Name: Genome-wide gene delezioni in Streptococcus sanguinis Da Throughput PCR ad alta (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-11-23T13:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 7 s
Description: Scopri come creare delezioni geniche genome-wide in Streptococcus sanguinis utilizzando PCR ad alto throughput. Questo metodo efficiente permette di studiare la funzione genica batterica con tecniche di trasformazione e sequenziamento.

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Questo lavoro è stato sostenuto dalle concessioni R01DE018138 dal National Institutes of Health (PX) e, in parte, dal Programma Virginia Commonwealth Research presidenziale Incentive University (PRIP) 144602-3 (PX). Ringraziamo Drs. Lei Chen, Yuetan Dou e Xiaojing Wang per l&#39;assistenza con la costruzione di mutanti genoma di larghezza. Ringraziamo anche il Core Facility DNA della Virginia Commonwealth University per il sequenziamento del DNA.

1. Primer design <ol><li> Primer sono progettati utilizzando script in casa in base alla S. sanguinis SK36 genoma sequenza. Tre serie di primer, F1/R1, F2/R2 e F3/R3 sono progettati per l&#39;amplificazione del-1 kb di sequenza a monte del gene target, l&#39;APHA-3 encoding gene per la resistenza alla kanamicina (Km r) e la proteina 3 1 -kb sequenza a valle del gene bersaglio, rispettivamente (Figura 1). Tra questi primer, F1 e R3 sono progettati utilizzando ePrimer3 nel EMBOSS insieme di programmi ( <a href="http://emboss.sourceforge.net/apps/cvs/emboss/apps/index.html" target="_blank">http://emboss.sourceforge.net/apps/cvs/emboss/apps/index.html</a> ) per amplificare regioni fiancheggianti monte oa valle del target gene. Primer gene specifico, R1 e F3, sono progettati in base al 5 &#39;e 3&#39; sequenze del gene bersaglio. Primer R1 ed F3 contengono 25 coppie di basi sequenze adattatore alla fine il loro 5 &#39;che sono complementari al APHA-3gene. Le temperature di fusione di ciascun primer sono stati progettati per essere il più vicino possibile a 60 ° C per consentire l&#39;uso di una temperatura di ricottura uniforme per tutte le reazioni di PCR in formato a 96 pozzetti. </li><li> F1, R1, R3 F3 e primer sono sintetizzati in piastre a 96 pozzetti basato su un ordine gene. Ciascuna piastra contiene un tipo di primer nell&#39;ordine stesso gene. Diluire i primer in piastra a 96 pozzetti fondo lavorando ad una concentrazione finale di 10 pM per l&#39;amplificazione PCR usando una pipetta multicanale. </li></ol> 2. High-throughput amplificazione PCR e purificazione <ol><li> Per amplificare elevato throughput 1-kb a monte oa valle del bersaglio S. geni sanguinis, assemblare una miscela cocktail PCR in ghiaccio in 15 ml tubo conico contenente 1640 microlitri DDH 2 O, 250 microlitri 10xHigh Fidelity PCR Buffer, 200 ml di miscela di mm 10 dNTP, 100 pl di 50 mM MgSO4, 100 pl di 10 ng / mL S. sanguinis SK36 DNA genomico e 10 microlitri Platinum Taq DNA polimerasirase alta fedeltà e trasferimento 23 microlitri della miscela in ciascun pozzetto di piastra a 96 pozzetti PCR usando una pipetta multicanale. Trasferire 1 ml di ciascuna F1 e R1 (o F3 e R3) da 10 pM di lavoro piastre di primer alla piastra PCR usando pipetta multicanale. Sigillare la piastra PCR ed eseguire amplificazione a 94 ° C per 1 