetto di canamicina nel mutante era stata confermata in precedenza mediante sequenziamento del DNA utilizzando il primer P one. In base a questo protocollo, sono stati raccolti 2048 mutanti di geni non essenziali di S. sanguineus, escludendo i quattro open reading frame contenuti interamente all'interno di altri open reading frame.

218 geni, essenziali per la sopravvivenza di s. sanguinis, sono stati identificati nelle condizioni sperimentali. Dopo aver visto questi video, penso che dobbiate avere una buona comprensione di come effettuare un'analisi a livello del genoma. Le analisi geniche utilizzano PCR ad alto rendimento.