Isolamento di cellule melanociti-come primario dal Cuore del mouse

L'obiettivo generale di questa procedura è isolare cellule vitali simili a melanociti cardiaci dal cuore del topo. Questo viene ottenuto innanzitutto prelevando i cuori da topi sacrificati. Il secondo passaggio consiste nel tritare i cuori e dissociare le cellule mediante digestione enzimatica e agitazione meccanica.

Successivamente, la sospensione cellulare viene centrifugata e il pellet contenente i cardiomiociti e le cellule simili ai melanociti viene risospeso. L'ultimo passaggio consiste nell'allestire e coltivare le cellule. Le cellule isolate, ovvero le cellule simili ai melanociti cardiaci, possono essere utilizzate per studi mediante patch-clamp o analisi mediante microarray in risposta a stress patofisiologici, al fine di valutare l'eccitabilità cellulare o lo stato del trascrittoma.

Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti progettati per isolare e coltivare i cardiomiociti è che consente l'isolamento di numerose cellule simili ai melanociti cardiaci vitali. Inizialmente abbiamo avuto l'idea di questo metodo quando abbiamo scoperto una nuova popolazione cellulare nel cuore del topo e desideravamo indagarne la fisiologia. Per cominciare, preparare due serie di strumenti chirurgici sterilizzati, una per dissezionare i cuori e un'altra per tritare il tessuto.

Successivamente, preparare i supplementi per il mezzo, ma aggiungerli al mezzo di coltura solo immediatamente prima della semina delle cellule. Dopo aver preparato il filtro per il mezzo di coltura per sterilizzare la soluzione lavorando in una cappa a flusso laminare, conservare il mezzo a quattro gradi Celsius. Preparare la soluzione del DNA aggiungendo 0,05 grammi di DNA a 100 millilitri di DPBS con FBS al 10% più antibiotici.

Successivamente, preparare una soluzione di tripsina allo 0,5% aggiungendo 0,5 grammi di tripsina a 100 millilitri di DPBS contenente antibiotici. Infine, raccogliere tutta l'attrezzatura necessaria per completare la procedura, inclusi piatti di Petri, provette coniche da 50 millilitri, filtri cellulari da 40 micron, DPBS con antibiotici e piatti di coltura da 60 e da 35 millimetri. Dopo l'eutanasia di topolini neonati da P0 a P2, pulire il torace con alcol ed immergerli in un piatto P2 da 10 centimetri contenente DPBS; operando al microscopio stereoscopico, aprire con attenzione la cavità toracica ed estrarre l'intero cuore con le atria ancora attaccate.

Lavare i cuori in DPBS e trasferirli in una nuova piastra di Petri da 10 centimetri. Spostare la piastra di Petri con i cuori escissi in una cappa a flusso laminare per colture cellulari e seguire una tecnica sterile per i passaggi successivi. Per prima cosa, lavare i cuori tre volte in DPBS sterile aggiunto di antibiotici.

Posizionare i cuori in una piastra di coltura da 60 millimetri e aggiungere da sei a otto millilitri di tripsina al 0,5% in soluzione. Successivamente, tagliare i cuori in piccoli pezzi e incubarli a 37 gradi Celsius per 30 minuti. Al termine dell'incubazione, aspirare la soluzione risultante dalla piastra e trasferirla in un tubo conico sterile da 10 millilitri.

Utilizzando una pipetta sterile da 10 millilitri, rimescolare rapidamente ma delicatamente la soluzione da 30 a 50 volte, quindi filtrare la sospensione risultante attraverso un filtro cellulare da 40 micron in un nuovo tubo conico sterile da 50 millilitri. Dopo la centrifugazione, aspirare delicatamente il sopranatante e risospendere il pellet rimanente in sei-otto millilitri di DPBS sterile. Ripetere questo passaggio altre due volte.

Dopo il terzo risciacquo successivo alla centrifugazione, rimuovere con attenzione il liquido di lavaggio tramite decantazione o aspirazione e risospendere il pellet in sei millilitri di mezzo di coltura integrato. Successivamente, aspirare la soluzione risospesa in una pipetta sterile per trasferimento e posizionare le cellule in una piastra da 35 millimetri. Prelevare le cellule cardiache isolate da tre topi neonati dopo un'incubazione notturna, aspirare il mezzo di coltura insieme alle cellule non aderenti e quindi risciacquare le piastre una volta con DPBS, aggiungere mezzo fresco alle piastre e sostituire il mezzo.

Ogni due giorni, le cellule isolate da cuori neonatali o embrionali possono essere mantenute in coltura fino a tre settimane, mentre le cellule isolate da cuori adulti possono essere mantenute in coltura fino a 10 giorni. Per isolare cellule simili ai melanociti da un cuore di topo adulto, lavare innanzitutto i cuori escissi in DPBS sterile contenente antibiotici in una cappa a flusso laminare. Premere leggermente il cuore con pinze anatomiche curve per rimuovere eventuali residui di sangue, quindi risciacquare nuovamente il cuore in DPBS.

Successivamente, rimuovere le atria e l'anello atrioventricolare dai cuori e posizionare i campioni di tessuto escisso in una piastra da 35 millimetri. Tagliare i cuori in piccoli pezzi utilizzando forbici curve e pinze. Aggiungere sei-otto millilitri di soluzione di tripsina 0,5% alla piastra e incubare a 37 gradi Celsius per 45-60 minuti.

Dopo l'incubazione, ripetere i passaggi illustrati in precedenza per ottenere una sospensione di cellule cardiache adulte e piastre come prima. In questo esempio, la freccia bianca identifica il melanocita cardiaco in entrambi i pannelli. Si noti che, senza l'ausilio del marcatore fluorescente, il melanocita cardiaco è difficile da identificare e distinguere dai miociti atriali aderenti alla piastra; la punta della freccia celeste indica cellule atriali che non sono ben aderenti alla piastra, mostrate qui, un melanocita cardiaco sano isolato dal cuore di un topo neonato.

Hanno sviluppato estesi processi dendritici e assomigliano strettamente ai melanociti cutanei. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in poche ore se effettuata correttamente. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come isolare cellule melanocitarie vitali dal cuore.

Sarà adatto per l'analisi fisiologica e molecolare.