min, e 30 cicli di 94 ° C per 30 sec, 54 ° C per 30 sec e 68 ° C per 1,5 min. </li><li> Preparare 1% gel contenente bromuro di etidio con 48 carico multicanale raccordo pipetta pozzi. Miscelare 4 microlitri prodotto PCR con 1 ml di tampone di caricamento 5xDNA sulla piastra a 96 pozzetti e caricare i campioni su gel di agarosio utilizzando un 10-microlitri pipetta multicanale. Eseguire elettroforesi a 135 V per 30 minuti. Esaminare la banda su gel con documentazione UVP e sistema di analisi. </li><li> Purificare il prodotto PCR da 96 PureLink kit di purificazione PCR utilizzando centrifugazione secondo le istruzioni del produttore. Per eluizione del DNA, aggiungere 40 microlitri sterile DDH 2 O al pozzo del binding piastra. </li><li> Scegliere a caso diversi amplificati purificati sulla piastra di esaminare le concentrazioni di DNA mediante spettrofotometro NanoDrop. Regolare la concentrazione di ampliconi su piastra a ~ 10 ng / mL. </li><li> Un plasmide contenente cassette chilometri r viene digerito con EcoR I come template PCR. Il plasmide digerito viene purificato per QIAquick kit di purificazione PCR e il DNA plasmide lineare viene regolata alla concentrazione finale di 10 ng di DNA / pl. Montare 25 miscela microlitri per amplicone km cassetta r compresi 16,4 microlitri DDH 2 O, 2,5 microlitri 10xHigh Fidelity PCR Buffer, 2 ml di miscela di mm 10 dNTP, 1 ml di 50 mM Mg SO 4, 1 ml di 10 pM F2, 1 ml di 10 pM R2, 1 ml DNA plasmidico lineare e 0,1 microlitri fedeltà Platinum Taq DNA polimerasi alta. Effettuare amplificazione PCR a 94 ° C per 1 min, e 30 cicli di 94 ° C per 30 sec, 55 ° C per 30 sec e 68 ° C per 1 min. Esaminare il prodotto di PCR mediante elettroforesi su gel di agarosio all&#39;1%. Poola maggior parte della cassetta degli ampliconi km r da 10 individuali PCR purificato dal kit QIAquick purificazione PCR. Regolare la concentrazione amplicone a 10 ng / mL. </li><li> Per ottenere il lineare finale amplicone PCR ricombinante, tre ampliconi PCR vengono combinati tra microlitri 1 (in quantità circa pari-molare) in una piastra PCR così come templato PCR. Altri componenti della PCR è aggiunto anche 14,4 microlitri DDH 2 O, 2,5 microlitri 10xHigh Fidelity PCR Buffer, 2 ml di miscela di mm 10 dNTP, 1 ml di 50 mM Mg SO 4, 1 ml di 10 mM F1, 1 ml di 10 microM R3, 0,1 microlitri Platinum Taq DNA polimerasi ad alta fedeltà. Amplificazione PCR viene eseguita a 94 ° C per 2 min, 30 cicli di 94 ° C per 30 sec a 55 ° C per 30 sec e 68 ° C per 3,5 min, ed infine 68 ° C per 4 min. </li><li> Esaminare gli ampliconi della PCR su gel di agarosio. Purificare e quantificare gli ampliconi della PCR come descritto sopra. Congelare gli ampliconi della PCR ricombinati a -20 ° C. </li></ol> 3. Comcompetente Celle Preparazione <ol><li> Todd Hewitt Broth è preparato, pH regolato a 7,6 con NaOH 10 N, riscaldato a ebollizione e poi raffreddata a temperatura ambiente e sterilizzato usando polistirene 0,22 micron filtro 4. Aggiungere 300 microlitri inattivato al calore cavallo sieri (concentrazione finale di 2,5%) a 11,7 ml di brodo Todd Hewitt in 15 ml tubo conico per compensare TH + HS media. Aliquotare TH + HS medie in 2 ml e 10 ml in provette. </li><li> Inoculare 5 l di brodo S. sanguinis SK36 congelati a -80 ° C in 2 ml di terreno TH + HS e incubare la coltura durante la notte con capping ermeticamente a 37 ° C, accompagnata da pre-incubando il 10 ml-TH + tubo HS. </li><li> Dopo una notte, trasferire 50 microlitri cultura in 10 ml TH + HS e incubare la provetta a 37 ° C per 3 ore (corrispondente a OD 660 di 0,07-0,08), immediatamente utilizzando per la trasformazione. </li></ol> 4. Trasformazione cellulare e selezione antibiotica <ol><li> Aggiungere 2 ml di 70 ng S. sanguinis SK36 compeTence peptide stimolante (CSP) e 2 microlitri lineare amplicone PCR ricombinante (~ 50 ng) per provette Eppendorf a 96-well blocco e li pre-riscaldare a 37 ° C. Trasferire 330 ml di 3 ore-incubato SK36 cultura in ogni provetta. Incubare a 37 ° C per 1 ora. Sostituire il DNA con sterile DDH 2 O come controllo. </li><li> Posizionare il blocco di ghiaccio e la diffusione 100 pl di ogni trasformazione in Brain Heart Infusion (BHI) piastra di agar con 500 mg / ml di kanamicina. Incubare le piastre a 37 ° C per 2 d in condizioni microaerobiche. </li></ol> 5. Conferma Mutant e stoccaggio <ol><li> Per ciascun mutante di sostituzione, casualmente prendere due singole colonie, inoculare la colonia in 5 ml BHI contenente 500 ug / ml di kanamicina e incubare l&#39;inoculo microaerobically notte a 37 ° C. Crioconservare ciascuna cultura in 30% glicerolo a -80 ° C </li><li> Per esaminare se il mutante contenente la sostituzione del gene previsto, eseguire colonia PCR per ciascun mutante con F1 e R3primer in piastra a 96 pozzetti PCR. Circa 1-microlitri dalla coltura durante la notte colonia individuale viene usato come stampo di DNA in 25 microlitri PCR-amplificazione reazione. PCR viene eseguita a 94 ° C per 5 min, 35 cicli di 94 ° C per 30 sec, 55 ° C per 30 sec e 68 ° C per 3,5 min, ed infine 68 ° C per 4 min. </li><li> Per identificare con precisione a doppia banda mutanti o contaminante ampliconi PCR, esame della PCR mediante elettroforesi per 4 ore su&gt; 12 cm al 2% su gel di agarosio con colorazione con etidio bromuro. In questa condizione elettroforesi su gel di agarosio, le ampliconi con ≥ 100 bp differenza sono stati chiaramente identificati. Quando le bande risultanti dalla amplificazione della cassetta r chilometri e di tipo selvatico gene sono anticipati per differire di &lt;100 bp, viene utilizzato un primer T1 interna per determinare se un gene di tipo selvatico può essere rilevato mediante PCR. </li><li> Ad ulteriore conferma l&#39;eliminazione, gli ampliconi sono purificati da PureLink 96 kit di purificazione PCR e sequenziati utilizzando il primer P1 chesi lega alla cassetta r chilometri. Mantieni solo mutanti corrette confermate mediante sequenziamento. </li></ol>

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</ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Per ridurre al minimo i possibili effetti polari della sostituzione di un gene esogeno gene mirata con antibiotici sui geni vicini, due passi vengono presi mentre innesco iniziale di progettazione. Per la maggior parte dei geni eliminati, il primer R1 e F3 sono progettati per eliminare la regione codificante da 6 bp dopo il codone di inizio di 30 bp prima del codone di stop. Gli ultimi 30 paia di basi sono conservati per proteggere potenziale sito di legame ribosomiale utilizzato dal gene adiacente valle. La regione tra...

<table border="1"&gt;<tbody&gt;<tr&gt;<td<strong&gt; Nomi</strong</td&gt;<td<strong&gt; Azienda</strong</td&gt;<td<strong&gt; Catalogo #</strong</td&gt;<td<strong&gt; Commenti (opzionale)</strong</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Primer F2</td&gt;<td&gt; Integrated DNA Technologies</td&gt;<td</td&gt;<td&gt; TGACTAACTAGGAGGAATAAATG<br/&gt; GCTAAAATGAGAATAT</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Primer R2</td&gt;<td&gt; Ibid</td&gt;<td</td&gt;<td&gt; CATTATTCCCTCCAGGTACTAAAA<br/&gt; CAATTCATCCAGT</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Primer F2P</td&gt;<td&gt; Ibid</td&gt;<td</td&gt;<td&gt; GATAAACCCAGCGAACCATTTGA</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Primer P1</td&gt;<td&gt; Ibid</td&gt;<td</td&gt;<td&gt; GCTTATATACCTTAGCAGGAGACA</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Primer P2</td&gt;<td&gt; Ibid</td&gt;<td</td&gt;<td&gt; GTATGACATTGCCTTCTGCGTCC</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Primer 5 &#39;end_R1_seq</td&gt;<td&gt; Ibid</td&gt;<td</td&gt;<td&gt; GCCATTTATTCCTCCTAGTTAGTCA</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Primer 5 &#39;end_F3_seq</td&gt;<td&gt; Ibid</td&gt;<td</td&gt;<td&gt; GTTTTAGTACCTGGAGGGAATAATG</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Primer 5 &#39;end_R1p_seq</td&gt;<td&gt; Ibid</td&gt;<td</td&gt;<td&gt; CCTCAAATGGTTCGCTGGGTTTATC</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; CSP</td&gt;<td&gt; Synprep</td&gt;<td</td&gt;<td&gt; Sequenza: NH2-DLRGVPNPWGWIFGR-COOH</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; DNA polimerasi</td&gt;<td&gt; Invitrogen</td&gt;<td&gt; 11304-102</td&gt;<td&gt; Platinum Taq DNA polimerasi ad alta fedeltà</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; EcoRI</td&gt;<td&gt; New England Biolabs Inc</td&gt;<td&gt; R0101S</td&gt;<td&gt; Con enzimi di restrizione</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Agar</td&gt;<td&gt; Bioanalytical americana</td&gt;<td&gt; AB01185</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Agarosio</td&gt;<td&gt; Promega</td&gt;<td&gt; V3125</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; BHI</td&gt;<td&gt; BD Biosciences</td&gt;<td&gt; 237500</td&gt;<td&gt; Cervello Infusion Cuore</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Siero di cavallo</td&gt;<td&gt; Fisher Scientific</td&gt;<td&gt; SH3007403</td&gt;<td&gt; Siero di cavallo</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Km</td&gt;<td&gt; Fisher Scientific</td&gt;<td&gt; BP906-5</td&gt;<td&gt; Kanamicina</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; TH brodo</td&gt;<td&gt; BD Biosciences</td&gt;<td&gt; 249240</td&gt;<td&gt; Brodo Todd Hewitt</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; PureLink 96</td&gt;<td&gt; Invitrogen</td&gt;<td&gt; K310096</td&gt;<td&gt; PureLink 96 kit di purificazione PCR</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; QIAquick</td&gt;<td&gt; Qiagen</td&gt;<td&gt; 28106</td&gt;<td&gt; QIAquick PCR Purification Kit</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Filtro</td&gt;<td&gt; Corning</td&gt;<td&gt; 431117</td&gt;<td&gt; 0,22 micron filtro polistirolo</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Sistema Anoxomat</td&gt;<td&gt; Mart Microbiologia bv</td&gt;<td&gt; Anoxomat Mark II</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Centrifuga da banco</td&gt;<td&gt; Thermo Scientific</td&gt;<td&gt; 75004377</td&gt;<td&gt; Sorvall leggenda RT plus micropiastra rotore</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Gel Documentazione</td&gt;<td&gt; UVP LLC</td&gt;<td&gt; BioDoc-It 210</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Incubatore</td&gt;<td&gt; Fisher Scientific</td&gt;<td&gt; 11-690-625D</td&gt;<td&gt; Isotemp</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Labnet di Gel XL</td&gt;<td&gt; Labnet</td&gt;<td&gt; E0160</td&gt;<td&gt; Labnet di Gel XL</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Microcentrifuga</td&gt;<td&gt; Eppendorf</td&gt;<td&gt; 22621408</td&gt;<td&gt; Microcentrifuga 5415 R</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Pipette multicanale</td&gt;<td&gt; Thermo Scientfic</td&gt;<td&gt; 4661040, 4661020</td&gt;<td&gt; Finnpipette F1</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Termociclatore</td&gt;<td&gt; Applied Biosystems Inc.</td&gt;<td&gt; N805-0200</td&gt;<td&gt; GeneAmp PCR System 9700</td&gt;</tr&gt;</tbody&gt;</table

genome-wide gene delezioni in<em&gt; streptococcus sanguinis</em&gt; da throughput pcr ad alta

Genome-wide Gene Deletions in Streptococcus sanguinis by High Throughput PCR

Trasposone mutagenesi e singolo gene delezione sono due metodi applicati nel genoma knockout gene in 1,2 batteri. Sebbene mutagenesi trasposone è meno tempo, meno costosa, e non richiede informazioni genoma completata, vi sono due punti deboli in questo metodo: (1) la possibilità di un mutanti disparati nella libreria misto mutante che contro-seleziona mutanti con concorrenza diminuita; e (2) la possibilità di inattivazione genica parziale in cui i geni non interamente perdono la loro funzione dopo l&#39;inserimento di un trasposone. Singolo gene delezione analisi può compensare gli svantaggi associati con mutagenesi trasposone. Per migliorare l&#39;efficienza del genoma delezione singolo gene, si cerca di stabilire un high-throughput tecnica di genome-wide delezione del gene singolo utilizzando Streptococcus sanguinis come organismo modello. Ogni delezione del gene costruire in S. sanguinis genoma è progettata per comprendere 1-Kb a monte del gene target, l&#39;APHA-3 gene, che codifica per proteine ​​resistenza alla kanamicina, e 1-kb a valle del gene bersaglio. Tre serie di primer F1/R1, F2/R2 e F3/R3, rispettivamente, sono stati progettati e sintetizzati in un formato a 96 pozzetti per piastra PCR amplificazioni di questi tre componenti di ciascuna delezione costruire. Primer R1 e F3 contengono 25-bp sequenze che sono complementari alle regioni del gene-3 APHA a fine loro 5 &#39;. Una grande scala di amplificazione PCR del gene-3 APHA viene eseguita una volta per tutte la creazione di un singolo gene costrutti di delezione. Il promotore del gene APHA-3 è inizialmente escluso per minimizzare il potenziale effetto polare di cassette kanamicina. Per creare i costrutti genici delezione, alta produttività amplificazione PCR e purificazione sono eseguite in un formato a 96 pozzetti piastra. Un lineare amplicone PCR ricombinante per ogni gene delezione sarà composta da quattro reazioni PCR utilizzando alta fedeltà DNA polimerasi. Il expon inizialefase di crescita preferenziale di S. sanguinis coltivati ​​in brodo Todd Hewitt integrato con 2,5% siero di cavallo inattivato viene usato per aumentare la competenza per la trasformazione di PCR-costrutti ricombinanti. In questa condizione, fino al 20% di S. sanguinis cellule possono essere trasformate utilizzando ~ 50 ng di DNA. Sulla base di questo approccio, 2048 mutanti con singolo gene delezione sono stati infine ottenuti dai 2.270 geni in S. sanguinis esclusi quattro ORF del gene contenute interamente all&#39;interno ORF altri S. sanguinis SK36 e 218 potenziali geni essenziali. La tecnica sulla creazione di costrutti di delezione del gene è un throughput elevato e potrebbe essere facile da usare in tutto il genoma gene delezioni singole per i batteri trasformabili.

Dopo l&#39;amplificazione PCR utilizzando primer F1 e R1, R3 e F3 e, di circa 1 kb a monte ea valle di ciascuna S. sanguinis gene sono stati ottenuti in formato a 96 pozzetti, rispettivamente (Figura 2A). Sotto le condizioni di PCR utilizzando primer disegnati e, un prodotto specifico è stato amplificato da S. sanguinis DNA genomico in ciascuna reazione PCR. Questo risultato indicato i primer erano altamente specifico per gli obiettivi di S. sanguinis. Tramite PCR re-amplifica...

Un efficiente genoma unico metodo di mutazione del gene è stata stabilita utilizzando<em&gt; Streptococcus sanguinis</em&gt; Come organismo modello. Questo metodo ha ottenuto tramite PCR ad alto throughput ricombinanti e trasformazioni.

Genome-wide gene delezioni in<em&gt; Streptococcus sanguinis</em&gt; Da Throughput PCR ad alta

La mutagenesi tramite trasposoni e la delezione di un singolo gene sono due metodi applicati per il knockout genico su scala genomica nei batteri 1,2. Sebbene la mutagenesi tramite trasposoni sia...

L'obiettivo generale di questa procedura è realizzare delezioni genomiche di singoli geni in Streptococcus sanguinis mediante PCR ad alta capacità. Questo viene ottenuto innanzitutto ottenendo tre ampliconi mediante amplificazione PCR ad alta capacità, inclusi il gene di resistenza all'antibiotico e le sequenze di DNA a monte e a valle del gene bersaglio. Il secondo passaggio consiste nell'ottenere l'amplicone lineare ricombinante mediante PCR, utilizzando i tre ampliconi PCR come stampi.Successivamente, si preparano le cellule s sanguine competenti. L'ultimo passaggio consiste nel trasformare l'amplificone PCR ricombinante lineare in cellule s sanguineus competenti. Infine, un'amplificazione PCR del gene colon A e il sequenziamento del DNA vengono utilizzati per verificare la corretta ottenzione dei mutanti.Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto ad altri metodi esaustivi come l'inserimento suicida di plasmidi per l'eliminazione genica, è che questo metodo permette di generare direttamente mutanti con delezioni su scala genomica mediante tecnologie ad alto rendimento. I primer per PCR possono essere progettati e sintetizzati come descritto nel protocollo scritto, utilizzando script interni basati sulla sequenza genomica di Streptococcus sanguineus SK36. Sono stati progettati tre set di primer per l'amplificazione della sequenza a monte di un chilobase rispetto al gene bersaglio, del gene ENC che codifica per la proteina di resistenza alla kanamicina A PHA tre, e della sequenza a valle di un chilobase rispetto al gene bersaglio.Primeri specifici per il gene. R one e F three sono progettati in base alle sequenze a 5' e a 3' del gene bersaglio per amplificare in alto rendimento la regione di un chilobase a monte o a valle dei geni sanguinei bersaglio. Preparare innanzitutto una miscela di reazione PCR in ghiaccio in un tubo conico da 15 millilitri.Vedere il testo per i componenti della miscela PCR contenente DNA genomico sanguigno; trasferire 23 microlitri della miscela in ciascun pozzetto di una piastra PCR a 96 pozzetti utilizzando una pipetta multicanale. Per la sequenza a monte del gene bersaglio, aggiungere un microlitro ciascuno dei primer F1 e R1 provenienti da piastre di primer lavorative da 10 micromolari alla piastra PCR utilizzando la pipetta multicanale. Ripetere l'operazione con i primer F3 e R3 per amplificare la sequenza a valle del gene bersaglio. Sigillare la piastra PCR ed eseguire l'amplificazione a 94 gradi Celsius per un minuto, seguito da 30 cicli di 94 gradi Celsius per 30 secondi.54 gradi Celsius per 30 secondi e 68 gradi Celsius per 1,5 minuti. Dopo l'amplificazione, preparare un gel di agarosio al 1% contenente bromuro di etidio con 48 pozzetti adatti al caricamento con pipetta multicanale. Mescolare quattro microlitri del prodotto PCR con un microlitro di buffer di caricamento DNA 5X.In una piastra a 96 pozzetti, caricare i campioni su un gel di aros utilizzando una pipetta multicanale da 10 microlitri. Eseguire l'elettroforesi a 135 volt per 30 minuti. Esaminare la banda sul gel mediante un sistema di documentazione e analisi UVP.Purificare i prodotti PCR utilizzando il kit di purificazione PCR Pure Link 96 mediante centrifugazione, seguendo le istruzioni del produttore per l'elusione del DNA. Aggiungere 40 microlitri di acqua sterile doppia distillata in ciascun pozzetto della piastra di legame. Selezionare casualmente alcuni ampliconi purificati sulla piastra per esaminare le concentrazioni di DNA.Utilizzando uno spettrofotometro NanoDrop, regolare la concentrazione degli amplificati nella piastra a circa 10 nanogrammi per microlitro. Successivamente, utilizzare eco R uno per digerire un plasmide contenente la resistenza alla kanamicina gisette in modo che possa fungere da modello per la PCR. Purificare il plasmide digerito utilizzando il kit di purificazione rapida per PCR kayak e regolare il DNA plasmidico lineare a una concentrazione finale di DNA di 10 nanogrammi per microlitro.Assemblare una miscela PCR di 25 microlitri per l'amplificone del cassetto di resistenza alla kanamicina, inclusi i primer F due e R due elencati nella procedura scritta. In abbinamento a questo video, procedere con l'amplificazione PCR come indicato qui. Per analizzare il prodotto PCR, eseguire l'elettroforesi su gel in agarosio al 1%.Quindi, raggruppare un quantitativo consistente degli ampliconi del cassetta di resistenza cany provenienti da 10 individui purificati tramite PCR. Regolare la concentrazione degli ampliconi a 10 nanogrammi per microlitro. L'aspetto più difficile di questa procedura consiste nell'ottenere l'applicante PCR linearmente competente finale dai suoi tre applicanti PCR.Per garantire il successo, i tre ter dell'applicante PCR vengono regolati a quantità quasi uguali. Combinare un microlitro di ciascuno dei tre aons PCR a 10 nanogrammi per microlitro in una piastra PCR, insieme al template PCR. Preparare quindi la miscela di PCR, inclusi i tre primer F1 e R elencati nella procedura scritta.Successivamente, eseguire l'amplificazione PCR dei campioni. Analizzare gli AMPLICONI PCR su un gel all'agarosio dopo la purificazione e la quantificazione degli ampliconi PCR. Come in precedenza, congelare gli ampliconi PCR ricombinati a meno 20 gradi Celsius.Per iniziare, preparare il mezzo Todd Hewitt e siero equino come indicato nella procedura scritta allegata a questo video; aliquotare due millilitri di mezzo e 10 millilitri di mezzo in due provette coniche da 15 millilitri. Inoculare cinque microlitri di ceppo scongelato di s sanguine SK 36, precedentemente congelato a -80 gradi Celsius, in due millilitri di mezzo. Incubare la coltura, ben chiusa, tutta la notte a 37 gradi Celsius.Incubare anche il tubo da 10 millilitri di mezzo nelle stesse condizioni dopo un'incubazione notturna. Trasferire 50 microlitri della coltura nel tubo da 10 millilitri di mezzo. Incubare il tubo a 37 gradi Celsius per tre ore.Immediatamente dopo l'incubazione, aggiungere due microlitri di 70 nanogrammi di peptide stimolante la competenza sanguineous, SK 36 e due microlitri di amplicone PCR ricombinante lineare a provette einor su un blocco a 96 pozzetti e preriscaldarli a 37 gradi Celsius. Trasferire 330 microlitri della coltura SK 36 incubata per tre ore in ciascuna provetta. Sostituire il DNA con acqua distillata sterile come controllo.Incubare i tubi a 37 gradi Celsius per un'ora dopo l'incubazione. Porre il blocco sul ghiaccio e distribuire 100 microlitri di ogni trasformazione su piastre di agar al brodo cerebrale cardiaco o piastre BHI con 500 microgrammi per millilitro di canamicina; incubare le piastre a 37 gradi Celsius per due giorni in condizioni microaerofile. Per ciascun mutante sostituito, selezionare casualmente due colonie singole e inoculare ciascuna colonia in cinque millilitri di BHI contenente 500 microgrammi per millilitro di canamicina. Incubare ciascun inocolo tutta la notte a 37 gradi Celsius in condizioni microanaerobiche.Criopreservare ogni coltura in glicerolo al 30% a meno 80 gradi Celsius. Per verificare se il mutante contiene la sostituzione genica prevista, eseguire una PCR su colonie per ogni mutante utilizzando i primer F1 e R3 in una piastra PCR a 96 pozzetti.Utilizzare circa un microlitro di coltura notturna proveniente da ciascuna singola colonia come stampo di DNA in una reazione di amplificazione PCR da 25 microlitri. Procedere con l'amplificazione PCR per confermare la sostituzione del gene mutato e identificare con precisione i mutanti con doppia banda o gli ampliconi PCR contaminati. Analizzare l'amplicone PCR mediante elettroforesi su gel per quattro ore su un gel più lungo di 12 centimetri.Gel di agarosio al 2% con colorazione al bromuro di etidio in queste condizioni di elettroforesi su gel di agarosio. Eventuali amplificati con una differenza maggiore o uguale a 100 paia di basi possono essere chiaramente identificati. In alternativa, quando si prevede che le bande risultanti dall'amplificazione della cassetta di resistenza alla kanamicina e del gene di tipo selvaggio differiscano di meno di 100 paia di basi, utilizzare un primer interno T uno del gene bersaglio per determinare se il gene di tipo selvaggio può essere rilevato mediante PCR.Per confermare ulteriormente l'eliminazione, purificare gli ampliconi mediante il kit di purificazione PCR Pure Link 96 e sequenziare utilizzando il primer P one, che si lega al cassetta di resistenza alla kanamicina; conservare solo i mutanti corretti confermati mediante sequenziamento dopo l'amplificazione PCR utilizzando i primer F1 e R one per la sequenza a monte e F three e R three per la sequenza a valle. Circa un chilobase a monte e a valle di ciascun gene di s. sanguineus è stato ottenuto in formato 96 pozzetti nelle condizioni di PCR e con i primer progettati.Un prodotto specifico è stato amplificato dal DNA genomico di s sanguineus in ciascuna reazione PCR, indicando che i primer erano altamente specifici per le sequenze bersaglio di s sanguineus attraverso la riamplificazione PCR utilizzando i primer F1 e R3 e tre ampliconi come template di DNA. Sono stati creati costrutti PCR ricombinanti lineari ad alta resa. Su una piastra a 96 pozzetti costituita da una regione a monte di ciascun gene bersaglio, un cassetta canR e una regione a valle di ciascun gene bersaglio in quest'ordine, i costrutti PCR ricombinanti sono stati quindi trasformati in s sanguineus SK36 e selezionati mediante canR su piastre di agar BHI.Per la maggior parte delle trasformazioni, su ciascuna piastra sono state ottenute oltre 1000 colonie dopo un'incubazione microaerobica di due giorni. Quando queste colonie sono state amplificate mediante PCR utilizzando F1 e R tre, è stata osservata un'unica banda di DNA corrispondente alla dimensione attesa del mutante tramite elettroforesi su gel, nel tentativo di eliminare geni potenzialmente essenziali. Non dovrebbero essere ottenute colonie nella maggior parte delle trasformazioni per l'eliminazione di alcuni geni essenziali.Tuttavia, sono state comunque ottenute colonie dopo la trasformazione, seguita dall'amplificazione mediante PCR di queste colonie utilizzando i primer F1 e R; due bande di DNA 2D corrispondenti alle dimensioni previste per il mutante e per il tipo selvatico sono apparse, come rivelato dall'elettroforesi su gel. Per alcuni mutanti, le dimensioni previste del prodotto di amplificazione PCR del mutante e del tipo selvatico erano troppo simili per essere separate mediante gel agarosio lungo. In questo caso, è stato progettato un primer interno T1 del gene bersaglio in base alla sequenza del gene di tipo selvatico.La PCR è stata eseguita utilizzando il primer interno T uno e il primer F1. Il ceppo di tipo selvaggio SK 36 è stato utilizzato come controllo positivo per questa PCR. Se una banda della dimensione prevista è stata amplificata dal mutante utilizzando il primer interno, il gene è stato identificato come gene essenziale.Dato che la presenza del cassetto di canamicina nel mutante era stata confermata in precedenza mediante sequenziamento del DNA utilizzando il primer P one. In base a questo protocollo, sono stati raccolti 2048 mutanti di geni non essenziali di S. sanguineus, escludendo i quattro open reading frame contenuti interamente all'interno di altri open reading frame.218 geni, essenziali per la sopravvivenza di s. sanguinis, sono stati identificati nelle condizioni sperimentali. Dopo aver visto questi video, penso che dobbiate avere una buona comprensione di come effettuare un'analisi a livello del genoma. Le analisi geniche utilizzano PCR ad alto rendimento.

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